JP2018519790A - バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ｅｓｔ−ｓｓｒマーカーとその特異的プライマーおよび検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーとその特異的プライマーおよび検出方法を開示する。当該検出方法は、バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、本発明のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを使用してマイクロサテライト部位での配列に対してＰＣＲ増幅を行なってから、シークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングする。本発明に供されるバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーおよび検出方法は、バナメイエビ種群遺伝構造解析および分子マーカー補助育種に適用可能であり、特にバナメイエビの塩分抵抗性の良好な品種の選択的育種において重要な応用価値を有する。【選択図】図１
Description
本発明は、分子マーカー技術分野に関し、具体的に、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーとその特異的プライマーおよび検出方法に関する。
バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）は、南米白エビと通称され、南アメリカ原産であり、メキシコの西南沿海からペルーの西部の太平洋沿岸にかけて分布し、世界最大生産量の養殖クルマエビである。我が国では、バナメイエビの養殖領域が全国沿海の海水養殖区および内陸の淡水養殖区に亘っており、我が国の水産養殖の基幹産業となっている。我が国が導入して繁殖させているバナメイエビは、すべて人工的な繁殖群に属するため、遺伝的衰退が発生しやすい。したがって、優良品種の選別や育成は、我が国のバナメイエビ養殖の成否および産業の持続可能な発展に係わる重大な課題である。
国際的には、分子マーカーをベースとする分子マーカー補助の選択的育種技術が現代の水産育種の肝心な技術となっている。多数の分子マーカーのうち、単純反復配列（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ）は、マイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と別称され、共優性マーカーであり、豊富な多型性、良好な反復性、安定な遺伝およびヘテロ接合体の検出可能性等の利点を有するため、増幅断片長多型（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）やランダム増幅多型（ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）等の技術の不足を補って、現在の水産養殖動物種群遺伝構造研究および遺伝育種分野で幅広く応用されている分子マーカー技術である。
機能ゲノム学の発展とともに、発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ，ＥＳＴｓ）は、ＳＳＲマーカーを開発する重要なリソースになる。ＥＳＴ−ＳＳＲは、新型の分子マーカーとして、従来のＳＳＲマーカーの利点のほか、転写区の相違を反映するため、その多型性が遺伝子機能に直接関係する可能性がある。したがって、従来のＳＳＲマーカーよりも、ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、分子マーカー補助による選択的育種の分野においてより高度な応用価値を有する。しかし、これまで、バナメイエビのＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの開発は少なく、特定機能遺伝子に関連するＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの開発はいまだ存在しない。
本発明の第１の目的は、バナメイエビの分子マーカー補助育種に重要な応用価値を有するバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーを提供することにある。
本発明は、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーを提供する。前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１を含む。
前記Ｌｖ−Ｏｓ００１のヌクレオチド配列は配列番号１に示され、前記Ｌｖ−Ｏｓ００５のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、前記Ｌｖ−Ｏｓ００６のヌクレオチド配列は配列番号３に示され、前記Ｌｖ−Ｏｓ００７のヌクレオチド配列は配列番号４に示され、前記Ｌｖ−Ｏｓ０１１のヌクレオチド配列は配列番号５に示される。
本発明の第２の目的は、上記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを提供することにある。前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーは、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡ−３’と、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧ−３’と、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＣＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’，Ｒ：５’−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴＡ−３’と、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’，Ｒ：５’−ＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ−３’と、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣ−３’，Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴ−３’と、を含む。
本発明の第３の目的は、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの検出方法を提供することにある。当該検出方法は、以下のステップを含む。つまり、バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップ（１）と、ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、上述したバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのうち、それぞれのＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを利用して、ＰＣＲ増幅をそれぞれ行うステップ（２）と、シークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップ（３）と、を含む。
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ（ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｇ２＋）と、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬと、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬと、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬと、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬと、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬと、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬと、の合計２５μＬである。
