CN116024302B - 双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒 - Google Patents
双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒 Download PDFInfo
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- CN116024302B CN116024302B CN202211315253.9A CN202211315253A CN116024302B CN 116024302 B CN116024302 B CN 116024302B CN 202211315253 A CN202211315253 A CN 202211315253A CN 116024302 B CN116024302 B CN 116024302B
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Abstract
本申请公开了一种双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒;属于生物检测技术领域;所述检测SARS‑CoV‑2病毒ORF1ab基因的引物探针组合物特异性扩增并检测2019‑nCoV病毒的ORF1ab基因,同时设置内参RnaseP基因监控采样过程。本申请研发的引物探针可以保证快速、高效、特异性地对目的片段进行扩增,扩增时间仅需10min,最低检测拷贝数可达200copies/mL;扩增产物检测型式为试纸条,肉眼鉴定,无需仪器辅助;且扩增过程无需变温和类似于PCR仪等复杂装置。
Description
技术领域
本申请涉及一种生物检测技术领域,更具体地说,尤其涉及一种双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCoV的全球大规模爆发,核酸检测是目前用于早期诊断新型冠状病毒的主要方法。
新型冠状病毒是一种单链正义RNA病毒,其基因组组成与其他冠状病毒相似,基因组中包含6个ORF,包括复制酶ORF 1a、ORF 1b等,还有4种结构蛋白基因:刺突蛋白(spikeprotein,S),包膜蛋白(envelope protein,E),膜蛋自(membrane protein,M),核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)。
新型冠状病毒的基因突变频率很高,加大了检测的难度。通过对2019-nCoV野生型和目前世卫组织公布的重点突变株的ORF1基因(简称O基因)进行对比分析,在保守序列区域设计了一组能够与申请人研发的层析试纸适配的恒温核酸扩增引物、探针成为一个研发的难点。
同时,根据《新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂注册审查指导原则》等文件要求,为提高检测的准确性,核酸检测试剂盒中必须包含内参检测用以内部监测。tRNA的合成过程较为复杂,首先是在细胞核内合成含有额外序列的pre-RNA,而RNase P行使的核酸内切酶活性,对tRNA的最终活性形成有着至关重要的作用。RNase P是人体中主要的核酸酶之一,广泛分布于各个器官细胞中,也因此能够成为人源样本的检测内源性内参。本申请针对指导原则的这一点要求,选择了RNA酶P(RNase P)基因作为内参靶标研究对象,以期设计了一组恒温扩增引物,与其他恒温扩增试剂盒匹配使用,用以检测咽拭子、鼻拭子从采样到扩增全过程的合格性。
同时,申请人在先申请:2022110603298提出了一种恒温层析核酸检测装置及检测方法,其要求:
1)扩增指标:恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟;
2)初阳人员能够检测出来:灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/mL能够检测出来。
申请人在Himmpat中检索“层析and ORF1ab and内参”,得到以下结果:
现有技术1:CN112646929A。
现有技术2:CN113186346A。
现有技术3:CN112981008A。
现有技术4:CN112899402A。
现有技术5:CN111455099A。
上述现有技术均采用了“恒温扩增+胶体金层析试纸”的方式来完成检测,但是其无法满足扩增指标要求(普遍性的要求在20min以上),而在灵敏度指标上,虽然均宣称检测下限能够达到100copies/mL。然而,申请人在重复上述文献的试验时,对于ORF1ab基因+内参基因的检测,灵敏度一般在800~1400copies/ml。
综上所述,研发一款能够达到前述扩增、灵敏度要求的引物、探针、层析试纸,是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请的第一目的在于针对上述现有技术的不足,提供一种双联核酸检测层析试纸。
本申请的第二目的在于提供一种引物及探针组,特别是一种ORF1ab基因、内参RnaseP基因检测的引物及探针组。
本申请的第三目的在于提供一种试剂盒。
本申请的技术方案是:
一种双联核酸检测层析试纸,包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫;沿着层析溶液的流动方向,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上;
检测垫上设置有硝酸纤维素膜,在检测垫上设置三个功能区:T1、T2、C区;
检测垫的T1区经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的T2区经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的C区经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;
