CN113846146B - 一种重叠环介导等温核酸扩增技术 - Google Patents

一种重叠环介导等温核酸扩增技术 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。具体技术方案包括：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物为重叠引物，所述重叠引物包括正向引物F和反向引物R，正向引物F的右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。本发明提供了一种新的LAMP引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。

Description

一种重叠环介导等温核酸扩增技术
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。
背景技术
环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新的恒温核酸扩增方法，具体为针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶等温(65℃左右)保温一段时间，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高的特点。
但由于LAMP扩增用的引物比较多，因此很难在同一个反应体系中进行双基因乃至多基因检测。目前虽然存在可以在同一反应体系中进行多基因检测的探针法，但该方法使用引物较多，体系相对繁琐复杂，引物设计难度高，反应干扰比较大，应用前景不理想。
因此，如果能提供一种引物设计简单、反应结果清晰的LAMP多基因检测方法，将具有重要的学术价值和商业价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种重叠环介导等温核酸扩增技术。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物包括：（1）上游基因LAMP的正向引物F，（2）下游基因LAMP的反向引物R，（3）上游基因和下游基因的重叠引物，（4）中间基因与上游基因反应的反向LAMP引物，（5）中间基因与下游基因反应的正向LAMP引物，（6）相邻两条基因接头处的重叠引物。
优选的，各所述重叠引物分别包括正向引物F和反向引物R，正向引物F右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。
相应的，所述扩增引物在2个及以上基因检测中的应用。
优选的，所述应用方法包括：以FIP、BIP为内引物，所述重叠引物为叠加引物，以F3、B3为外引物对基因进行扩增。
优选的，所述方法的反应体系包括：1mM dNTPs、2.5μL 10×Bst Buffer、8U BstDNA聚合酶、2μL待检测基因、外引物各0.2μM、内引物各1.2μM、重叠引物各0.2μM,ddH2O补齐至25μL。
优选的，反应条件为：65℃、60min。
优选的，所述反应发生在液体中或固体表面。
优选的，扩增对象为DNA和/或RNA。
优选的，所述应用为在检测病原体病毒、病原体细菌、病原体真菌、衣原体中的应用。
相应的，利用所述扩增引物制备的检测用试剂、试纸、试剂盒。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的LAMP引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。
本发明提供的方法可以用于检测冠状病毒、HIV、乙肝、丙肝、流感、脑膜炎等病毒性疾病的病原体病毒、细菌性疾病的病原体细菌、病原体真菌、治病衣原体等，从而可用于肿瘤的诊断、肿瘤的分型恶性程度的鉴定；以及其它人体/动物/植物疾病的诊断和食品卫生的监测。
附图说明
图1为MS2引物设计示意图；
图2为实施例一核酸电泳反应结果示意图；
图3为SGIV引物设计示意图；
图4为MS2-SGIV重叠引物设计示意图；
图5为CCHFV引物设计示意图；
图6为实施例二核酸电泳反应结果示意图；
图7为HCV引物设计示意图；
图8为CCHFV-HCV重叠引物设计示意图；
图9为多基因设计原理示意图；
图10为实施例三核酸电泳反应结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种重叠环介导等温核酸扩增检测方法，具体包括如下步骤：
1、设计重叠环介导等温核酸扩增引物。设计原理如图9所示。具体的，多基因检测的扩增引物包括：上游基因LAMP的正向引物F、下游基因LAMP的反向引物R，及上游基因和下游基因的两条重叠引物，中间基因需要设计与上游基因反应的反向LAMP引物，以及和下游基因反应的正向LAMP引物，相邻两条基因接头处设计重叠引物。
各所述重叠引物包括正向引物F和反向引物R，正向引物F右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R具有互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F具有互补的特定序列，重叠引物任意一条或者多条同时含有上下游DNA的序列不少于15bp。各引物可以使用引物设计程序例如PrimerExplorer进行设计。
通过设计特异性的重叠引物，使多基因能够进行重叠环介导等温核酸扩增的反应。
2、设计重叠环介导等温核酸扩增的扩增体系及方法。具体方法为：以FIP（ForwardInner Primer,上游内部引物）、BIP（Backward Inner Primer,下游内部引物）为内引物，重叠引物为叠加引物，以F3（Forward Outer Primer，上游外部引物）、B3（Backward OuterPrimer，下游外部引物）为外引物对双基因进行恒温扩增。其反应体系为：1mM dNTPs（三磷酸脱氧核糖核苷酸），2.5μL 10×Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，2μL待检测基因，外引物各0.2μM，内引物各1.2μM，重叠引物各0.2μM,ddH2O补齐至25μL。将上述所有试剂混匀置于PCR管中，65℃、60min。
通过反应体系的设计使重叠环介导等温核酸扩增能将目的DNA或者RNA分子大量复制或先经过逆转录后大量复制，产生的扩增产物具有多重重复序列的DNA。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：设计重叠引物并扩增MS2-SGIV特异性基因效果展示
1、设计引物检测MS2特异性基因。MS2基因序列如SEQ ID NO.1所示，设计MS2引物如图1所示，引物序列具体如表1所示，反应体系如表2所示。
