CN113846174A - 用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法 - Google Patents

用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法。本发明提供的试剂盒包括微流控芯片、试纸条检测卡盒、复溶液和提取对照品，所述微流控芯片包括至少4个检测通道，所述检测通道内含有扩增引物和扩增试剂，所述试纸条检测卡盒包括微流控芯片卡槽、稀释液槽和至少4个试纸条槽。本申请提供的试剂盒将特异灵敏的PCR技术与方便快速的免疫层析技术进行结合实现对艰难梭菌的检测，具有快速简单准确的特点，试剂便于运输和保存，结果可视化，对人员的专业性要求不高，适合基层医院及现场使用。

Description

用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法
技术领域
本申请属于生物技术和医学领域，具体涉及一种用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile，C.difficile)是一种产毒素或非产毒素的厌氧芽孢杆菌，是人类肠道正常菌群之一，其在1978年首次被证实与疾病有关。艰难梭菌感染(CDI)后容易引起腹泻、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、败血性休克甚至死亡。健康成人中的肠道菌群通常可抵抗艰难梭菌定植。然而，一旦正常的肠道菌群发生变化，就丧失了对艰难梭菌定植的防御性。最常见的感染因素是使用抗生素。当由于大量应用广谱抗生素等原因造成肠道正常菌群失调，该菌过度繁殖，就会引起抗菌药物相关性腹泻、艰难梭菌相关性腹泻等，严重时可引起伪膜性肠炎甚至死亡。临床上，约15％～25％的抗菌药物相关性腹泻，50％～75％的抗菌药物相关性结肠炎和95％～100％的伪膜性肠炎是由CDI(艰难梭菌感染) 引起。在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国CDI潜在威胁远高于国际水平。
艰难梭菌的主要毒力因子是肠毒素A和细胞毒素B。多数致病菌株是毒素A 阳性、毒素B阳性(A+B+)的菌株，毒素A阴性、毒素B阳性(A-B+)的变异菌株已被公认为是致病性的。某些艰难梭菌菌株还会产生被称为CDT或二元毒素的肌动蛋白特异性ADP核糖基转移酶。二元毒素决定区含有两种基因(cdtA 和cdtB)，位于致病性决定区PaLoc外部。近数年，出现过属于PCR核糖体分型027、PFGE型NAP1和REA型的B1“剧毒”和氟喹诺酮耐药菌株引起的CDI 爆发。这些菌株由于调控基因tcdC缺失，导致产毒能力增加。随着其发病率和病死率的急剧上升，准确的诊断对于最佳治疗手段和预防措施来说至关重要。
常用实验室检测方法有细胞毒素中和试验、产毒素培养、免疫学方法和核酸扩增法。细胞毒素试验和产毒素培养为诊断CDI的金标准，细胞毒素试验的检测结果受细胞种类的限制，操作复杂，费用高；产毒素培养需耗费大量的时间，对设备以及人员技术要求较高；免疫学方法虽然快速，但灵敏性与特异性并不稳定，且当谷氨酸脱氢酶与毒素A/B结果不一致时还需结合PCR方法进行诊断。核酸扩增技术NAATs通过对毒素基因的保守序列设计特异性引物来检测毒素基因，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域，但其检测过程依赖于昂贵的qPCR仪器，很难满足基层医院以及现场检测的需求。环介导等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等恒温扩增技术使用的兴起降低了NAATs在检测方面仪器和试剂的费用，但都具有一定的缺点。LAMP产物复杂，很难对产物实施进一步的序列特征等相关的分析，导致后续应用复杂，不太容易进一步实施多重序列的同时分析。RCA依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题，SDA需要经过DNA单链模板的准备、5端3端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应多个阶段，且需要经修饰的 dNTP作为底物、靶序列准备复杂。
核酸免疫层析技术是应用PCR扩增结合免疫层析技术来检测病原基因。特异性的抗原或抗体固定在NC膜上形成检测线(T线)和质控线(C线)，胶体金标记抗体吸附在结合垫上；待测样本提取核酸后，通过PCR扩增在核酸产物两端标记上不同抗原，然后取PCR产物进行侧向层析，通过毛细作用向前移动，当待测样本中含有待测基因时，产物可先后与胶体金上标记的抗体和T线上的抗体特异性结合，从而形成肉眼可观察的显色结果，冗余的胶体金的抗体结合物被C 线上的二抗捕获固定可显色。该方法在核酸检测领域有一定程度上的应用，但是由于取出产物进行层析的过程很容易形成气溶胶污染造成假阳性结果，限制了其广泛应用。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本申请提供一种用于检测艰难梭菌的检测试剂盒及其检测方法，其主要目的在于克服传统的核酸免疫层析方法存在开盖操作容易形成气溶胶污染的缺陷，为艰难梭菌的检测提供一种快速、简便和准确的试剂盒及其检测方法。本申请提供的试剂盒结合了核酸扩增技术快速、灵敏和特异的优点以及免疫层析技术的快速、便捷、低成本等特点。
