CN112063761A - 一种基于lfd-rma技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD‑RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、测流层析检测试剂、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。本发明的RMA结合侧流层析技术检测新型冠状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的新型冠状病毒的快速筛查检测。
Description
技术领域
本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎，是指由于新型冠状病毒感染所导致的肺炎。新型冠状病毒是一种RNA病毒，这种病毒传染性极强，人群普遍易感，且潜伏期比较长。
为了阻止新型冠状病毒传播范围的不断扩大，使新冠肺炎疫情得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。目前对新型冠状病毒核酸检测的方法主要为实时荧光定量PCR法，但是常规的PCR检测需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、较长的检出时间以及专业的技术人员进行操作。
重组酶介导扩增技术(RMA)是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA技术可以与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被核酸外切酶III识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。
本发明采用LFD-RMA技术建立快速检测新型冠状病毒的方法，为新冠病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，
上游引物序列ORF1ab-F为：
5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；
下游引物序列ORF1ab-R为：
5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；
探针序列ORF1ab-P为：
5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。
优选的，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。
优选的，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。
优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。
优选的，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：
| 试剂 | 终浓度 |
| Tris | 50mM |
| 醋酸镁 | 100mM |
| 聚环氧乙烷 | 10％(w/v) |
| 海藻糖 | 2mM |
| 甘露醇 | 2.5mM |
| ATP | 10mM |
| dNTPs | 2mM |
| 肌酸激酶 | 1000ng/mL |
| 磷酸肌酸 | 25mM |
| 引物 | 10μM |
| 探针 | 10μM |
| 大肠杆菌RecA蛋白 | 100ng/μL |
| UvsY蛋白 | 40ng/μL |
| 单链结合蛋白GP32 | 800ng/μL |
| Bst聚合酶 | 60ng/μL |
| 核酸外切酶III | 80ng/μL |
各试剂的终浓度如表。
一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒的检测方法，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂，置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：38℃水浴5min后，混匀，再38℃水浴15min；(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有新型冠状病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有新型冠状病毒核酸。
优选的，待测样本选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种。
有益效果：与普通PCR方法相比，本申请仅需要恒温水浴锅在37-42℃即可完成反应，对仪器设备要求低，无需热循环仪器，操作更加简单；
其次，本申请检测速度快，反应时间在30min之内即可完成；
第三，可实现检测结果的可视化。
因此，本发明的RMA结合侧流层析技术检测新型冠状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的新型冠状病毒的快速筛查检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：RMA反应温度的筛选结果图；
图2：RMA反应时间的筛选结果图；
图3：新型冠状病毒RMA-侧流层析试纸条检测方法的灵敏性试验；
图4：新型冠状病毒RMA-侧流层析试纸条检测方法的特异性试验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，
针对新型冠状病毒特异性基因ORF1ab设计RMA引物与探针，如下：
上游引物序列ORF1ab-F为：
5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；
下游引物序列ORF1ab-R为：
5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；
探针序列ORF1ab-P为：
5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。
下游引物ORF1ab-R的5’端用Biotin标记；探针ORF1ab-P的5’端用FAM标记，第34个碱基替换为THF(dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
实施例2
在实施例1的基础上，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。
实施例3
在实施例2的基础上，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。
实施例4
在实施例3的基础上，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。
实施例5
在实施例4的基础上，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：
实施例6
在实施例5的基础上，进行阳性标准品的制备，步骤如下：(1)参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取新型冠状病毒RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA；(2)以cDNA为模板，对ORF1ab基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证；(3)对阳性重组菌进行测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性标准品。
实施例7
在实施例6的基础上，一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒的检测方法，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂，置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：38℃水浴5min后，混匀，再38℃水浴15min；(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有新型冠状病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有新型冠状病毒核酸。
实施例8
在实施例7的基础上，(一)反应时间和反应温度的优化：
对RMA反应时间和反应温度进行优化，分别将相同反应体系置于30、32、35、38、40、42、45、48℃水浴锅内，结果表明，反应温度为38℃的RMA扩增效率最高(图1)；分别经5min、10min、15min、20min、25min、30min进行RMA反应时间进行优化，反应时间20min及以上时间，可以达到较好的扩增效率，优化的RMA反应时间为20min(图2)。
(二)侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读
在RMA扩增结束后，取1μLRMA产物和49μL的产物稀释液，稀释至50μL，混合均匀后滴加于侧流层析试纸条加样垫。5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(C)和检测线(T)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
(三)新型冠状病毒LFD-RMA检测方法的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5拷贝和1拷贝)，每个梯度的模板浓度做3个重复，在恒温水浴锅中进行RMA反应，所获得的RMA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，LFD-RMA的检测限为5个拷贝(图3)。
(四)新型冠状病毒LFD-RMA检测方法的特异性分析
参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)的RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
按照上述步骤建立的RMA方法进行特异性试验，分别以新型冠状病毒的DNA，SARS-CoV、MERS-CoV、FluA、FluB、HPIV、RSV的cDNA为模板，以ddH2O为阴性对照，进行RMA扩增，试验重复3次。
所有的RMA产物进行侧流层析试纸条检测，如图4所示，从图中可以看出，RMA扩增新型冠状病毒特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，该引物探针组可以用于建立检测新型冠状病毒的RMA-侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本的新型冠状病毒。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，
上游引物序列ORF1ab-F为：
5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；
下游引物序列ORF1ab-R为：
5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；
探针序列ORF1ab-P为：
5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。
3.如权利要求2所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。
4.如权利要求3所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。
5.如权利要求4所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：
各试剂的终浓度如表。
6.如权利要求5所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取待检测样本的总RNA，通过反转录获得cDNA；(2)将反转录得到的cDNA中加入扩增反应试剂，置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：38℃水浴5min后，混匀，再38℃水浴15min；(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有新型冠状病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有新型冠状病毒核酸。
7.如权利要求6所述的一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，待测样本选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种。
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