表1 环介导等温核酸扩增MS2引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2 反应体系
Figure 588776DEST_PATH_IMAGE002
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图1（1～4）所示。图2中，M为DL2000 DNA marker，1、2为MS2反应胶图，LAMP正常反应，3、4为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
2、设计引物检测SGIV特异性基因。SGIV基因序列如SEQ ID NO.2所示，设计SGIV引物如图3所示，引物序列具体如表3所示，反应体系如表4所示。
表3 环介导等温核酸扩增SGIV引物序列
Figure 104334DEST_PATH_IMAGE004
表4 反应体系
Figure 937423DEST_PATH_IMAGE006
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（5～8）所示。图2中，M为DL2000 DNA marker，5、6为SGIV反应胶图，LAMP正常反应，7、8为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
3、设计重叠引物并扩增检测MS2-SGIV双基因。按上述方法设计MS2-SGIV重叠引物，如图4所示。引物序列具体如表5所示，反应体系如表6所示。
表5 重叠环介导等温核酸扩增MS2-SGIV引物序列
Figure 208129DEST_PATH_IMAGE008
表6 反应体系
Figure 640684DEST_PATH_IMAGE010
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（9～12）所示。图2中，M为DL2000 DNA marker，9、10为双基因反应胶图，LAMP正常反应，11、12为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
4、在缺少重叠引物的情况下检测MS2-SGIV双基因。模板序列分别使用本实施例步骤1、2的序列，具体如表7所示，反应体系如表8所示。
表7 环介导等温核酸扩增MS2-SGIV引物序列
Figure 382769DEST_PATH_IMAGE012
表8 反应体系
Figure 273627DEST_PATH_IMAGE014
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（13～16）所示。图2中，M为DL2000 DNA marker，13、14为双基因反应胶图，LAMP没有反应，15、16为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
5、用步骤3中（重叠环介导等温核酸扩增MS2-SGIV引物序列）MS2的反向引物和SGIV的正向引物，在重叠引物下进行MS2-SGIV双基因检测。具体引物如表9所示，反应体系如表10所示。
表9 MS2的反向引物和SGIV的正向引物
Figure 43451DEST_PATH_IMAGE016
表10 反应体系
Figure 347656DEST_PATH_IMAGE018
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（17～20）所示。图2中，M为DL2000 DNA marker，17、18为双基因反应胶图，LAMP没有反应，19、20为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
实施例二：设计重叠引物并扩增CCHFV-HCV特异性基因效果展示
1、设计引物检测CCHFV特异性基因。CCHFV基因序列如SEQ ID NO.3所示，设计CCHFV引物如图5所示，引物序列具体如表11所示，反应体系如表12所示。
表11 环介导等温核酸扩增CCHFV引物序列
Figure 205015DEST_PATH_IMAGE020
表12 反应体系
Figure 481538DEST_PATH_IMAGE022
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（1～4）所示。图6中，M为DL2000 DNA marker，1、2为CCHFV反应胶图，LAMP正常反应，3、4为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
2、设计引物检测HCV特异性基因。HCV基因序列如SEQ ID NO.4所示，设计HCV引物如图7所示，引物序列具体如表13所示，反应体系如表14所示。
表13 环介导等温核酸扩增HCV引物序列
Figure 942650DEST_PATH_IMAGE024
表14 反应体系
Figure 978825DEST_PATH_IMAGE026
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（5～8）所示。图6中，M为DL2000 DNA marker，5、6为HCV反应胶图，LAMP正常反应，7、8为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
3、设计重叠引物并扩增检测CCHFV-HCV双基因。按上述方法设计CCHFV-HCV重叠引物，如图8所示。引物序列具体如表15所示，反应体系如表16所示。
表15 重叠环介导等温核酸扩增CCHFV-HCV引物序列
Figure 15837DEST_PATH_IMAGE028
表16 反应体系
Figure 146867DEST_PATH_IMAGE030
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（9～12）所示。图6中，M为DL2000 DNA marker，9、10为双基因反应胶图，LAMP正常反应，11、12为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
4、在缺少重叠引物的情况下检测CCHFV-HCV双基因。模板序列分别使用本实施例步骤1、2的序列，具体如表17所示，反应体系如表18所示。
表17 环介导等温核酸扩增MS2-SGIV引物序列
Figure 602381DEST_PATH_IMAGE032
表18 反应体系
Figure 287702DEST_PATH_IMAGE034