在第一方面，本申请提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，其包括微流控芯片、试纸条检测卡盒、复溶液和提取对照品，所述微流控芯片包括至少4个检测通道，所述检测通道内含有扩增引物和扩增试剂，所述试纸条检测卡盒包括微流控芯片卡槽、稀释液槽和至少4个试纸条槽。
根据本申请的一些实施方式，所述扩增引物和扩增试剂为冻干粉。
根据本申请的一些实施方式，所述扩增试剂包含Taq DNA聚合酶和4种 dNTP。根据本申请的一些实施方式，所述4种dNTP包括dATP、dGTP、dTTP 和dCTP。
根据本申请的一些实施方式，所述检测通道内还含有冻干保护剂。根据本申请的一些实施方式，所述冻干保护剂为冻干粉。根据本申请的一些实施方式，所述冻干保护剂包括海藻糖、BSA和甘氨酸中的一种或多种。
根据本申请的一些实施方式，所述检测通道包括用于检测艰难梭菌毒素B 基因的毒素B基因通道、用于检测艰难梭菌tpi基因的tpi基因通道、用于检测提取对照品基因的提取对照品基因通道和用于检测阴性对照的阴性对照通道。
根据本申请的一些实施方式，所述扩增引物包含用于检测艰难梭菌毒素B 基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
根据本申请的一些实施方式，用于检测艰难梭菌tpi基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
根据本申请的一些实施方式，用于检测提取对照品基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物为细菌通用引物，可用于扩增包括艰难梭菌在内的所有病原菌的提取对照。
根据本申请的一些实施方式，所述上游引物和/或所述下游引物的5’端分别标记地高辛或荧光素。
根据本申请的一些实施方式，所述试纸条槽里装有试纸条，所述试纸条包括顺次搭接在底衬上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
根据本申请的一些实施方式，所述结合垫上包被乳胶颗粒或胶体金标记的的鼠抗地高辛抗体。
根据本申请的一些实施方式，所述硝酸纤维素膜上有包被荧光素抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线。
根据本申请的一些实施方式，所述稀释液槽含有PBS缓冲液。
根据本申请的一些实施方式，所述复溶液包括PCR扩增缓冲液。
根据本申请的一些实施方式，所述提取对照品包括人工构建的与艰难梭菌不同源的质粒菌冻干粉。
根据本申请的一些实施方式，所述试剂盒还包括阳性质控品和/或阴性质控品。
根据本申请的一些实施方式，所述阳性质控品包括灭活的艰难梭菌菌株冻干粉。
根据本申请的一些实施方式，所述阴性质控品包括无核酸酶的纯水。
根据本申请的一些实施方式，所述试纸条槽是互相独立且封闭，其对应于所述微流控芯片中的检测通道。本申请中，微流控芯片配置为能够安装到试纸条检测卡盒的微流控芯片卡槽中，试纸条检测卡盒的稀释液槽与微流控芯片的检测通道相对应，并且可以连通。使用时，稀释液槽中的稀释液与微流控芯片中的扩增产物混合后流到试纸条槽中，在试纸条上进行层析。
在第二方面，本申请提供了一种采用第一方面所述的试剂盒检测艰难梭菌的检测方法，包括如下步骤：
S1：提供待测样本的核酸模板；
S2：将所述核酸模板与所述复溶液混合后，加入到所述微流控芯片的检测通道中，密封；
S3：将密封后的微流控芯片在进行PCR扩增，得到待测样品的扩增产物；
S4：将完成PCR扩增后的微流控芯片安装到所述试纸条检测卡盒的微流控芯片卡槽中，使所述稀释液槽中的稀释液与所述微流控芯片中的扩增产物混合后流到试纸条槽上，静置后，查看检测结果。
根据本申请的一些实施方式，步骤S3中，所述PCR扩增的条件包括：95℃ 1min变性后，按95℃10s、60℃20s进行40个循环。
根据本申请的一些具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：
1)将提取对照品与阴性质控品混合，复溶后混匀；得到复溶后的提取对照品；优选地，所述阴性质控品的加入量为80-120μl，例如100μl；所述提取对照品的浓度为103CFU/mL-106CFU/mL；
2)将待测样本与复溶后的提取对照品进行混合，得到混合样品，对所述混合样品进行核酸提取；优选地，所述待测样本与复溶后的提取对照品的用量比为 (8-10)：1，例如9：1；
