CN104531675A - 一种gRNA体外合成及活性检测的方法 - Google Patents

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杜建勇
邓然
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Abstract

本发明公开了一种体外快速合成gRNA及检测方法的技术。本发明提供了一种体外合成目标基因的特异gRNA的方法，包括如下步骤：1)合成扩增gRNA转录模板的上游引物、扩增gRNA转录模板的下游引物和gRNA保守片段；2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述扩增gRNA转录模板的上游引物和所述扩增gRNA转录模板的下游引物进行PCR反应，得到PCR产物为gRNA转录模板；3)将所述gRNA转录模板转录得到gRNA；即为目标基因的特异gRNA。本发明的实验证明，本发明通过一步PCR反应扩增，迅速得到足够浓度的带有T7promoter的gRNA的转录模板，并转录纯化得到有功能的gRNA。

Description

一种gRNA体外合成及活性检测的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及基因编辑相关的一种gRNA体外合成及活性检测的方法。
背景技术
基因定点敲除技术通过对染色体上基因特异位点进行定点突变，使其功能丧失，进而达到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技术创建的疾病动物模型对医学研究的发展做出了重要贡献。传统的基因敲除技术于上世纪80年代末由Smithies等创立，通过同源重组手段将构建的外源DNA片段插入并替换相应染色体上特定的区段，达到基因敲除的目的。这一技术的应用使人类能够有目的地研究基因功能和与之相关的疾病之间的直接关系。然而由于同源重组技术需要载体构建、ES细胞打靶、筛选、显微注射、小鼠鉴定等一系列较为复杂的操作步骤，并且成本较高、周期较长，大大限制了这一技术的应用。针对同源重组的缺点，科学家一直在探索用其它更简便的技术来实现基因敲除。先后发明了ENU随机突变、基因捕获、ES细胞基因敲除细胞库等方法和手段，但由于技术手段和操作成本的限制，这些技术都不能完全替代传统的同源重组技术。2009年以后出现了一系列新的基因编辑技术，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，开创了基因敲除(敲入)新的时代。这些新基因编辑技术作用原理相似，即通过核酸酶在目的基因的DNA双链上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制以同源重组或者非同源末端连接的方式实现修复，进而达到基因失活的目的。作为一种最新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是通过gRNA(又称引导RNA，真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA)识别特异的靶序列,同时引导Cas9核酸酶在DNA的特异位点上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制进行DNA修复。这一过程中可能造成碱基改变,增加，缺失等突变现象，进而实现对目的基因的敲除与修饰。
CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑功能已被成功应用于多种生物，包括人类细胞、斑马鱼、小鼠、大鼠、植物及细菌。众所周知，生物体的一个性状往往由多个基因共同决定。传统的基因敲除费时费力却只能每次敲除一个相关基因，而CRISPR/Cas9系统其中一个最重要的特点便是可在多个不同gRNA的引导下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多个基因组位点。与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有其独特的优势：
1、其RNA-DNA识别机制，避免了DNA甲基化造成的影响。
2、与ZFN和TALEN相比，它有相同或更高的基因编辑效率，尤其在点突变方面优于ZFN或TALEN。
3、设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶表达载体，适用于任何分子生物学实验室。
当前基因编辑技术迅速发展，CRISPR/Cas9技术以其优势将迅速推动基因组功能的研究。快速获取目标gRNA并检测验证其活性将会为科学实验赢得宝贵的时间，并进一步推动这项技术的应用。常规获取gRNA要构建表达载体，需要把gRNA的转录模板连接到载体上，经过涂板、挑选单克隆、摇菌、提取质粒、测序验证，最终还要酶切使质粒线性化才能得到gRNA的体外转录模板，得到gRNA最少也需要3天的时间。本发明旨在迅速获取gRNA的体外转录模板，并在转录后通过体外实验验证其活性及特异性。为后续转染或显微注射筛选有效的gRNA节省了宝贵的时间。
发明内容
本发明的一个目的是提供体外合成目标基因的特异gRNA的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)合成gRNA转录模板的上游引物(单链DNA)、gRNA转录模板的下游引物(单链DNA)和gRNA保守片段(双链DNA)；