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（13～16）所示。图6中，M为DL2000 DNA marker，13、14为双基因反应胶图，LAMP没有反应，15、16为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
实施例三：设计重叠引物扩增MS2-HCV-SGIV特异性基因效果展示
1、按照实施例一、二步骤3分别设计双基因MS2-HCV和双基因HCV-SGIV重叠引物，按照多基因设计原理设计LAMP引物；具体如图9所示。引物序列具体如表19所示，反应体系如表20所示。
表19 重叠环介导等温核酸扩增MS2-HCV-SGIV引物序列
Figure 549182DEST_PATH_IMAGE036
表20 反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE038
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图10（1～4）所示。图10中，M为DL2000 DNA marker，1、2为三基因反应胶图，LAMP正常反应，3、4为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
2、在缺少HCV模板的情况下检测MS2、HCV、SGIV三基因。模板序列分别使用本实施例步骤1的序列，具体如表21所示，反应体系如表22所示。
表21 环介导等温核酸扩增MS2-,HCV,SGIV引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE040
表22 反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE042
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图10（5～8）所示。图10中，M为DL2000 DNA marker，5、6为三基因反应胶图，LAMP没有反应，7、8为阴性对照，用只加PUC19质粒DNA为阴性对照。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海众启生物科技有限公司
上海先赛生物科技有限公司
<120> 一种重叠环介导等温核酸扩增技术
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 424
<212> DNA
<213> MS2
<400> 1
aggttctggt aatgacgagg cgacccgtcg taccttagct atcgctaagc tacgggaggc 60
gaatggtgat cgcggtcaga taaatagaga aggtttctta catgacaaat ccttgtcatg 120
ggatccggat gttttacaaa ccagcatccg tagccttatt ggcaacctcc tctctggcta 180
ccgatcgtcg ttgtttgggc aatgcacgtt ctccaacggt gctcctatgg ggcacaagtt 240
gcaggatgca gcgccttaca agaagttcgc tgaacaagca accgttaccc cccgcgctct 300
gagagcggct ctattggtcc gagaccaatg tgcgccgtgg atcagacacg cggtccgcta 360
taacgagtca tatgaattta ggctcgttgt agggaacgga gtgtttacag ttccgaagaa 420
taat 424
<210> 2
<211> 426
<212> DNA
<213> SGIV
<400> 2
atgtatagag gattttcttt aaaacttcca aacaattatc ggtcgggcca agtgacgacc 60
gaacaccggc taccagcatc caattctcac gcaagatggc ccgtagaagt cagtttctat 120
tctgcggttt tgcacgttcc agcaaaacat cagcacaagt ttcctcccgt tttagaactc 180
aaactccaca atatgactac gggttcgatg gctgcgcatc gcggttcggg tcatcatttt 240
acgtttatgt ttcatgcgca atcgtctcct acagaggccg tatattcgtg cgtgcccgta 300
ccgatagttt tttccgacta tcaatcaaac gtcatcgcct cggtagacat gggcgaacac 360
gatactgcag aaaaactcca tttttacggg tctatacgaa actgcgacaa cgggtgtaca 420
tattag 426
<210> 3
<211> 1449
<212> DNA
<213> CCHFV
<400> 3
atggaaaaca agatcgaggt gaataacaaa gatgagatga acaggtggtt tgaagagttc 60
aaaaaaggaa atggacttgt ggacaccttc acaaactcct attccttttg cgagagtgtt 120
cccaatttgg acaggtttgt gtttcagatg gccagtgcca ccgatgatgc acagaaggac 180
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gcatgggtta gctccactgg cattgtaaaa aagggacttg aatggttcga gaaaaatgca 300
ggaaccatta agtcctggga tgaaagttat actgagctaa aggtcgacgt cccgaaaata 360
gagcagctta ccggttacca acaagctgcc ttgaagtgga gaaaagacat aggtttccgt 420
gtcaatgcca acacagcagc tctgagcaac aaagtcctcg cagaatacaa agtccctggt 480
gagattgtga tgtctgtcaa agagatgctg tcagacatga ttaggagaag gaacctgatt 540
ctaaacaggg gtggtgatga gaacccacgt ggcccagtga gccatgagca tgtagactgg 600
tgcagggagt ttgtcaaagg caaatacatc atggccttca acccaccatg gggggacatc 660