3)将提取的核酸与复溶液混合，得到混合液；优选地，所述提取的核酸与所述复溶液的体积比为(1：2)-(2：1)；
4)将所述混合液加入到所述微流控芯片的检测通道中，用铝膜密封检测通道的加样孔；优选地，所述混合液的加入量为15-20μl，例如18μl；
5)将步骤4)得到的密封后的微流控芯片放入微流控芯片PCR扩增仪中进行PCR扩增，优选地，所述PCR扩增的条件为95℃ 1min变性后，按95℃ 10s、 60℃20s进行40个循环；
6)PCR扩增结束后，将微流控芯片以铝膜面朝下的方式安装到试纸条检测卡盒背面的微流控芯片卡槽中，将试纸条检测卡盒的稀释液槽与微流控芯片的检测通道连通；使所述稀释液槽中的稀释液与所述微流控芯片中的扩增产物混合后流到试纸条槽上；
7)静置优选室温放置3-5分钟，肉眼判读结果，完成检测。
根据本申请的一些实施方式，采用阳性质控品和阴性质控品对本申请的试剂盒进行质控检测，其中，阳性质控品的质控标准为：阳性质控品试验孔的试纸条的C线(质控线)均显色，阴性对照孔仅C线(质控线)显红色，提取对照孔的T线(检测线)和C线(质控线)均显红色；否则实验无效。
根据本申请的一些实施方式，采用本申请的试剂盒检测待测样品时，毒素B 基因(tcdB)通道的试纸条T线(检测线)变红色，则判定为检出tcdB基因，否则检测结果为阴性；tpi基因通道的试纸条T线(检测线)变红色，则判定为检出tpi基因，否则检测结果为阴性。根据上述通道的检测结果，判断结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003263991830000061
在第三方面，本申请提供了一种第一方面所述的试剂盒或第二方面所述的检测方法在艰难梭菌检测中的应用。
相比于现有技术，本申请至少具有以下有益效果：
(1)操作简单，适合基层医院及现场使用：无扩增试剂配制过程，只需将提取核酸与复溶液混合上样即可，此外，核酸免疫层析试结果为可视化，对操作人员、仪器的要求极低，适合高中低等级医院、临床可推广性高；
(2)全封闭设计，有效防止假阳性：将微流控芯片卡入试纸条检测卡盒后形成全封闭的检测系统，无扩增后的开盖操作，极大程度避免了产物气溶胶的形成，确保了检测结果的准确性；
(3)便于运输和保存：所有试剂可室温保存(2-30℃),运输存储方便，极大降低了运输和保存成本，满足目前基层或现场检测设施有限的需求；
(4)反应速度快：从样本到结果判读的全流程耗时小于1小时，快速简便；
(5)质量控制，有效防止假阴性：本申请中不仅对核酸免疫层析试纸设计了质控条带，可对层析过程进行质量监控，能监控是否出现假阳性以及人工操作失误；而且还设置了提取对照对样本采集、核酸提取和PCR扩增进行全程跟踪质控，对全流程进行监督。
附图说明
下面将结合附图对本申请作进一步说明。
图1示出了根据本申请的一个实施方式的试剂盒中的微流控芯片的示意图。
图2示出了根据本申请的实施例1的试剂盒检测的特异性结果图，其中，1- 蜡样芽孢杆菌、2-铜绿假单胞菌、3-大肠杆菌、4-空肠弯曲菌、5-伤寒沙门氏菌、 6-痢疾志贺氏菌。
图3示出了根据本申请的实施例2的试剂盒检测灵敏度分析结果图，其中， 1-6分别对应浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、 102CFU/mL、10CFU/mL。
图4示出了根据本申请的实施例3的试剂盒的阳性质控品检测结果。
图5示出了根据本申请的实施例3的试剂盒的阴性质控品检测结果。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1试剂盒检测的特异性分析
为了验证试剂盒检测的特异性，采用本申请的试剂盒检测了蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌6种腹泻相关病原体。
所采用的试剂盒包括微流控芯片、试纸条检测卡盒、复溶液、提取对照品、阳性质控品和阴性质控品，其中，
微流控芯片如图1所示，其包含4个检测通道，4个检测通道分别检测艰难梭菌毒素B基因、tpi基因、提取对照基因和阴性对照，每个检测通道孔中预埋有含扩增引物、Taq DNA聚合酶、4种dNTP和冻干保护剂的冻干粉，用于检测艰难梭菌毒素B基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，用于检测艰难梭菌tpi基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 所示，用于检测提取对照品基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述上游引物和/或所述下游引物的5’端分别标记地高辛或荧光素；
