CN113073149A - 一种基于lfd-rma法检测人腺病毒的引物探针组 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD‑RMA法检测人腺病毒的引物探针组，包括检测人腺病毒的引物对及对应的探针，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第31个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3‑spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。本发明所述试剂盒具有操作简单、灵敏度高、特异性强、与其他病原体无交叉反应、检测速度快等特点，为人腺病毒感染的早期诊断提供了可靠的实验依据。
Description
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组。
背景技术
人腺病毒(adenovirus，ADV)是一种无外壳的双链DNA病毒，腺病毒感染可导致多种临床表现和疾病，包括呼吸道疾病(如普通感冒、支气管炎、肺炎等)、消化道疾病(如腹泻、胃肠炎等)、眼结膜炎、膀胱炎和神经系统疾病等。各年龄段人群均可感染人腺病毒，免疫系统较弱或慢性呼吸系统疾病、心脏病等患者感染后引发严重疾病的风险较高。且ADV也是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一。人腺病毒传染性较强，常可引起暴发流行，因此快速、准确的检测技术对预防和控制腺病毒的传播有重要意义。
目前ADV的检测有病毒分离、血清学检测、分子生物学等方法。病毒分离和血清学检测操作繁琐、耗时长，且在病毒载量较低时，易造成漏检；分子生物学方法主要为荧光定量PCR法，需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制。而重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37-42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现ADV的快速检测。
本发明采用LFD-RMA法建立快速检测人腺病毒的方法，为人腺病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，包括检测人腺病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
ADV-F：
5’-TAAGGCTAATGGCAATGGCGCAGGTGATAATGG-3’；
ADV-R：
5’-[Biotin]GGTTGTCAGATATTTCCACGTTGGTGGGGTTGT-3’；
ADV-P：
5’-[FAM]AGAAATTTCCTTTACTCCAATATTGCACTA[dSpacer]ACCTGCCAGACAAGCT[C3-spacer]-3’。
优选的，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第31个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。
优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、重组酶、UvsY蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸内切酶IV。
优选的，所述重组酶是来自大肠杆菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换；所述UvsY蛋白是一种辅助蛋白，可以协助或增强重组酶活性，是来自T4或T6噬菌体等的重组蛋白；所述单链结合蛋白为来自大肠杆菌或T4噬菌体的GP32蛋白，可以局部结合被替换出来的同源DNA单链，避免其被核酸酶降解；所述DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有链置换活性，但不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应；所述核酸内切酶IV可以识别并切割探针上的脱碱基位点(dSpacer)，产生新的羟基末端。
优选的，所述缓冲液包括下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。
优选的，所述标准阳性质粒为含有ADV基因片段的重组质粒，用于ADV核酸检测的阳性对照。
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
优选的，所述试剂盒可以检测的样品为咽拭子、鼻咽拭子。
一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)设计用于ADV检测的引物对及探针；
(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有ADV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有ADV。
有益效果：(1)操作简便，检测时间短，RMA扩增反应只需在30-42℃下30min内即可完成，可用于人腺病毒感染的快速诊断；
(2)将RMA和LFD技术相结合，既可以实现人腺病毒核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，适用于现场检测及大规模的筛选；
(3)闭管检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1LFD-RMA法检测ADV的灵敏性试验；
图2LFD-RMA法检测ADV的特异性试验。
图中序号代表：1：1×105copies/μL；2：1×104copies/μL；3：1×103copies/μL；4：1×102copies/μL；5：1×101copies/μL。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取ADV的核酸作为模板，对ADV的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。
2、RMA引物与探针的设计
根据ADV的hexon基因设计了特异性RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
3、RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本核酸加入到含有引物探针酶的冻干粉的恒温扩增反应管中，混匀。最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀。将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。
其中，所述恒温扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸内切酶IV；
所述重组酶是来自大肠杆菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换；所述UvsY蛋白是一种辅助蛋白，可以协助或增强重组酶活性，是来自T4或T6噬菌体等的重组蛋白；所述单链结合蛋白为来自大肠杆菌或T4噬菌体的GP32蛋白，可以局部结合被替换出来的同源DNA单链，避免其被核酸酶降解；所述DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有链置换活性，但不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应；所述核酸内切酶IV可以识别并切割探针上的脱碱基位点(dSpacer)，产生新的羟基末端；
所述缓冲液含有Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL；
所述标准阳性质粒为含有ADV基因片段的重组质粒，用于ADV核酸检测的阳性对照；
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
4、侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读
在RMA扩增结束后，将反应管放到含有侧流层析试纸条的一次性核酸检测装置中，5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(C)和检测线(T)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
5、LFD-RMA法检测ADV的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/mL)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行LFD-RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，LFD-RMA检测方法的最低检测限为1×103copies/mL。即，LFD-RMA法检测试剂盒的灵敏度达到1×103copies/mL。
6、LFD-RMA法检测ADV的特异性分析
为了检验LFD-RMA检测方法的特异性，选择ADV、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)等病原体核酸样本，用LFD-RMA方法进行检测，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，只有ADV阳性模板呈现质控线(C)和检测线(T)两条线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线(C)一条线，检测结果是阴性。该结果表明所建立的LFD-RMA检测方法具有良好的特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人腺病毒(adenovirus)
<400> 1
taaggctaat ggcaatggcg caggtgataa tgg 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人腺病毒(adenovirus)
<400> 2
ggttgtcaga tatttccacg ttggtggggt tgt 33
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人腺病毒(adenovirus)
<400> 3
agaaatttcc tttactccaa tattgcacta tacctgccag acaagct 47
Claims (10)
1.一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测人腺病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
ADV-F：
5’-TAAGGCTAATGGCAATGGCGCAGGTGATAATGG-3’；
ADV-R：
5’-[Biotin]GGTTGTCAGATATTTCCACGTTGGTGGGGTTGT-3’；
ADV-P：
5’-[FAM]AGAAATTTCCTTTACTCCAATATTGCACTA[dSpacer]ACCTGCCAGACAAGCT[C3-spacer]-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5’端用Biotin标记；探针的5’端用FAM标记，第31个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
3.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。
4.如权利要求3所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、重组酶、UvsY蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸内切酶IV。
5.如权利要求4所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述重组酶是来自大肠杆菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换；所述UvsY蛋白是一种辅助蛋白，可以协助或增强重组酶活性，是来自T4或T6噬菌体等的重组蛋白；所述单链结合蛋白为来自大肠杆菌或T4噬菌体的GP32蛋白，可以局部结合被替换出来的同源DNA单链，避免其被核酸酶降解；所述DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有链置换活性，但不耐高温，因此非常适合在常温恒温条件下反应；所述核酸内切酶IV可以识别并切割探针上的脱碱基位点(dSpacer)，产生新的羟基末端。
6.如权利要求5所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
7.如权利要求6所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/μL。
8.如权利要求7所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为含有ADV基因片段的重组质粒，用于ADV核酸检测的阳性对照。
9.如权利要求8所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应，所述试剂盒可以检测的样品为咽拭子、鼻咽拭子。
10.如权利要求9所述的一种基于LFD-RMA法检测人腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本的DNA；
(2)设计用于ADV检测的引物对及探针；
(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
(4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有ADV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有ADV。
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| CN202110452444.9A CN113073149A (zh) | 2021-04-26 | 2021-04-26 | 一种基于lfd-rma法检测人腺病毒的引物探针组 |
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2021
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