CN105969873B - 凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因est-ssr标记及其特异性引物和检测方法 - Google Patents

凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因est-ssr标记及其特异性引物和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST‑SSR标记及其特异性引物和检测方法。以凡纳滨对虾基因组DNA为模板，使用本发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST‑SSR标记的特异性引物对微卫星位点序列进行PCR扩增，然后利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。本发明提供的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST‑SSR标记的特异性引物及检测方法，可用于凡纳滨对虾种群遗传结构分析和分子标记辅助育种，特别是在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具有重要的应用价值。

Description

凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记及其特异 性引物和检测方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法。
背景技术：
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，原产于南美洲，从墨西哥西南沿海至秘鲁西部的太平洋沿岸均有分布，是全世界产量最大的养殖对虾。在我国，凡纳滨对虾养殖区域遍布于全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区，是我国水产养殖的支柱性产业。我国引进和繁育的凡纳滨对虾均是人工繁育群体，易产生遗传衰退。因此，良种选育是关系到我国凡纳滨对虾养殖成败和产业可持续发展的重大问题。
在国际上，以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术已成为当代水产育种的关键技术。在众多分子标记中，简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)又称微卫星(microsatellite)，为共显性标记，具有多态性丰富、重复性好、遗传稳定和可检测杂合子等优点，弥补了扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和随机扩增多态性(random amplified polymorphic DNA,RAPD)等技术的不足，是目前在水产养殖动物种群遗传结构研究和遗传育种领域应用较广泛的分子标记技术。
随着功能基因组学的发展，表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记，除具有传统SSR标记的优点外，因其反映的是转录区的差异，其多态性可能与基因功能直接相关。因此，与传统的SSR标记相比，EST-SSR标记在分子标记辅助选择育种领域具有更高的应用价值。然而，迄今为止，凡纳滨对虾EST-SSR标记的开发较少，尚无与特定功能基因相关联的EST-SSR标记的开发。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中具有重要应用价值的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记。
本发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记，其特征在于，所述的EST-SSR标记包括Lv-Os001、Lv-Os005、Lv-Os006、Lv-Os007和Lv-Os011；
所述的Lv-Os001的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的Lv-Os005的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的Lv-Os006的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的Lv-Os007的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的Lv-Os011的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供上述凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物，所述的EST-SSR标记的特异性引物包括：微卫星位点Lv-Os001特异性引物：F：5’-TTGCACAATATGTTTGAAGGTGT-3’，R：5’-AGCATGACATAGTCTCTGAAGCA-3’；微卫星位点Lv-Os005特异性引物：F：5’-AAAATCCCAAGTAACTGACAAAAA-3’，R：5’-AGGAAAGTTAACTGCAGGTTTGG-3’；微卫星位点Lv-Os006特异性引物：F：5’-CGAAAATGGGTAGTGTTTTCATC-3’，R：5’-GGCCGATGGACTCCTATAAGTA-3’；微卫星位点Lv-Os007特异性引物：F：5’-TCTCCAGCCGTGAAGAAAGG-3’，R：5’-TTCACAGATGGAAGGGGAGG-3’；微卫星位点Lv-Os0011特异性引物：F：5’-GTTTCCAGCAGCAGTATCAAGC-3’，R：5’-TGCTCGCTTGCTTTCTTGCT-3’。
本发明的第三个目的是提供一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用上述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物中的每个EST-SSR标记的特异性引物分别进行PCR扩增；
(3)、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
所述的步骤(2)中的PCR扩增，其反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL(withoutMg2+)，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM正向引物0.5μL，10μM反向引物0.5μL，25ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 18.3μL，共计25μL。
所述的步骤(2)中的PCR扩增，其扩增反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，按上述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸6分钟；所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物的退火温度分别为：微卫星位点Lv-Os001：55℃，微卫星位点Lv-Os005：55℃，微卫星位点Lv-Os006：55℃，微卫星位点Lv-Os007：60℃，微卫星位点Lv-Os011：60℃。
为实现上述发明目的，本发明利用通过转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列，开发凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记，并提供多态性引物，建立凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记开发的技术体系，不仅将为凡纳滨对虾遗传多样性研究、遗传图谱构建和进化分析奠定基础，还将为凡纳滨对虾优良品种的选育提供有价值的分子标记。
本发明通过从转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列中通过BLAST比对筛选渗透压调节相关功能基因EST序列，并通过MISA软件进行微卫星位点查找，获得了11个含有微卫星位点的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因的EST序列。采用Primer Premier 5软件，针对筛选出的11个EST序列的12个SSR位点设计了12对引物，并利用这12对引物对凡纳滨对虾的基因组DNA进行PCR扩增，其中有9对引物稳定扩增出目的条带。利用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并使用GeneMapper 3.2软件判读等位基因片段的具体数值，最终确定了5个具有高度多态性的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记，微卫星位点为：Lv-Os001、Lv-Os005、Lv-Os006、Lv-Os007和Lv-Os011；其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～5所示。