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の増幅反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、上記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度で３０秒間アニール処理し、７２℃で３０秒間伸長し、それを３５サイクル行うことと、７２℃で６分間伸長することとを含む。前記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度は、それぞれ、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７：６０℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ０１１：６０℃である。
上記発明の目的を果すために、本発明は、トランスクリプトームによりシーケンシングされたバナメイエビＥＳＴ配列を利用してバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーを開発するとともに、多型性プライマーを提供し、バナメイエビ機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー開発の技術システムを確立する。これにより、バナメイエビ遺伝の多様性研究、遺伝地図の構築および進化解析に基礎を定めたうえで、バナメイエビの優良品種の選択的育種に対して価値のある分子マーカーを与える。
本発明では、トランスクリプトームシーケンシングで得られたバナメイエビＥＳＴ配列から、ＢＬＡＳＴ照合により浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ配列を選別し、ＭＩＳＡソフトウェアによりマイクロサテライト部位検索を行うことにより、マイクロサテライト部位でのバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子を有する１１個のＥＳＴ配列を取得する。Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ソフトウェアを利用して、選別された１１個のＥＳＴ配列の１２個のＳＳＲ部位について１２対のプライマーを設計し、これらの１２対のプライマーを利用してバナメイエビのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行う。その中、９対のプライマーが安定して目的ストリップまで増幅させた。３７３０ＸＬシークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングし、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ３．２ソフトウェアを使用して等位遺伝子断片の具体的な数値を判読し、高度な多型性を有するバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーを最終的に５個特定した。マイクロサテライト部位は、それぞれＬｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１〜５に示される。
本発明のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを使用して２４個のバナメイエビサンプルを検出したところ、５個のＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは何れも高度な多型性を有する。それは、本発明の５個のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーがバナメイエビ種群遺伝構造解析および分子マーカー補助育種に適用可能であり、特にバナメイエビの塩分抵抗性に優れた品種の選択的育種において重要な応用価値を有することを表明している。
以下の実施例は、本発明の更なる説明であり、本発明の制限にならない。
下記実施例における実験方法は、特別な説明がない限り、何れも常套な方法または試薬箱の使用説明書に従って行われる。下記実施例で用いられる材料、試薬等は、特別な説明がない限り、何れもビジネスルートを介して取得可能である。トランスクリプトームシーケンシングは華大遺伝子有限会社によって実施され、他のシーケンシングおよびプライマー合成作業は上海生物工学有限会社によって実施される。
（実施例１）
１、バナメイエビのトランスクリプトームシーケンシングおよび配列照合
１、バナメイエビのトランスクリプトームシーケンシングおよび配列照合
１．１ トランスクリプトームシーケンシング
バナメイエビの筋肉、肝・膵臓、鰓および腸組織をそれぞれ取り、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴａＫａＲａ）で処理する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ濃度を特定し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡの質量を評価する。４種の異なる組織サンプルから抽出されたＲＮＡを等量に混合した後、ｍＲＮＡ富化、ｍＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ合成、末端修復、「Ａ」テール付加およびシーケンシングアダプタ接続等の工程を経てｃＤＮＡライブラリを確立する。ＩＩＩｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００ハイスループットシーケンシングプラットフォームを用いてｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、ｓｅｑＣｌｅａｎおよびＬｕｃｙソフトウェアを用いてアダプタ配列および低質量配列を除去して高質量の配列データを取得し、Ｔｒｉｎｉｔｙ法により配列組立を行う。
バナメイエビの筋肉、肝・膵臓、鰓および腸組織をそれぞれ取り、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＴａＫａＲａ）で処理する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ濃度を特定し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡの質量を評価する。４種の異なる組織サンプルから抽出されたＲＮＡを等量に混合した後、ｍＲＮＡ富化、ｍＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ合成、末端修復、「Ａ」テール付加およびシーケンシングアダプタ接続等の工程を経てｃＤＮＡライブラリを確立する。ＩＩＩｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００ハイスループットシーケンシングプラットフォームを用いてｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、ｓｅｑＣｌｅａｎおよびＬｕｃｙソフトウェアを用いてアダプタ配列および低質量配列を除去して高質量の配列データを取得し、Ｔｒｉｎｉｔｙ法により配列組立を行う。
１．２ ＥＳＴ配列照合
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）によりＥＳＴ配列を照合して、各ＥＳＴ配列の所属する遺伝子名を特定する。
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）によりＥＳＴ配列を照合して、各ＥＳＴ配列の所属する遺伝子名を特定する。
２、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴの選別およびマイクロサテライト部位検索
文献で報告された浸透圧調節関連機能遺伝子情報により、トランスクリプトームライブラリから浸透圧調節関連機能遺伝子のＥＳＴ配列を選別する。ＭＩＳＡソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｇｒｃ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ｍｉｓａ／）を用いて、両ヌクレオチド重複ｎ≧５、三ヌクレオチド重複ｎ≧４および四ヌクレオチド重複ｎ≧３という基準にしたがって、選別された浸透圧調節関連機能遺伝子のＥＳＴ配列に対してマイクロサテライト部位検索を行って、マイクロサテライト部位を有する浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ配列を１１個取得する。
３、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカープライマーの設計