所述试纸条检测卡盒含有微流控芯片卡槽、稀释液槽和4个独立且封闭的试纸条槽，所述试纸条槽里装有试纸条，所述试纸条包括顺次搭接在底衬上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被乳胶颗粒标记的的鼠抗地高辛抗体，所述硝酸纤维素膜上有包被荧光素抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；稀释液槽含有PBS缓冲液；
复溶液为PCR扩增缓冲液；
提取对照品为人工构建的与艰难梭菌不同源的质粒菌冻干粉，所述质粒菌通过将人工合成的基因片段插入PUC57载体，然后转化到大肠杆菌中制成；
阳性质控品为灭活的艰难梭菌菌株冻干粉；
阴性质控品为无核酸酶的纯水。
所采用的检测方法如下：
(1)将180μl提取对照品与20μl阴性质控品混合，复溶后混匀，得到复溶后的提取对照品；
(2)取180μl菌液，加入20μl复溶后的提取对照品混匀，采用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328，天根生物科技有限公司)按照试剂盒说明书进行核酸提取，最后用50μl洗脱液洗脱获得纯化后核酸模板；
(3)取40μl核酸模板与40μl复溶液混匀，然后用移液器取18μl混合物依次加到微流控芯片的4个检测通道中，用铝膜贴住微流控芯片的检测通道的加样孔；
(4)将微流控芯片放入微流控芯片PCR扩增仪中，95℃1min变性后，按95℃10s、60℃20s进行40个循环，完成PCR扩增；
(5)运行结束，取出芯片备用；
(6)揭开试纸条检测卡盒背面的出液口密封胶条，然后将微流控芯片以铝膜面朝下的方式安装到试纸条检测卡盒背面的芯片卡槽中，然后将试纸条检测卡盒正面朝上摆在桌面上，将试纸条检测卡盒的稀释液槽与微流控芯片的检测通道连通，使所述稀释液槽中的稀释液与所述微流控芯片中的扩增产物混合后流到试纸条槽的试纸条上，进行层析；
(7)室温放置3-5分钟，肉眼判读结果。
检测结果如图2所示，从图2可以看出上述检测的菌株，除了提取对照孔的 T线(检测线)显色，其它孔的T线(检测线)均不显示色，检测结果为阴性，说明本申请的试剂盒的检测特异性较好。
实施例2试剂盒检测的灵敏度分析
将定值的临床分离的艰难梭菌用纯水10倍梯度稀释成浓度为106CFU/mL、 105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的菌液，采用与实施例1相同的试剂盒和检测方法进行检测，结果如图3所示。
从结果可以看出，浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL 的菌液的tcdB和tpi基因通道均为阳性，浓度为102CFU/mL的菌液的tcdB和tpi 基因通道均为弱阳性，10CFU/mL的菌液的tcdB和tpi基因通道均为阴性，说明本申请的试剂盒检测艰难梭菌的灵敏度至少不低于103CFU/mL。
实施例3阳性质控品和阴性质控品检测
本申请的试剂盒阳性质控品和阴性质控品为外部质控，首次使用试剂盒时或检测结果出现问题时，应使用阴性质控品和阳性质控品进行检测，验证试剂盒各组分是否可以正常工作，同时可质控实验环境和人员操作。当对操作环境洁净度存疑时，可使用阴性质控品及阳性质控品进行质控。
采用与实施例1相同的试剂盒和检测方法进行质控，不同之处在于，对于阳性质控品，步骤(1)中向阳性质控品管加入180μl阴性质控品进行复溶，再加入20μl提取对照品震荡混匀，然后用核酸提取试剂盒进行核酸提取，其检测结果如图4；对于阴性质控品，步骤(1)中从阴性质控品管取出180μl加入20μl 提取对照品震荡混匀品震荡混匀，然后用核酸提取试剂盒进行核酸提取，其检测结果如图5。从结果可以看出，阳性质控品的tcdB和tpi基因通道均为阳性，阴性质控品的tcdB和tpi基因通道均为阴性，说明本申请的试剂盒能正常工作。
实施例4检测临床样本
从浙江省人民医院获得临床样本44份，采用与实施例1相同的试剂盒和检测方法进行检测，同时采用赛沛公司的艰难梭菌核酸(DNA)检测试剂盒(实时荧光PCR法)进行对比验证，结果显示，40份艰难梭菌核酸(DNA)检测试剂盒(实时荧光PCR法)检测为阳性的样本，本发明的试剂盒检测也为阳性，另外4份样本两个方法检测均为阴性，二者比较无显著性差异，符合率达到100％，说明本申请的试剂盒和检测方法能够准确检测临床样本。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不对本申请构成任何限制。通过参照典型实施例对本申请的描述，但应当解释为其中所用的词语为描述性和解释性的词汇，而不是限定性的词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请做出修改，以及在不背离本申请的精神和范围的情况下对本申请进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可以扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京源景泰科生物科技有限公司