aacaagtcag gccgttcagg aatagcactt gttgcaacag gccttgctaa gcttgcagag 720
actgaaggaa agggaatatt tgatgaagcc aaaaagactg tggaggccct caacgggtat 780
ctggacaagc ataaggacga agttgataga gcaagcgccg acagcatgat aacaaacctt 840
cttaagcata ttgccaaggc acaggagctc tataaaaatt catctgcact tcgtgcacaa 900
agcgcacaga ttgacactgc tttcagctca tactattggc tttacaaggc tggcgtgact 960
cctgaaacct tcccgacggt gtcacagttc ctctttgagc tagggaaaca gccaagaggt 1020
accaagaaaa tgaagaaggc tcttctgagc accccaatga agtgggggaa gaagctttat 1080
gagctctttg ccgatgattc tttccagcag aacaggattt acatgcatcc tgccgtgctt 1140
acagctggta gaatcagtga aatgggagtc tgctttggga caatccctgt ggccaatcct 1200
gatgatgctg cccaaggatc tggacacact aagtctattc tcaacctccg taccaacact 1260
gagaccaata atccgtgtgc caaaaccatc gtcaagctat ttgaagttca aaaaacaggg 1320
ttcaacattc aggacatgga catagtggcc tctgagcact tgctacacca atcccttgtt 1380
ggcaagcaat ccccattcca gaacgcctac aacgtcaagg gcaatgccac cagtgctaac 1440
atcatttaa 1449
<210> 4
<211> 234
<212> DNA
<213> HCV
<400> 4
acccaacact actcggctag cagtcttgcg ggggcacgcc caaatctcca ggcattgagc 60
gggtttatcc aagaaaggac ccggtcgtcc tggcaattcc ggtgtactca ccggttccgc 120
agaccactat ggctctcccg ggaggggggg tcctggaggc tgcacgacac tcatactaac 180
gccatggcta gacgctttct gcgtgaagac agtagttcct cacaggggag tgat 234

Claims (6)

1.一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，其特征在于：当针对双基因检测时，所述扩增引物包括：（1）上游基因LAMP的正向引物F，（2）下游基因LAMP的反向引物R，（3）上游基因和下游基因的重叠引物；当针对三基因检测时，所述扩增引物包括：（1）上游基因LAMP的正向引物F，（2）下游基因LAMP的反向引物R，（4）中间基因与上游基因反应的反向LAMP引物，（5）中间基因与下游基因反应的正向LAMP引物，（6）相邻两条基因接头处的重叠引物。
2.根据权利要求1所述扩增引物，其特征在于：各所述重叠引物分别包括正向引物F’和反向引物R’，正向引物F’右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R’互补的序列，反向引物R’左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F’互补的序列。
3.权利要求1或2所述扩增引物在2个及以上基因检测中的非诊断且非治疗性的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述扩增引物的扩增对象为DNA和/或RNA。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用为在检测病原体病毒、病原体细菌、病原体真菌、衣原体中的应用。
6.利用权利要求1或2所述扩增引物制备的检测用试剂、试纸、试剂盒。
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US6316229B1 (en) * 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
US10072288B2 (en) * 2013-11-11 2018-09-11 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe
US10364458B2 (en) * 2014-07-16 2019-07-30 Tangen Biosciences, Inc. Isothermal methods for amplifying nucleic acid samples
ITUB20159332A1 (it) * 2015-12-22 2017-06-22 Diasorin S P A Procedimento di rivelazione in fluorescenza dell?amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di un acido nucleico bersaglio, relativi oligonucleotidi e kit.
GB201809449D0 (en) * 2018-06-08 2018-07-25 Imperial Innovations Ltd Method for detecting a single nucleotide polymorphism(SNP)
CN109207559B (zh) * 2018-11-19 2022-04-05 罗迪贤 一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法
CN112359138A (zh) * 2020-11-03 2021-02-12 西安交通大学 基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测sars-cov-2的试剂盒

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