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ソフトウェアを用いて、選別された１１個のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ配列の１２個のＳＳＲ部位についてＳＳＲプライマー設計を行う。プライマー設計の条件は、プライマー長が１８−２４ｂｐであり、ＧＣ含有量が４０−６０％であり、Ｔｍ値が５０−６２℃であり、上下流プライマーのＴｍ値の差が５以下であり、且つ、プライマーダイマー、ヘアピン構造およびミスマッチ等をできるだけ回避し、増幅産物の長さが１００−５５０ｂｐである。トータルで１２対のＥＳＴ−ＳＳＲプライマーを設計し合成する。プライマー配列を、表１に示す。
表１．バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカープライマー特性表
４、バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカープライマーの選別と結果分析
４．１ バナメイエビのゲノムＤＮＡの抽出
広東の深セン、珠海、湛江、徐聞および茂名等における２４の養殖場からのバナメイエビを２４個選択し、筋肉組織をそれぞれ取る。海洋動物組織ゲノムＤＮＡ抽出試薬箱（天根生化科技有限会社、北京）を用いてバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出し、その操作手順をきちんと説明書に従って行う。ゲノムＤＮＡ定量化をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計で実施し、質量をアガロース電気泳動で検出する。
広東の深セン、珠海、湛江、徐聞および茂名等における２４の養殖場からのバナメイエビを２４個選択し、筋肉組織をそれぞれ取る。海洋動物組織ゲノムＤＮＡ抽出試薬箱（天根生化科技有限会社、北京）を用いてバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出し、その操作手順をきちんと説明書に従って行う。ゲノムＤＮＡ定量化をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計で実施し、質量をアガロース電気泳動で検出する。
４．２ プライマーの初期選別
上記抽出されたバナメイエビのゲノムＤＮＡから、１つのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてランダムに抽出し、表１における１２対のプライマーをそれぞれ用いて当該ゲノムＤＮＡテンプレートに対してＰＣＲ勾配増幅を行う。その反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｇ２＋）２．５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬ、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬ、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬ、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬ、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬ、の合計２５μＬである。反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、３０秒間アニール処理（アニール温度は４８℃から６２℃）し、７２℃で３０秒間伸長し、それを合計３５サイクル行うことと、７２℃で再び６分間伸長することである。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロース電気泳動を経て検出すると、９対のプライマーが特定のアニール温度で安定して単一のストリップまで増幅可能であることが示される。それぞれの増幅産物に対してシーケンシングを行ったところ、当該９対のプライマーが何れも目的のストリップまで増幅可能であることが示される。マイクロサテライト部位は、それぞれ、Ｌｖ−Ｏｓ００１（配列番号１に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００２、Ｌｖ−Ｏｓ００４、Ｌｖ−Ｏｓ００５（配列番号２に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００６（配列番号３に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００７（配列番号４に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００９、Ｌｖ−Ｏｓ０１１（配列番号５に示す）およびＬｖ−Ｏｓ０１２である。
上記抽出されたバナメイエビのゲノムＤＮＡから、１つのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてランダムに抽出し、表１における１２対のプライマーをそれぞれ用いて当該ゲノムＤＮＡテンプレートに対してＰＣＲ勾配増幅を行う。その反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｇ２＋）２．５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬ、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬ、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬ、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬ、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬ、の合計２５μＬである。反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、３０秒間アニール処理（アニール温度は４８℃から６２℃）し、７２℃で３０秒間伸長し、それを合計３５サイクル行うことと、７２℃で再び６分間伸長することである。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロース電気泳動を経て検出すると、９対のプライマーが特定のアニール温度で安定して単一のストリップまで増幅可能であることが示される。それぞれの増幅産物に対してシーケンシングを行ったところ、当該９対のプライマーが何れも目的のストリップまで増幅可能であることが示される。マイクロサテライト部位は、それぞれ、Ｌｖ−Ｏｓ００１（配列番号１に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００２、Ｌｖ−Ｏｓ００４、Ｌｖ−Ｏｓ００５（配列番号２に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００６（配列番号３に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００７（配列番号４に示す）、Ｌｖ−Ｏｓ００９、Ｌｖ−Ｏｓ０１１（配列番号５に示す）およびＬｖ−Ｏｓ０１２である。
４．３ 多型性プライマーの選別および結果分析
上記初期選別された９対のプライマーの上流プライマーの５’端に対して、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸあるいはＴＡＭＲＡを用いて蛍光マーカーを行い、上記抽出された２４個のバナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行う。反応系の組成は上記ステップ４．２のプライマーの初期選別における反応系の組成と同じであり、反応手順はアニール温度を除いて上記ステップ４．２のプライマーの初期選別における反応手順と同様である。各プライマーに対応するアニール温度の詳細は表１に示す。ＰＣＲ増幅産物を、まず２％アガロース電気泳動で検出し、次に３７３０ＸＬシークエネーターを用いてタイピングを行い、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ３．２ソフトウェアを用いて等位遺伝子断片の具体値を判読し、多型性を有するバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー（図１−５を参照）が５個特定された。マイクロサテライト部位は、それぞれ、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１、２、３、４および５に示される。