所述结合垫包含:FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述检测FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;
进一步,所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成;所述检测链霉亲和素是由链霉亲和素与磷酸缓冲液组成;DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
进一步,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构的重合长度在1mm。
进一步,显色颗粒为红色乳胶微球,所述乳胶微球粒径为400nm。
进一步,所述的双联核酸检测层析试纸制备时,包括以下步骤:
第一步骤,制备显色颗粒溶液,将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体-显色颗粒复合物,将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP-显色颗粒复合物;将FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物加载到结合垫上;
第二步骤,抗地高辛抗体、链霉亲和素和DNP抗体分别加载在检测垫上的T1区、T2区和C区;
第三步骤,制备试纸大板,结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上,结合垫与检测垫部分重合,吸水垫与检测垫部分重合;
第四步骤,制备试纸条,将步骤三中制备的试纸大板进行裁切,制备成检测试纸。
进一步,所述的双联核酸检测层析试纸的检测方法为:
若有2019-nCoV病毒,且采样合格其ORF1ab基因及内参基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样品垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,两种扩增产物的FAM标签与FAM抗体-显色颗粒复合物结合;
再经过检测垫:经过检测区时,ORF1ab基因扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区T1显色;内参基因扩增产物的另一端Biotin标签会和检测区的链霉亲和素结合使检测区T2显色;
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,对照区显色;
层析试纸会产生如下八种情况:
T1线显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阳性,采样合格结果有效;
T1线显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阴性,采样合格结果有效;
T1线不显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样。
一种引物及探针组,其用于检测2019-nCoV病毒的ORF1ab基因以及内参RnaseP基因检测;
根据2019-nCoV病毒的ORF1ab基因保守序列设计引物、探针的核苷酸序列如下:
上游引物序列:TGGTGATGATACTGTGATAGAAGTGCAAGG
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-TGTAGCCATACTCCACTCATCTAAATCAATGC
探针序列:
[5’FAM]-CTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTT[THF]AACTCGGTACAGAAGT-[3’C3spacer]
(2)根据RNase P基因保守序列设计的引物、探针的核苷酸序列如下:
上游引物序列:ATTTAGAGACTGAACCTCTGGAAAGCCAAGAC
下游引物序列:
[5’-Biotin]-ACATGACAAGTTTATGCAAGATTACTTTGGAGT
探针序列:
[5’FAM]-AGAGAGCTTTTGGACACTTCATTTGAAGATC[THF]GTCAAAACCTAAGAGAAA-[3’C3spacer]。
进一步,检测ORF1ab基因的引物、探针的修饰位点如下:
在下游引物5’端标记Digoxin;
探针5’端标记FAM;
探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点;
探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团(C3-spacer修饰);
检测内参基因的引物、探针的修饰位点如下:
内参基因的下游引物5’端标记Biotin;
探针5’端标记FAM;
探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点;
探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团(C3-spacer修饰)。
一种试剂盒,包括前述的引物及探针组。
一种试剂盒,包括前述的引物及探针组、前述的层析试纸。
本申请的有益效果在于:
第一,本申请的基础构思是设计一种ORF1ab基因、内参RnaseP基因的引物及探针组及双联核酸检测层析试纸,能够同时满足以下研发目标:一是扩增时间仅10min,提高了检测效率;二是扩增温度低(37-45℃),减少气溶胶产生和核酸污染,同时反应过程无需变温,扩增装置简易;三是灵敏度高(200copies/mL);四是检测产物匹配自制试纸条,无需复杂设备,且检测结果肉眼可鉴。
第二,根据人源RNase P subunit p38(RPP38)基因保守序列计了一组恒温核酸扩增引物、探针,这种引物、探针的碱基数量要多于变温PCR的引物、探针长度,引物长度在30-35nt,一般不短于30nt,探针一般在46-52ny。同时为了使得扩增产物能够与自制试纸条结合并检测,对该组引物、探针进行了以下几种核苷酸修饰:
①下游引物5’端标记生物素(Biotin),生物素可以与自制微球试纸条NC膜上的T线Biotin抗体结合;
②探针5’端标记FAM,用于与试纸条结合垫中的FAM抗体偶联微球结合;
③探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设有一个四氢呋喃(THF)位点,用以nfo酶识别和酶切;
④探针3’端进行C3-spacer修饰,防止探针过早进行非特异性扩增。
第三,本专利通过对SARS-CoV-2野生型和目前世卫组织公布的重点突变株的ORF1基因(简称O基因)进行对比分析,在保守序列区域设计了一组能够与自制试纸条联用的恒温核酸扩增引物、探针,该组引物、探针包含以下几组核苷酸修饰:
①下游引物5’端标记Digoxin,用于与自制微球试纸条NC膜上的T线Biotin抗体结合;
②探针5’端标记FAM,用于与试纸条结合垫中的FAM抗体偶联微球结合;
③探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设有一个四氢呋喃(THF)位点,用以nfo酶识别和酶切;
④探针3’端进行C3-spacer修饰,防止探针过早进行非特异性扩增。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本申请作进一步的详细说明,但并不构成对本申请的任何限制。
图1是本申请的层析试纸的设计图。
图2是本申请的验证性试验的测试结果。
图3是本申请的层析试纸灵敏度验证的测试结果。
图4是本申请的特异性扩增试验的测试结果。
附图标记:
样品垫1、结合垫2、检测垫3、吸水垫4、T1区3-1、T2区3-2、C区3-3。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
<研发要求>
第一个研发目标:检测时间要快:恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟;
第二个研发目标:初阳人员能够检测出来:灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/mL能够检测出来。
第三个研发目标:多靶标检测:能够同时实现多靶标的核酸扩增及检测。
基于现有知识的分析,本申请的研发重点与难点在于:
1)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足第一个研发目标。
如背景技术中所述,现有技术的恒温扩增,最好的效果就是:温度在40℃扩增20min。恒温扩增技术应用在N基因上,扩增时间缩短到10min,还没有成功经验。
2)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足第二个研发目标。
灵敏度是更具挑战的指标之一。研发团队经过测试:CN112981008A的灵敏度在1000copies/mL;上述设计仍然无法达到本申请的设计目标。
3)现有层析试纸大部分为抗原检测试纸,无法满足第三个研发目标。核酸检测试纸较为少见,同时如何实现单条试纸检测多个靶标也是较为挑战。
<实施例一、研发方案>
(1)根据新型冠状病毒ORF1ab基因保守序列设计引物、探针的核苷酸序列如下:
上游引物序列:TGGTGATGATACTGTGATAGAAGTGCAAGG
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-TGTAGCCATACTCCACTCATCTAAATCAATGC
探针序列:
[5’FAM]-CTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTT[THF]AACTCGGTACAGAAGT-[3’C3spacer]。
(2)根据RNase P基因保守序列设计引物、探针如下:
上游引物序列:ATTTAGAGACTGAACCTCTGGAAAGCCAAGAC
下游引物序列:
[5’-Biotin]-ACATGACAAGTTTATGCAAGATTACTTTGGAGT
探针序列:
[5’FAM]-AGAGAGCTTTTGGACACTTCATTTGAAGATC[THF]GTCAAAACCTAAGAGAAA-[3’C3spacer]。
(3)双联核酸检测层析试纸
硬件结构设计:如图1所示,一种双联核酸检测层析试纸,包括PVC底板、样品垫1、结合垫2、检测垫3、吸水垫4;沿着层析溶液的流动方向,样品垫1、结合垫2、检测垫3、吸水垫4依次布置在PVC底板上;样品垫1、结合垫2、检测垫3、吸水垫4相邻的两种结构的重合长度在1mm。
显色设计:恒温反应体系中扩增后的ORF1ab基因阳性核酸产物中的FAM标签可与标记有乳胶微球抗FAM抗体结合,当液体流至检测区时,产物的另一端标记物地高辛基团与抗地高辛抗体的结合使T1线显色;恒温反应体系中扩增后的RnaseP基因阳性核酸产物中的FAM标签可与标记有乳胶微球抗FAM抗体结合,当液体流至检测区时,产物的另一端标记物生物素基团与链霉亲和素的结合使T2线显色;标记有乳胶微球的DNP可与DNP抗体结合,使C线显色。
核酸检测试纸中,所述检测垫包括硝酸纤维素膜,显色颗粒为红色乳胶微球,所述乳胶微球粒径为400nm。所述的核酸检测试纸中,结合垫与检测垫重合1mm,吸水垫与检测垫重合1mm。检测垫3包括:T1区3-1、T2区3-2、C区3-3;
结合垫中包含FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述检测FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;
检测垫上设置有硝酸纤维素膜,在检测垫上设置三个功能区:T1、T2、C区。
