CN109913502A - 一种Cas9-gRNA表达系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种Cas9‑gRNA表达系统及其应用。本发明公开了一种构建split‑sfYFP双载体的方法，包括将基因片段sfYFP10和sfYFP11与载体相连接，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明利用含有split‑sfYFP双载体的Cas9‑gRNA表达系统只能在共同转入同一个细胞的条件下才能完成超折叠并发光的特性，可以快速、准确的对打靶效率进行判断和评价。此外，本发明公开的sfYFP10和sfYFP11编码的蛋白质的发光能力和发光强度明显强于普通YFP蛋白，且具有融合后不易丢失荧光等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种Cas9-gRNA表达系统及其应用。
背景技术
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该方法利用荧光蛋白及其突变体的特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，分别与不同目标蛋白连接。如果两个目标蛋白存在相互作用，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，根据荧光就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，有助于研究蛋白质相互作用。
GFP的一些定点突变能明显的改变其波长性质，由此产生的突变体，具有产生多色光的特性，如：66位的酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescenceprotein，CFP)，203位的苏氨酸突变为酪氨酸后成为黄色荧光蛋白(yellow fluorescenceprotein，YFP)，145位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成为蓝色荧光蛋白(blue fluorescenceprotein，BFP)。GFP、YFP、CFP和BFP都是由238个氨基酸组成的单体蛋白质，荧光的产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸自环化形成生色团的功效，而该过程大约在蛋白质形成后约4h完成。Superfolder YFP蛋白，简称sfYFP蛋白，是荧光蛋白家族的重要成员。和其他荧光蛋白相比，superfolder YFP具有更强的折叠能力和红绿都发光的特性。
CRISPR/Cas9系统是目前用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势。携带CRISPR/Cas9系统的慢病毒不仅能够感染多种难感染的细胞，比如原代细胞，干细胞，神经元细胞等，而且能够将外源基因插入细胞基因组内，实现稳定转染。但是，Cas9基因的序列大约4kbp，接近慢病毒载体所容纳的包装量，这就导致在构建含有Cas9的慢病毒载体时很难再加入完整的荧光标记或抗性标记，为后续细胞的感染和突变克隆的筛选造成了一定的困难。
发明内容
为了解决现有技术中含有Cas9的慢病毒载体很难再加入完整的荧光标记或抗性标记的难题，本发明利用双分子荧光互补系统，将CRISPR/Cas9与慢病毒载体结合，构建双载体系统，一个载体包含Cas9和sfYFP10，另一个载体包含gRNA和sfYFP11，将其共同转染动物细胞，有荧光的细胞即为打靶成功的细胞，而荧光效率则可以反映打靶效率，而且由于sfYFP的红绿均发光的特性，有利于快速、准确的对打靶效率进行评价。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明一方面公开了一种split-sfYFP双载体，包括基因片段sfYFP10和sfYFP11，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
其中，基因片段sfYFP10和sfYFP11的合成思路为：基于superfolder YFP(sfYFP)荧光蛋白，从其第214和第215氨基酸残基分离得到两个荧光蛋白片段，分析编码该荧光蛋白片段的RNA，再逆转录为DNA，接着进行人工修饰等方法，设计出基因片段sfYFP10和sfYFP11。
应该理解，本发明并不限于基因片段sfYFP10和sfYFP11，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适基因片段来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列(及本发明中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本发明的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本发明的保护范围之内。
优选的，所述基因片段sfYFP10和sfYFP11均与载体相连接。
基因载体，即gene delivery或gene vector，是作为基因导入细胞的工具。基因载体可以把目的基因送入靶细胞内，然后将目的基因释放出来，有的目的基因还可以整合到细胞核中，从而发挥目的基因的特定功能。
在本发明的一实施例中，将sfYFP10和sfYFP11分别与saCas9蛋白表达载体和sgRNA携带载体连接。
优选的，所述saCas9蛋白表达载体包括空载质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11。
优选的，所述sgRNA携带载体包括空载质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10。
应当理解，发明并不限于空载质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10和空载质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适载体来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
本发明第二个方面公开了一种基于荧光分析的试剂盒，所述试剂盒包括如上述任意一项所述的split-sfYFP双载体。
本发明第三个方面公开了一种Cas9-gRNA表达系统，包括上述的split-sfYFP双载体。
本发明第四个方面公开了上述的split-sfYFP双载体、上述的试剂盒或者上述的Cas9-gRNA表达系统在判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用技术中的应用。
本发明第五个方面公开了一种构建上述的Cas9-gRNA表达系统的方法，包括以下步骤：
S1：合成sfYFP10和sfYFP11；
S2：合成saCas9 gRNA的寡核苷酸链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
S3：将saCas9蛋白表达载体单酶切后与S2得到的寡核苷酸链连接，进行回收纯化得到第一酶切产物；
S4：将sgRNA携带载体双酶切后进行回收纯化得到第二酶切产物；
S5：将S2中得到的第一酶切产物和sfYFP10连接得到第一载体，将S3中得到的第二酶切产物和sfYFP11连接得到第二载体，即得到含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统。
优选的，在S3中，采用XbaI进行单酶切。具体的，在本发明的一个实施例中，将质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10用XbaI进行单酶切。酶切反应体系包括pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10 10μg、10×Cutsmart(NEB)5μL、XbaI2μL，用水补足至50μL。37℃下酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化。
优选的，在S4中，采用SpeI和XbaI进行双酶切。具体的，在本发明的一个实施例中，将质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11用SpeI和XbaI进行双酶切。酶切反应体系包括pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11 10μg、10×Cutsmart(NEB)5μL、SpeI和XbaI各2μL，用水补足至50μL。37℃下酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化。
应当理解，发明并不限于限制性内切酶SpeI和XbaI，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适限制性内切酶来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
本发明第五个方面公开了上述的Cas9-gRNA表达系统在快速判断Cas9打靶效率中的应用，包括以下步骤：
构建split-sfYFP双载体后将其共同转染细胞，显微镜下观察有荧光的细胞即为打靶成功的细胞。
优选的，所述细胞为293T细胞。
在本发明的一个实施例中，所述细胞为哺乳动物细胞，具体的，所述细胞为293T细胞(购买于美国ATCC细胞库)。应当理解，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的细胞种类，并且在本发明的保护范围之内。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：
本发明利用含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统只能在共同转入同一个细胞的条件下才能完成超折叠并发光的特性，可以快速、准确的对打靶效率进行判断和评价。此外，本发明公开的sfYFP10和sfYFP11编码的蛋白质的发光能力和发光强度明显强于普通YFP蛋白，且具有融合后不易丢失荧光等优点。
附图说明
图1为本发明实施例中pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-sfYFP-S10表达载体结构示意图。
图2为本发明实施例中pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-sfYFP-S11表达载体结构示意图。
图3为本发明实施例中pLenti-U6-NCsagRNA V2.0-CAG-sfYFP-S10表达载体结构示意图。