所述gRNA保守片段的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述gRNA转录模板的上游引物从5′→3′方向为T7启动子部分片段、gRNA前导片段和核心区域；
所述T7启动子部分片段的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1-20位；
所述前导片段为目标基因的基因组DNA中位于PAM片段上游的20个核苷酸；所述PAM片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；
所述核心区域的核苷酸序列为序列2自5’末端第1-13位，其为gRNA保守片段序列中自5’末端第1-13位的核苷酸组成的DNA分子；
所述下游引物的核苷酸序列为序列表中序列4；
2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述gRNA转录模板的上游引物和所述gRNA转录模板的下游引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为gRNA转录模板；
3)将所述gRNA转录模板进行体外转录得到gRNA，即为目标基因的特异gRNA。
上述方法中，
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述PAM片段为GGG；
所述上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
上述方法中，
在所述步骤3)后还包括步骤4)：体外检测所述特异gRNA活性的步骤；
所述体外检测所述特异gRNA活性的方法包括如下步骤：将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中的gRNA靶片段既不在所述部分片段的正中央，也不在所述部分片段的起始或者末端。这样选择的原因是为了避开剪切后，两条片段不能分开或者虽然可以分开但一条带过小不易观察，具体所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
gRNA靶片段上游片段为在基因组中gRNA靶片段的上游片段；
gRNA靶片段下游片段为在基因组中gRNA靶片段的下游片段。
上述方法中，所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述DNA分子为包含NKp46基因外显子Exon3的部分片段，其核苷酸序列为序列表中序列8；
所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
上述方法中，
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
由上述的方法制备的gRNA也是本发明保护的范围，本发明以NKp46基因外显子Exon3的gRNA为例，但不仅限于该基因的该gRNA的合成与检测，利用该方法设计合成及检测的所有gRNA都是本发明的保护范围。实施例为序列5所示的DNA分子转录得到的RNA。
上述的gRNA在酶切目的基因中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种体外检测上述的特异gRNA活性的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
上述方法中，所述DNA分子为包含NKp46基因外显子Exon3的部分片段，其核苷酸序列为序列表中序列8。
所述gRNA靶片段上游片段大小为804bp；
所述gRNA靶片段下游片段大小为493bp。
本发明的第三个目的是提供成套DNA。
本发明提供的成套DNA，包括上述的gRNA转录模板的上游引物，上述的gRNA转录模板的下游引物和上述的gRNA保守片段。
上述成套DNA用于体外合成目标基因的特异gRNA。
本法的实验证明，本发明提供了gRNA体外快速合成及检测的方法。体外合成：与常规方法相比，不构建gRNA表达载体而是直接利用化学合成，在体外合成一段单链DNA作为模板，通过设计引物，利用PCR技术迅速扩增，得到足够浓度的带有T7promoter的gRNA的转录模板，最终转录纯化得到gRNA。利用这种gRNA快速合成的方法，可以使每次基因编辑仅需合成一段与目的基因互补的一小段DNA链用作上游引物即可，模板和下游引物都是通用的，方便而经济；在效率方面，利用该系统仅需半天时间就可以快速合成需要的gRNA，节约了大量宝贵的时间。体外活性及特异性检测：本发明建立的这种活性及特异性检测方法，可以在体外迅速验证gRNA的其活性及特异性。将Cas9核酸酶、gRNA、PCR扩增的靶基因片段混合孵育，通过琼脂糖凝胶电泳可以十分清楚的观察到剪切位置并通过对电泳照片的灰度比较可以进一步计算剪切效率。
附图说明
图1为上游引物结构示意
图2为gRNA的转录模板结构及转录示意图