<120> 用于检测艰难梭菌的试剂盒和检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
agtgaaacga gtgacccatt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 2
aacctttgtt gccttatct 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 上游引物
<400> 3
atgtgaaatc tggagaatgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 下游引物
<400> 4
atacggtcta acagttttgt 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 上游引物
<400> 5
tatcactgtt tccgtccg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 下游引物
<400> 6
tcctagctgc ctatcctc 18

Claims (10)

1.一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，其包括微流控芯片、试纸条检测卡盒、复溶液和提取对照品，所述微流控芯片包括至少4个检测通道，所述检测通道内含有扩增引物和扩增试剂，所述试纸条检测卡盒包括微流控芯片卡槽、稀释液槽和至少4个试纸条槽。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物和扩增试剂为冻干粉；优选地，所述扩增试剂包含Taq DNA聚合酶和4种dNTP；更优选地，所述检测通道内还含有冻干保护剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测通道包括用于检测艰难梭菌毒素B基因的毒素B基因通道、用于检测艰难梭菌tpi基因的tpi基因通道、用于检测提取对照品基因的提取对照品基因通道和用于检测阴性对照的阴性对照通道。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物包含用于检测艰难梭菌毒素B基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；和/或用于检测艰难梭菌tpi基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；和/或用于检测提取对照品基因的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；优选地，所述上游引物和/或所述下游引物的5’端分别标记地高辛或荧光素。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条槽里装有试纸条，所述试纸条包括顺次搭接在底衬上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，优选地，所述结合垫上包被乳胶颗粒或胶体金标记的的鼠抗地高辛抗体，所述硝酸纤维素膜上有包被荧光素抗体的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；和/或所述稀释液槽含有PBS缓冲液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述复溶液包括PCR扩增缓冲液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述提取对照品包括人工构建的与艰难梭菌不同源的质粒菌冻干粉。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和/或阴性质控品，优选地，所述阳性质控品包括灭活的艰难梭菌菌株冻干粉，和/或所述阴性质控品包括无核酸酶的纯水。
9.一种采用权利要求1-8中任一项所述的试剂盒检测艰难梭菌的检测方法，包括如下步骤：
S1：提供待测样本的核酸模板；
S2：将所述核酸模板与所述复溶液混合后，加入到所述微流控芯片的检测通道中，密封；
S3：将密封后的微流控芯片进行PCR扩增，得到待测样品的扩增产物；
S4：将完成PCR扩增后的微流控芯片安装到所述试纸条检测卡盒的微流控芯片卡槽中，使所述稀释液槽中的稀释液与所述微流控芯片中的扩增产物混合后流到试纸条槽上，静置后，查看检测结果。
10.一种权利要求1-8中任一项所述的试剂盒或权利要求9所述的检测方法在艰难梭菌检测中的应用。
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