图4为本发明实施例中split-sfYFP双载体转染293T细胞效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种构建含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统的方法，包括以下步骤：
S1：合成带有酶切位点及上下游同源臂的sfYFP-S10(序列如SEQ ID NO:1所示)和sfYFP-S11(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)；
S2：将质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10用XbaI进行单酶切。50μL酶切反应体系包括：pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10 10μg、10×Cutsmart(NEB)5μL、XbaI2μL，用水补足至50μL，37℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化；
S3：将质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11用SpeI和XbaI进行双酶切。50μL酶切反应体系含pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11 10μg、10×Cutsmart(NEB)5μL、SpeI和XbaI各2μL，用水补足至50μL，37℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用刀片将大片段切下并进行回收纯化；
S4：将S2得到的纯化的酶切产物和S1的sfYFP-S10序列进行无缝克隆，将S3步得到的纯化的酶切产物和S1的sfYFP-S11合成序列进行无缝克隆，具体的，50μL反应体系分别含S2或S3酶切产物102.2ng，sfYFP-S10或sfYFP-S11 14.3ng，1μl酶，25μl buffer，用水补足至50μL，50℃反映15min后置于冰上进行转化涂板；
S5：挑取单菌落，进行质粒小提及测序鉴定。经测序，表达载体pLenti-U6-sagRNAV2.0-CAG-sfYFP-S10(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)和pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-sfYFP-S11构建成功(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，两者结合即是含有split-sfYFP双载体Cas9-gRNA表达系统，其中，表达载体pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-sfYFP-S10和pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-sfYFP-S11的结构示意图分别如图1和图2所示。
实施例2
本实施了公开了Cas9-gRNA表达系统在快速判断Cas9打靶效率中的应用，包括以下步骤：构建split-sfYFP双载体后将其共同转染细胞，显微镜下观察有荧光的细胞即为打靶成功的细胞。
详细分步步骤如下：
(1)合成saCas9 gRNA NC序列的寡核酸链(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)
首先设计针对saCas9 gRNA的NC的引物对：
NCsgRNAoligo1：5’-ACCGGCACTACCAGAGCTAACTCA-3’(SEQ ID NO:6)；
NCsgRNAoligo2：5’-AAACTGAGTTAGCTCTGGTAGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；
将上述引物对用退火buffer溶解成20μM的浓度，于95℃水浴锅中孵育5min，再开水浴锅盖子慢慢自然冷却至室温。
(2)构建含有saCas9 gRNA NC序列的表达载体
用BsmB I酶切pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-sfYFP-S10(NEBuffer3，55℃中酶切8h)，得到324bp和9kb的片段，回收9kb的载体，将退火产物与酶切回收的载体片段连接得到目的质粒，将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。
(3)挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。
(4)测序鉴定质粒构建成功，并命名为pLenti-U6-NCsagRNA V2.0-CAG-sfYFP-S10(结构示意图如图3所示)。
(5)双载体转染用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃恒温培养293T细胞(购于美国ATCC细胞库)。取对数期细胞以2.6×105/孔接种到12孔板培养。待细胞融合度达到60％～70％时更换成Opti-MEM培养基培养，1小时后将1μg Lenti-U6-NCsagRNAV2.0-CAG-sfYFP-S10载体和1μg pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-sfYFP-S11载体在Lipo 2000转染试剂的作用下，共同转染293T细胞，转染24小时后拍荧光照片，转染结果如图4所示。
本实施例利用含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统只能在共同转入同一个细胞的条件下才能完成超折叠并发光的特性，可以快速、准确的对打靶效率进行判断和评价。此外，本实施例公开的sfYFP10和sfYFP11编码的蛋白质的发光能力和发光强度明显强于普通YFP蛋白，且具有融合后不易丢失荧光的优点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 和元生物技术（上海）股份有限公司
<120> 一种Cas9-gRNA表达系统及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 60
gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaag ccaccatgag caagggcgag 120
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 180
aagttcagcg tgagaggcga gggcgagggc gatgccacca tcggcaagct gaccctgaag 240
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttcggc 300
tacggcctgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agagacacga cttcttcaag 360
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatca gcttcaagga cgacggcaag 420
tacaagaccc gcgccgtggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 480
aagggcaccg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaacttc 540
aacagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa ggccaacttc 600
accgtgcgcc acaacgtgga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 660
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag ctaccagacc 720
gtgctgagca aagaccccaa cgagaagtaa tctaga 756
<210> 2
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaatcccgg ccctactagt atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg 60
acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc 120
gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc 180
tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg 240
cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc 300
gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg 360
cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc 420
accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg 480
ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc 540
tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga 600
cccgcaagcc cggtgccgga ggcggaagcg gcggtggagg atcacgcgat cacatggtcc 660
tgcacgagta cgtgaacgcc gccgggatca cttaatctag ataaccgcgt ctgg 714
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcactacca gagctaactc a 21
<210> 4
<211> 9322
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga actacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgatgcggcc gcccccttca ccgagggcct atttcccatg 2220
attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattgg aattaatttg 2280
actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg 2340
tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga 2400
aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac cgggagacga 2460
tgcagtttaa ggtttacacc tataaaagag agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac 2520
agagtgatat tattgacacg cccgggcgac ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc 2580
tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct 2640
ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg 2700
ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa 2760
tataacgtct cagtttaagt actctgtgct ggaaacagca cagaatctac taaaacaagg 2820
caaaatgccg tgtttatctc gtcaacttgt tggcgagatt tttacgcgta ttaatagtaa 2880
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 2940
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 3000
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 3060
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 3120
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 3180
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggg tcgaggtgag 3240
ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt 3300
atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag 3360
gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 3420
atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 3480
ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc cgtgccccgc 3540
tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 3600
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa tgacggctcg 3660
tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct ttgtgcgggg 3720
gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggcccg 3780
cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcgtgt 3840
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc gggggggctg cgaggggaac 3900
aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc 3960
gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 4020
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 4080
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 4140
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 4200
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 4260
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 4320
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 4380
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 4440
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 4500
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 4560
tggcaaagaa gccaccatga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct 4620
ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgagaggcg agggcgaggg 4680
cgatgccacc atcggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt 4740
gccctggccc accctcgtga ccaccttcgg ctacggcctg cagtgcttcg cccgctaccc 4800
cgaccacatg aagagacacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga 4860
gcgcaccatc agcttcaagg acgacggcaa gtacaagacc cgcgccgtgg tgaagttcga 4920
gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcacc gacttcaagg aggacggcaa 4980
catcctgggg cacaagctgg agtacaactt caacagccac aacgtctata tcaccgccga 5040
caagcagaag aacggcatca aggccaactt caccgtgcgc cacaacgtgg aggacggcag 5100
cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct 5160
gcccgacaac cactacctga gctaccagac cgtgctgagc aaagacccca acgagaagta 5220
atctagataa ccgcgtctgg aacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 5280
ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 5340
tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 5400
tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 5460
tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 5520
ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 5580
gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc 5640
tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 5700
tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 5760
ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 5820
ccgcctcccc gcctggaatt aattctgcag tcgagaccta gaaaaacatg gagcaatcac 5880
aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg ctagaagcac aagaggagga 5940
ggaggtgggt ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 6000
ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa agaggggact ggaagggcta attcactccc 6060
aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt 6120
agcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga tggtgctaca 6180
agctagtacc agttgagcca gataaggtag aagaggccaa taaaggagag aacaccagct 6240
tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagtg ttagagtgga 6300
ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg gagtacttca 6360
agaactgctg atatcgagct tgctacaagg gactttccgc tggggacttt ccagggaggc 6420
gtggcctggg cgggactggg gagtggcgag ccctcagatc ctgcatataa gcagctgctt 6480
tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 6540
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt 6600
gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg 6660
aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag 6720
aaatgaatat cagagagtga gaggccttga cattgctagc gttttaccgt cgacctctag 6780
ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 6840
aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 6900
gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 6960
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 7020
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 7080
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 7140
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 7200
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 7260
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 7320
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 7380
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 7440
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 7500
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 7560
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 7620
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 7680
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 7740
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 7800
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 7860
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 7920
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 7980
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 8040
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 8100
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 8160
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 8220
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 8280
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 8340
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 8400
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 8460
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 8520
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 8580
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 8640
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 8700
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 8760
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 8820
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 8880
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 8940
agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga tcaacttgtt tattgcagct tataatggtt 9000
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 9060
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcaac tggataactc 9120
aagctaacca aaatcatccc aaacttccca ccccataccc tattaccact gccaattacc 9180
tagtggtttc atttactcta aacctgtgat tcctctgaat tattttcatt ttaaagaaat 9240
tgtatttgtt aaatatgtac tacaaactta gtagttttta aagaaattgt atttgttaaa 9300
tatgtactac aaacttagta gt 9322
<210> 5
<211> 10902
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga actacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgatgcggcc gcccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 2220
ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 2280
atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 2340
gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 2400
gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact 2460
tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 2520
accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 2580
gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac 2640
tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 2700
gctcgtttag tgaaccgtca gatcgaattc gccaccatgg ccccaaagaa gaagcggaag 2760
gtcggtatcc acggagtccc agcagccaag cggaactaca tcctgggcct ggacatcggc 2820
atcaccagcg tgggctacgg catcatcgac tacgagacac gggacgtgat cgatgccggc 2880
gtgcggctgt tcaaagaggc caacgtggaa aacaacgagg gcaggcggag caagagaggc 2940
gccagaaggc tgaagcggcg gaggcggcat agaatccaga gagtgaagaa gctgctgttc 3000
gactacaacc tgctgaccga ccacagcgag ctgagcggca tcaaccccta cgaggccaga 3060
gtgaagggcc tgagccagaa gctgagcgag gaagagttct ctgccgccct gctgcacctg 3120
gccaagagaa gaggcgtgca caacgtgaac gaggtggaag aggacaccgg caacgagctg 3180
tccaccaaag agcagatcag ccggaacagc aaggccctgg aagagaaata cgtggccgaa 3240
ctgcagctgg aacggctgaa gaaagacggc gaagtgcggg gcagcatcaa cagattcaag 3300
accagcgact acgtgaaaga agccaaacag ctgctgaagg tgcagaaggc ctaccaccag 3360
ctggaccaga gcttcatcga cacctacatc gacctgctgg aaacccggcg gacctactat 3420
gagggacctg gcgagggcag ccccttcggc tggaaggaca tcaaagaatg gtacgagatg 3480
ctgatgggcc actgcaccta cttccccgag gaactgcgga gcgtgaagta cgcctacaac 3540
gccgacctgt acaacgccct gaacgacctg aacaatctcg tgatcaccag ggacgagaac 3600
gagaagctgg aatattacga gaagttccag atcatcgaga acgtgttcaa gcagaagaag 3660
aagcccaccc tgaagcagat cgccaaagaa atcctcgtga acgaagagga tattaagggc 3720
tacagagtga ccagcaccgg caagcccgag ttcaccaacc tgaaggtgta ccacgacatc 3780