利用本发明的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的特异性引物对24个凡纳滨对虾样本进行检测，结果表明：5个EST-SSR标记均具有高度多态性。说明本发明的5个凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记可用于凡纳滨对虾种群遗传结构分析和分子标记辅助育种，特别是在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具有重要的应用价值。
附图说明：
图1是Lv-Os001位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个样品；
图2是Lv-Os005位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个样品；
图3是Lv-Os006位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个样品；
图4是Lv-Os007位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个样品；
图5是Lv-Os011位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个样品。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。转录组测序由华大基因有限公司完成，其他测序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。
实施例1
1、凡纳滨对虾转录组测序及序列比对
1.1转录组测序
分别取凡纳滨对虾肌肉、肝胰腺、鳃和肠组织，用RNAiso Plus(TaKaRa,Japan)提取总RNA，并用DNase I(TaKaRa)处理。采用NanoDropTM2000分光光度计(Thermo ScientificWaltham,MA,USA)测定RNA浓度，并用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,CA,USA)评价RNA的质量。将从4种不同组织样品中提取的RNA等量混合后，经mRNA富集、mRNA片段化、cDNA合成、末端修复、加“A”尾和测序接头连接等工序建立cDNA文库。采用IIIuminaHiSeq2000高通量测序平台对cDNA文库进行测序，采用seqClean和Lucy软件去掉接头序列及低质量序列，获得高质量的序列数据，并用Trinity法进行序列组装。
1.2EST序列比对
通过NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对EST序列进行比对，确定每个EST序列隶属的基因名称。
2、凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST的筛选及微卫星位点查找
根据文献报道的渗透压调节相关功能基因信息，从转录组文库中筛选出渗透压调节相关功能基因的EST序列。采用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)，按照两核苷酸重复n≥5，三核苷酸重复n≥4和四核苷酸重复n≥3的标准对筛选出的渗透压调节相关功能基因的EST序列进行微卫星位点查找，获得11个含有微卫星位点的渗透压调节相关功能基因EST序列。
3、凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物的设计
采用Primer Premier 5软件，针对筛选出的11个凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST序列的12个SSR位点进行SSR引物设计。引物设计的要求为：引物长度18-24bp，GC含量为40-60％，Tm值为50-62℃，上下游引物的Tm值之差不大于5，并尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配等；扩增产物长度为100-550bp。共设计和合成12对EST-SSR引物，引物序列见表1。
表1.凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物特性表
Figure BDA0001016184370000061
Figure BDA0001016184370000071
4、凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记引物的筛选及结果分析
4.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取
选取来自于广东深圳、珠海、湛江、徐闻和茂名等地24个养殖场的凡纳滨对虾24尾，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
4.2引物的初步筛选
从上述提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机抽取一份做模板，分别采用表1中的12对引物对该基因组DNA模板进行PCR梯度扩增，其反应体系为：10×PCR buffer(withoutMg2+)2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL，25ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 18.3μL，共计25μL。反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，退火(退火温度从48℃到62℃)30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳检测，显示有9对引物在特定退火温度下能稳定扩增出单一条带。分别对扩增产物进行测序，结果显示该9对引物均可扩增出目的条带，微卫星位点分别为：Lv-Os001(如SEQ ID NO.1所示)、Lv-Os002、Lv-Os004、Lv-Os005(如SEQ ID NO.2所示)、Lv-Os006(如SEQ ID NO.3所示)、Lv-Os007(如SEQID NO.4所示)、Lv-Os009、Lv-Os011(如SEQ ID NO.5所示)和Lv-Os012。
4.3多态性引物的筛选及结果分析
对上述初步筛选出的9对引物的上游引物的5’端分别用FAM、HEX或TAMRA进行荧光标记，以上述提取的24个凡纳滨对虾基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系与上述步骤4.2引物的初步筛选中的反应体系相同，反应程序除退火温度外均与上述步骤4.2引物的初步筛选中的反应程序一致，各引物对应的退火温度详见表1。PCR扩增产物先用2％琼脂糖电泳进行检测，后采用3730XL测序仪进行分型，并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值，确定了5个具有多态性的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记(见图1-5)，微卫星位点分别为：Lv-Os001、Lv-Os005、Lv-Os006、Lv-Os007和Lv-Os011，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4和5所示。
使用Popgene 32软件计算期望杂合度和观察杂合度，使用PIC Calc 0.6软件计算多态性信息含量(polymorphic information content,PIC)。结果表明：上述5个多态性凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的等位基因数分别为9、5、5、5和8个；观测杂合度分别为0.1667、0.6667、0.6250、0.4167和0.9167；期望杂合度分别为0.8901、0.7571、0.7828、0.7172和0.7713；PIC值分别为0.8578、0.6977、0.7285、0.6610和0.7190(表2)，均大于0.5，说明这5个EST-SSR标记均具有高度多态性，可用于凡纳滨对虾种群遗传结构分析和分子标记辅助育种。由于凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因大多数与凡纳滨对虾盐度抗逆相关，因此，这5个EST-SSR标记在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具有重要的应用价值。
表2.凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记特性表
Figure BDA0001016184370000091
Figure IDA0001016184460000011
Figure IDA0001016184460000021
Figure IDA0001016184460000031