检测垫的T1区经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的T2区经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的C区经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成。所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成,所述检测链霉亲和素是由链霉亲和素与磷酸缓冲液组成,DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
一种双联核酸检测层析试纸的制备方法,包括以下步骤:
第一步骤,制备显色颗粒溶液,将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体-显色颗粒复合物,将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP-显色颗粒复合物;将FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物加载到结合垫上;
第二步骤,抗地高辛抗体、链霉亲和素和DNP抗体分别加载在检测垫上的T1区、T2区和C区;
第三步骤,制备试纸大板,结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上,结合垫与检测垫部分重合,吸水垫与检测垫部分重合;
第四步骤,制备试纸条,将步骤三中制备的试纸大板进行裁切,制备成检测试纸。
双联核酸检测层析试纸的检测机理:
若有2019-nCoV病毒,且采样合格其ORF1ab基因及内参基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样品垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,两种扩增产物的FAM标签与FAM抗体-显色颗粒复合物结合;
再经过检测垫:经过检测区时,ORF1ab基因扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区T1显色(T1区显色的要求是:扩增产物的一端与要和FAM抗体-显色颗粒复合物连接,另外一端与抗地高辛抗体结合);内参基因扩增产物的另一端Biotin标签会和检测区的链霉亲和素结合使检测区T2显色(T2区显色的要求是:扩增产物的一端与要和FAM抗体-显色颗粒复合物连接,另外一端与链霉亲和素结合);
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,对照区显色。
因此,层析试纸会产生如下八种情况:
T1线显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阳性,采样合格结果有效;
T1线显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阴性,采样合格结果有效;
T1线不显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样。
<验证性试验:双重检测测试>
制备样本
使用迅睿生物核酸提取试剂盒(磁珠法)对新冠ORF1ab基因假病毒(拷贝数2×107copies/mL)、RNase P基因假病毒(拷贝数2×107copies/mL)进行核酸提取,提取后的核酸分别稀释10、2、3、4、105倍后(即拷贝数分别为2×106、2×105、2×4、2×3、2×2copies/mL)作为扩增模板P1、P2、P3、P4、P5,用以验证该引物探针对靶标序列的扩增效率。
检测体系
使用潍坊安普未来生物科技有限公司公司提供的RNA恒温快速扩增试剂盒,对新冠ORF1ab基因、RNase P基因核酸进行恒温扩增体系配制。配制体系如下表(每组实验均设置1组复孔):
检测程序
1)将上述配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球;
2)酶冻干微球溶解后扩增体系粘稠,需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将配制好的体系放置于37-45℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min;
3)待扩增结束后,使用纯化水对扩增产物进行稀释,稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等。
4)产物稀释混匀后,将本申请自制的微球法试层析纸条(双联检测试纸)插入液面,注意液面不得超过样品垫,待液面上升至C线位置时取出试纸条,水平放置,5-10min读取结果。
如图2所示,为验证性实验一的测试结果。结果显示:该组引物、探针对ORF1ab基因及Rnase P基因核酸模板的扩增,最低检测限可低于200copies/mL,且未出现非特异性扩增。
<验证性试验:灵敏度验证>
为了说明灵敏度指标,图3来对比说明。
使用潍坊安普未来生物科技有限公司公司提供的RNA恒温快速扩增试剂盒,对新冠ORF1ab基因、RNase P基因核酸进行恒温扩增体系配制。
第一类:仅有ORF1ab基因假病毒
第二类:仅有RNase P基因假病毒
第三类:ORF1ab基因假病毒+RNase P基因假病毒
图3给出了上述3类试验的测试结果。试验表明:本申请的引物、探针、层析试纸的综合设计,灵敏度为200copies/mL,且未出现非特异性扩增。
<特异性扩增试验>
模板:
1)阴性模板N:DPEC-H2O;
2)阴性参考品盘模板:
N1 | 阴性拭子样本 | N8 | 冠状病毒OC43 |
N2 | 乙型流感Yamagata | N9 | 冠状病毒229E |
N3 | 乙型流感Victoria | N10 | 冠状病毒HKU1 |
N4 | 季节性H1N1流感病毒 | N11 | 冠状病毒NL63 |
N5 | EB病毒 | N12 | 腺病毒3型 |
N6 | 肺炎支原体 | N13 | 副流感2型 |
N7 | 肺炎衣原体 | N14 | 呼吸道合胞病毒 |
3)阳性模板+:ORF1ab基因假病毒+RNase P基因假病毒。
反应体系如下(仅仅更换模板):