aaggacatta ccgcccggaa agagattatt gagaacgccg agctgctgga tcagattgcc 3840
aagatcctga ccatctacca gagcagcgag gacatccagg aagaactgac caatctgaac 3900
tccgagctga cccaggaaga gatcgagcag atctctaatc tgaagggcta taccggcacc 3960
cacaacctga gcctgaaggc catcaacctg atcctggacg agctgtggca caccaacgac 4020
aaccagatcg ctatcttcaa ccggctgaag ctggtgccca agaaggtgga cctgtcccag 4080
cagaaagaga tccccaccac cctggtggac gacttcatcc tgagccccgt cgtgaagaga 4140
agcttcatcc agagcatcaa agtgatcaac gccatcatca agaagtacgg cctgcccaac 4200
gacatcatta tcgagctggc ccgcgagaag aactccaagg acgcccagaa aatgatcaac 4260
gagatgcaga agcggaaccg gcagaccaac gagcggatcg aggaaatcat ccggaccacc 4320
ggcaaagaga acgccaagta cctgatcgag aagatcaagc tgcacgacat gcaggaaggc 4380
aagtgcctgt acagcctgga agccatccct ctggaagatc tgctgaacaa ccccttcaac 4440
tatgaggtgg accacatcat ccccagaagc gtgtccttcg acaacagctt caacaacaag 4500
gtgctcgtga agcaggaaga aaacagcaag aagggcaacc ggaccccatt ccagtacctg 4560
agcagcagcg acagcaagat cagctacgaa accttcaaga agcacatcct gaatctggcc 4620
aagggcaagg gcagaatcag caagaccaag aaagagtatc tgctggaaga acgggacatc 4680
aacaggttct ccgtgcagaa agacttcatc aaccggaacc tggtggatac cagatacgcc 4740
accagaggcc tgatgaacct gctgcggagc tacttcagag tgaacaacct ggacgtgaaa 4800
gtgaagtcca tcaatggcgg cttcaccagc tttctgcggc ggaagtggaa gtttaagaaa 4860
gagcggaaca aggggtacaa gcaccacgcc gaggacgccc tgatcattgc caacgccgat 4920
ttcatcttca aagagtggaa gaaactggac aaggccaaaa aagtgatgga aaaccagatg 4980
ttcgaggaaa agcaggccga gagcatgccc gagatcgaaa ccgagcagga gtacaaagag 5040
atcttcatca ccccccacca gatcaagcac attaaggact tcaaggacta caagtacagc 5100
caccgggtgg acaagaagcc taatagagag ctgattaacg acaccctgta ctccacccgg 5160
aaggacgaca agggcaacac cctgatcgtg aacaatctga acggcctgta cgacaaggac 5220
aatgacaagc tgaaaaagct gatcaacaag agccccgaaa agctgctgat gtaccaccac 5280
gacccccaga cctaccagaa actgaagctg attatggaac agtacggcga cgagaagaat 5340
cccctgtaca agtactacga ggaaaccggg aactacctga ccaagtactc caaaaaggac 5400
aacggccccg tgatcaagaa gattaagtat tacggcaaca aactgaacgc ccatctggac 5460
atcaccgacg actaccccaa cagcagaaac aaggtcgtga agctgtccct gaagccctac 5520
agattcgacg tgtacctgga caatggcgtg tacaagttcg tgaccgtgaa gaatctggat 5580
gtgatcaaaa aagaaaacta ctacgaagtg aatagcaagt gctatgagga agctaagaag 5640
ctgaagaaga tcagcaacca ggccgagttt atcgcctcct tctacaacaa cgatctgatc 5700
aagatcaacg gcgagctgta tagagtgatc ggcgtgaaca acgacctgct gaaccggatc 5760
gaagtgaaca tgatcgacat cacctaccgc gagtacctgg aaaacatgaa cgacaagagg 5820
ccccccagga tcattaagac aatcgcctcc aagacccaga gcattaagaa gtacagcaca 5880
gacattctgg gcaacctgta tgaagtgaaa tctaagaagc accctcagat catcaaaaag 5940
ggcaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggatcctac 6000
ccatacgatg ttccagatta cgctagcggc ttcgccaacg agcttggacc caggttgatg 6060
ggaaaggagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 6120
actagtatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg 6180
gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat 6240
ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg 6300
ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg 6360
ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg 6420
agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc 6480
aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt 6540
ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc 6600
ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc 6660
accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt 6720
gccggaggcg gaagcggcgg tggaggatca cgcgatcaca tggtcctgca cgagtacgtg 6780
aacgccgccg ggatcactta atctagataa ccgcgtctgg aacaatcaac ctctggatta 6840
caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 6900
atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc 6960
ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 7020
acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 7080
cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 7140
catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 7200
cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 7260
gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 7320
ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 7380
gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt aattctgcag tcgagaccta 7440
gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg 7500
ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt ttttccagtc acacctcagg tacctttaag 7560
accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa agaggggact 7620
ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac 7680
acaaggctac ttccctgatt agcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact 7740
gacctttgga tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataaggtag aagaggccaa 7800
taaaggagag aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga 7860
gagagaagtg ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga 7920
gctgcatccg gagtacttca agaactgctg atatcgagct tgctacaagg gactttccgc 7980