上記初期選別された９対のプライマーの上流プライマーの５’端に対して、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸあるいはＴＡＭＲＡを用いて蛍光マーカーを行い、上記抽出された２４個のバナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行う。反応系の組成は上記ステップ４．２のプライマーの初期選別における反応系の組成と同じであり、反応手順はアニール温度を除いて上記ステップ４．２のプライマーの初期選別における反応手順と同様である。各プライマーに対応するアニール温度の詳細は表１に示す。ＰＣＲ増幅産物を、まず２％アガロース電気泳動で検出し、次に３７３０ＸＬシークエネーターを用いてタイピングを行い、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ３．２ソフトウェアを用いて等位遺伝子断片の具体値を判読し、多型性を有するバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー（図１−５を参照）が５個特定された。マイクロサテライト部位は、それぞれ、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１、２、３、４および５に示される。
Ｐｏｐｇｅｎｅ ３２ソフトウェアを用いてヘテロ接合度の期待値およびヘテロ接合度の観測値を算出し、ＰＩＣ Ｃａｌｃ ０．６ソフトウェアを用いて多型情報含有値（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ＰＩＣ）を算出する。結果として、上記５個の多型性バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの等位遺伝子数はそれぞれ９、５、５、５および８であり、ヘテロ接合度の観測値はそれぞれ０．１６６７、０．６６６７、０．６２５０、０．４１６７および０．９１６７であり、ヘテロ接合度の期待値はそれぞれ０．８９０１、０．７５７１、０．７８２８、０．７１７２および０．７７１３であり、ＰＩＣはそれぞれ０．８５７８、０．６９７７、０．７２８５、０．６６１０および０．７１９０（表２）であり、いずれも０．５よりも大きい。それは、これらの５個のＥＳＴ−ＳＳＲマーカーが何れも高度な多型性を有し、バナメイエビ種群遺伝構造解析および分子マーカー補助育種に適用可能であることを意味する。バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子の大半がバナメイエビの塩分抵抗に関連するため、これらの５個のＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、バナメイエビの塩分抵抗性に優れた品種の選択的育種において重要な応用価値を有する。
表２．バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー特性表
（付記）
（付記１）
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１を含み、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００１のヌクレオチド配列は配列番号１に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００５のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００６のヌクレオチド配列は配列番号３に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００７のヌクレオチド配列は配列番号４に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ０１１のヌクレオチド配列は配列番号５に示されることを特徴とする、
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー。
（付記１）
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１を含み、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００１のヌクレオチド配列は配列番号１に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００５のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００６のヌクレオチド配列は配列番号３に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００７のヌクレオチド配列は配列番号４に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ０１１のヌクレオチド配列は配列番号５に示されることを特徴とする、
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー。
（付記２）
付記１に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーは、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＣＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’，Ｒ：５’−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’，Ｒ：５’−ＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣ−３’，Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴ−３’と、を含むことを特徴とする、
特異的プライマー。
付記１に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーは、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＣＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’，Ｒ：５’−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’，Ｒ：５’−ＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣ−３’，Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴ−３’と、を含むことを特徴とする、
特異的プライマー。
（付記３）
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの検出方法であって、
バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップ（１）と、
ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、付記２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのうち、それぞれのＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを利用して、ＰＣＲ増幅をそれぞれ行うステップ（２）と、
シークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップ（３）と、を含むことを特徴とする、
検出方法。
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの検出方法であって、
バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップ（１）と、
ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、付記２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのうち、それぞれのＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを利用して、ＰＣＲ増幅をそれぞれ行うステップ（２）と、
シークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップ（３）と、を含むことを特徴とする、
検出方法。
（付記４）
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬと、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬと、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬと、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬと、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬと、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬと、の合計２５μＬであることを特徴とする、付記３に記載の検出方法。