检测程序同<验证性试验:双重检测测试>。
以上模板使用本申请的引物探针组合物(“验证性试验:双重检测测试”使用的引物、探针组合物)进行恒温扩增,如图4可知显示无非特异性扩增反应(N1~N14的T1线、T2线均不显色,C线均显色)。
以上所举实施例为本申请的较佳实施方式,仅用来方便说明本申请,并非对本申请作任何形式上的限制,任何所属技术领域中具有通常知识者,若在不脱离本申请所提技术特征的范围内,利用本申请所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例,并且未脱离本申请的技术特征内容,均仍属于本申请技术特征的范围内。
Claims (4)
1.一种试剂盒,其特征在于,包括:引物及探针组、双联核酸检测层析试纸;
其中,所述引物及探针组由(1)和(2)组成:
(1)根据2019-nCoV病毒的ORF1ab基因保守序列设计引物、探针的核苷酸序列如下:
上游引物序列:TGGTGATGATACTGTGATAGAAGTGCAAGG
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-TGTAGCCATACTCCACTCATCTAAATCAATGC
探针序列:
[5’FAM]-CTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTT[THF]AACTCGGTACAGAAGT-[3’C3spacer];
(2)根据RNase P基因保守序列设计的引物、探针的核苷酸序列如下:
上游引物序列:ATTTAGAGACTGAACCTCTGGAAAGCCAAGAC
下游引物序列:
[5’-Biotin]-ACATGACAAGTTTATGCAAGATTACTTTGGAGT
探针序列:
[5’FAM]-AGAGAGCTTTTGGACACTTCATTTGAAGATC[THF]GTCAAAACCTAAGAG AAA-[3’C3spacer];
其中,所述的双联核酸检测层析试纸,包括:PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫;沿着层析溶液的流动方向,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上;检测垫上设置有硝酸纤维素膜,在检测垫上设置三个功能区:T1、T2、C区;检测垫的T1区经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的T2区经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成;检测垫的C区经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;所述结合垫包含:FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;
所述抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成;所述链霉亲和素是由链霉亲和素与磷酸缓冲液组成;DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种试剂盒,其特征在于,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构的重合长度在1mm。
3.根据权利要求1所述的一种试剂盒,其特征在于,显色颗粒为红色乳胶微球,所述乳胶微球粒径为400nm。
4.一种非诊断目的2019-nCoV病毒检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,配置反应体系:
所述模板为以待检样品的总RNA为模板;
上游引物、下游引物、探针采用如权利要求1所述的试剂盒中的引物及探针组;
S2,将S1中配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球;
S3,扩增体系粘稠,配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min;
S4,待扩增结束后,使用蒸馏水对扩增产物进行稀释,稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等;
S5,产物稀释后,取80μL稀释产物滴加到如权利要求1所述的试剂盒中的双联核酸检测层析试纸上,5-10min读取结果;
若有2019-nCoV病毒,且采样合格其ORF1ab基因及内参基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样品垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,两种扩增产物的FAM标签与FAM抗体-显色颗粒复合物结合;
再经过检测垫:经过检测区时,ORF1ab基因扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区T1显色;内参基因扩增产物的另一端Biotin标签会和检测区的链霉亲和素结合使检测区T2显色;
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,对照区显色;
层析试纸会产生如下八种情况:
T1线显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阳性,采样合格结果有效;
T1线显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线显色,表示ORF1ab检测结果阴性,采样合格结果有效;
T1线不显色、T2线不显色、C线显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样;
T1线不显色、T2线不显色、C线不显色,表示采样无效,需重新采样。
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