tggggacttt ccagggaggc gtggcctggg cgggactggg gagtggcgag ccctcagatc 8040
ctgcatataa gcagctgctt tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 8100
cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 8160
gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 8220
gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 8280
agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggccttga cattgctagc 8340
gttttaccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 8400
tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 8460
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 8520
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 8580
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 8640
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 8700
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 8760
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 8820
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 8880
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 8940
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 9000
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 9060
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 9120
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 9180
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 9240
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 9300
caaaccaccg ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 9360
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 9420
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 9480
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 9540
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 9600
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 9660
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 9720
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 9780
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 9840
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 9900
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 9960
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 10020
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 10080
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 10140
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 10200
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 10260
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 10320
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 10380
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 10440
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 10500
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga tcaacttgtt 10560
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 10620
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 10680
ctggatcaac tggataactc aagctaacca aaatcatccc aaacttccca ccccataccc 10740
tattaccact gccaattacc tagtggtttc atttactcta aacctgtgat tcctctgaat 10800
tattttcatt ttaaagaaat tgtatttgtt aaatatgtac tacaaactta gtagttttta 10860
aagaaattgt atttgttaaa tatgtactac aaacttagta gt 10902
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accggcacta ccagagctaa ctca 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaactgagtt agctctggta gtgc 24
Claims (13)
1.一种split-sfYFP双载体，其特征在于，包括基因片段sfYFP10和sfYFP11，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述基因片段sfYFP10和sfYFP11均与载体相连接。
3.根据权利要求2所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，将sfYFP10和sfYFP11分别与saCas9蛋白表达载体和sgRNA携带载体连接。
4.根据权利要求3所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述saCas9蛋白表达载体包括空载质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11。
5.根据权利要求3所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述sgRNA携带载体包括空载质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10。
6.基于荧光分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任意一项所述的split-sfYFP双载体。
7.一种Cas9-gRNA表达系统，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述的split-sfYFP双载体。
8.根据权利要求1-5任意一项所述的split-sfYFP双载体、权利要求6所述的试剂盒或者权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统在判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用技术中的应用。
9.一种构建权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：合成sfYFP10和sfYFP11；
S2：合成saCas9 gRNA的寡核苷酸链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
S3：将saCas9蛋白表达载体单酶切后与S2得到的寡核苷酸链连接，进行回收纯化得到第一酶切产物；
S4：将sgRNA携带载体双酶切后进行回收纯化得到第二酶切产物；
S5：将S2中得到的第一酶切产物和sfYFP10连接得到第一载体，将S3中得到的第二酶切产物和sfYFP11连接得到第二载体，即得到含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在S3中，采用XbaI进行单酶切。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在S4中，采用SpeI和XbaI进行双酶切。
12.根据权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统在快速判断Cas9打靶效率中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
构建split-sfYFP双载体后将其共同转染细胞，显微镜下观察有荧光的细胞即为打靶成功的细胞。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述细胞为293T细胞。
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