图3为体外检测片段扩增及酶切位点示意图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PCR仪(Bio-Rad T100TM Thermal Cycler)、Tanon全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo)、T7转录试剂盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)、RNA纯化试剂盒(MEGAclearTM Kitambion)、PCR产物纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)、无核酸酶水、dNTP mixture、高保真酶Taq酶(sigma)、Cas9核酸酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)
实施例1、体外合成并鉴定有活性gRNA
一、体外合成gRNA
1、gRNA转录模板的制备
gRNA转录模板:用gRNA转录模板扩增上游引物和下游引物扩增gRNA保守片段，得到gRNA转录模板，具体如下：
1)、gRNA靶片段选择及其寡核苷酸链合成
根据文章sgRNAcas9:A Tool for Fast Designing CRISPR sgRNA with HighSpecificity中介绍的方法，设计能够结合NKp46基因第3外显子Exon3的gRNA(20nt)。
引物及gRNA通用模板由Invitrogen(中国)公司合成。
NKp46基因存在于啮齿类动物(大鼠和小鼠)和灵长类动物。同时NKp46是唯一能被小鼠细胞上表达配体所识别的人类NK细胞激活受体。为了研究NKP46基因在病毒感染过程中的作用，希望通过Cas9技术创建NKP46敲除小鼠。
NKp46外显子Exon3的gRNA靶片段由NKp46基因第三外显子Exon3的PAM片段和位于其上游的前导片段组成；PAM片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；前导片段为Exon3中位于PAM片段上游的20个核苷酸；
NKp46基因的外显子Exon3中的PAM片段有多个,gRNA靶片段也有多个。
下面以其中一条gRNA靶片段为例，具体核苷酸序列为序列1自5’末端第62-84位核苷酸，具体见表1，由23个核苷酸组成，其中5’末端起62-81个核苷酸为前导片段，5’末端起82-84个核苷酸为PAM片段GGG，gRNA靶片段为NKp46基因第三外显子Exon3部分片段，该部分片段cDNA的核苷酸序列为序列1。
表1 为gRNA靶片段的核苷酸序列
编号 靶片段(5'-3')
gRNA-1 GGTGAACATCTGGTGTCAGGGGG
2)gRNA转录模板的PCR扩增模板确定
PCR扩增模板为gRNA保守片段，所有gRNA都包括这一段序列，其核苷酸序列为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(序列2)。
3)PCR反应扩增gRNA转录模板的引物设计
(1)PCR扩增gRNA转录模板的上游引物
PCR扩增gRNA转录模板的上游引物由T7启动子部分片段(TAATACGACTCACTATAGGG)、gRNA前导片段和核心区域组成(图1)；
其中，核心区域为gRNA保守片段中序列2自5’末端第1-13位的核苷酸组成的DNA分子，其核苷酸序列为GTTTTAGAGCTAG；
用于PCR扩增gRNA-1转录模板上游引物的核苷酸序列为TAATACGACTCACTATAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAG(序列3)；
序列3中自5’末端第1-20位核苷酸为T7启动子部分片段，自5’末端第19-38位核苷酸为gRNA靶片段的前导片段，自5’末端第39-51为核心区域；
(2)PCR扩增gRNA转录模板的通用下游引物gRNA-R
通用下游引物gRNA-R的核苷酸序列为AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC(序列4)(与部分保守序列反向互补配对)；
4)gRNA转录模板的获得
用上述3)得到的PCR扩增gRNA-1转录模板上游引物和gRNA通用下游引物gRNA-R扩增上述2)的gRNA保守片段，得到gRNA-1转录模板；
上述PCR扩增的反应条件如下：(94℃30s，60℃10s，72℃30s)×35，72℃10min，4℃保存。
取5μL电泳检测PCR产物，gRNA-1转录模板大小为121bp，为目标DNA片段。
经过测序，gRNA-1转录模板的核苷酸序列为TAATACGACTCACTATAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(序列5)；
从上述可以看出，gRNA转录模板由T7启动子部分片段(序列5自5’末端第1-20位核苷酸)、前导片段(序列5自5’末端第19-38位核苷酸)、gRNA保守片段(序列5自5’末端第39-121位核苷酸)，图2为gRNA的转录模板结构及转录示意图，其中图2B gRNA DNA模板合成过程:首先是下游引物结合，一个循环后，上游引物才发挥作用，35个循环后得到足够浓度的带有T7promoter的gRNA的DNA转录模板。
2、体外转录得到gRNA
将上述1扩增得到的gRNA-1转录模板利用纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)进行gRNA转录模板的纯化。将纯化后的产物用T7RNAkit转录试剂盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)进行NKp46gRNA体外转录并利用RNA纯化试剂盒(MEGAclearTM Kit ambion)将转录产物进行纯化，得到gRNA-1(其核苷酸序列为将序列5中自5’末端第18个碱基开始后的T变为U得到的序列)，通过NanoDrop 2000超微量分光光度计检测浓度为119.3ng/μL分装并-80℃冻存。