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬと、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬと、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬと、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬと、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬと、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬと、の合計２５μＬであることを特徴とする、付記３に記載の検出方法。
（付記５）
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の増幅反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、付記２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度で３０秒間アニール処理し、７２℃で３０秒間伸長し、それを３５サイクル行うことと、７２℃で６分間伸長することとを含み、
前記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度は、それぞれ、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７：６０℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ０１１：６０℃であることを特徴とする、
付記３または４に記載の検出方法。
前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の増幅反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、付記２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度で３０秒間アニール処理し、７２℃で３０秒間伸長し、それを３５サイクル行うことと、７２℃で６分間伸長することとを含み、
前記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度は、それぞれ、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７：６０℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ０１１：６０℃であることを特徴とする、
付記３または４に記載の検出方法。
Claims (5)
- バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーは、Ｌｖ−Ｏｓ００１、Ｌｖ−Ｏｓ００５、Ｌｖ−Ｏｓ００６、Ｌｖ−Ｏｓ００７およびＬｖ−Ｏｓ０１１を含み、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００１のヌクレオチド配列は配列番号１に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００５のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００６のヌクレオチド配列は配列番号３に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ００７のヌクレオチド配列は配列番号４に示され、
前記Ｌｖ−Ｏｓ０１１のヌクレオチド配列は配列番号５に示されることを特徴とする、
バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカー。 - 請求項１に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーであって、
前記ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーは、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ−３’，Ｒ：５’−ＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＣＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣ−３’，Ｒ：５’−ＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴＡ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’，Ｒ：５’−ＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ−３’と、
マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１１での特異的プライマー：Ｆ：５’−ＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣ−３’，Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴ−３’と、を含むことを特徴とする、
特異的プライマー。 - バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの検出方法であって、
バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップ（１）と、
ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、請求項２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのうち、それぞれのＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーを利用して、ＰＣＲ増幅をそれぞれ行うステップ（２）と、
シークエネーターを利用してＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップ（３）と、を含むことを特徴とする、
検出方法。 - 前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の反応系の組成は、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２２．０μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ０．５μＬと、５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬと、１０μＭ フォワードプライマー０．５μＬと、１０μＭ リバースプライマー０．５μＬと、２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート０．５μＬと、ｄｄＨ２Ｏ１８．３μＬと、の合計２５μＬであることを特徴とする、請求項３に記載の検出方法。
- 前記ステップ（２）でのＰＣＲ増幅の増幅反応手順は、９５℃で３分間予め変性することと、９５℃で３０秒間変性し、請求項２に記載のバナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度で３０秒間アニール処理し、７２℃で３０秒間伸長し、それを３５サイクル行うことと、７２℃で６分間伸長することとを含み、
前記バナメイエビ浸透圧調節関連機能遺伝子ＥＳＴ−ＳＳＲマーカーの特異的プライマーのアニール温度は、それぞれ、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００１：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００５：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００６：５５℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ００７：６０℃、マイクロサテライト部位Ｌｖ−Ｏｓ０１１：６０℃であることを特徴とする、
請求項３または４に記載の検出方法。
Applications Claiming Priority (3)
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