二、gRNA体外活性检测鉴定目标gRNA
1、检测活性DNA片段的制备
检测活性DNA片段为目标基因中一段含有gRNA靶片段的DNA分子(基因组DNA上的序列)，可以通过PCR扩增，但注意不要使gRNA靶点位于目标基因的中间，因为酶切检测后相同大小的两个片段无法分开，即检测活性DNA片段中gRNA靶片段上游片段和gRNA靶片段下游片段大小一致，且均不为0。
在本发明的实施例中，目标基因为NKp46基因外显子Exon3，检测活性DNA片段扩增引物如下：
上游引物：mNk46_gSF TCCAAACACGTGCATGTTACACATG(序列6)，
下游引物：mNk46_gSR CCCAGCTTTGACTCTCTTGTCCATC(序列7)
以C57小鼠基因组DNA作为模板，利用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到含有gRNA-1靶片段的DNA片段(为位于NKp46基因外显子Exon3的部分片段，其为序列8，其中自5’末端第786-808位核苷酸为靶片段)，作为体外酶切检测的检测活性DNA片段。
2、体外活性检测
将实施例1得到的gRNA-1、Cas9核酸酶和含有gRNA-1靶片段的DNA片段混合孵育酶切(37℃30min，65℃5min)，得到酶切产物1；
上述酶切反应体系如表2所示，
表2 为酶切反应体系
上述酶切条件为37℃30min，65℃5min。
电泳酶切产物结果如图3所示，其中，图3A显示小鼠NKP46基因有7个外显子，靶点设计在Exon3上；图3B为酶切电泳图，酶切前表示扩增的小鼠NKP46基因片段大小，gRNA原浓度119.3ng/μL；酶切后1为gRNA-1原浓度的酶切结果，酶切后2为1/2gRNA-1浓度的酶切图。可以看出，gRNA-1可以切开NKP46基因，使得全长1297bp检测条带被切成两条带，大小分别为804bp和493bp，与DNA分子中gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，为目标gRNA，可引导Cas9核酸酶在NKP46基因的靶点位置切开。
通过对灰度的计算(图3B),计算得到转录后原浓度的gRNA以及稀释一倍的gRNA，剪切效率都为100％，由此可以证明该方法设计合成gRNA特异性及活性较高，同时体外检测快速检测的方法大大提高了gRNA检测的效率。

Claims (9)

1.一种体外合成目标基因的特异gRNA的方法，包括如下步骤：
1)合成gRNA转录模板的上游引物、gRNA转录模板的下游引物和gRNA保守片段；
所述gRNA保守片段的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述gRNA转录模板的上游引物从5′→3′方向为T7启动子部分片段、gRNA前导片段和核心区域；
所述T7启动子部分片段的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1-20位；
所述前导片段为目标基因的基因组DNA中位于PAM片段上游的20个核苷酸；所述PAM片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；
所述核心区域的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-13位；
所述下游引物的核苷酸序列为序列表中序列4；
2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述gRNA转录模板的上游引物和所述gRNA转录模板的下游引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为gRNA转录模板；
3)将所述gRNA转录模板进行体外转录得到gRNA，即为目标基因的特异gRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述PAM片段为GGG；
所述上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤3)后还包括步骤4)：体外检测所述特异gRNA活性的步骤；
所述体外检测所述特异gRNA活性的方法包括如下步骤：将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列8；
所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的gRNA。
6.权利要求5所述的gRNA在酶切目的基因中的应用。
7.一种体外检测权利要求5所述gRNA活性的方法，包括如下步骤：
将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述DNA分子核苷酸序列为序列表中序列8。
9.成套DNA，包括权利要求1-4中任一所述的gRNA转录模板的上游引物，权利要求1-4中任一所述的gRNA转录模板的下游引物和权利要求1-4中任一所述的gRNA保守片段。
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