Claims (4)

1.一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记组的特异性引物组，其特征在于，所述的EST-SSR标记组包括Lv-Os001、Lv-Os005、Lv-Os006、Lv-Os007和Lv-Os011；
所述的Lv-Os001的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述的Lv-Os005的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
所述的Lv-Os006的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述的Lv-Os007的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
所述的Lv-Os011的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
所述的EST-SSR标记组的特异性引物组包括：
微卫星位点Lv-Os001特异性引物：F：5’-TTGCACAATATGTTTGAAGGTGT-3’，R：5’-AGCATGACATAGTCTCTGAAGCA-3’；
微卫星位点Lv-Os005特异性引物：F：5’-AAAATCCCAAGTAACTGACAAAAA-3’，R：5’-AGGAAAGTTAACTGCAGGTTTGG-3’；
微卫星位点Lv-Os006特异性引物：F：5’-CGAAAATGGGTAGTGTTTTCATC-3’，R：5’-GGCCGATGGACTCCTATAAGTA-3’；
微卫星位点Lv-Os007特异性引物：F：5’-TCTCCAGCCGTGAAGAAAGG-3’，R：5’-TTCACAGATGGAAGGGGAGG-3’；
微卫星位点Lv-Os0011特异性引物：F：5’-GTTTCCAGCAGCAGTATCAAGC-3’，R：5’-TGCTCGCTTGCTTTCTTGCT-3’。
2.一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
（2）、以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记组的特异性引物组中的每个EST-SSR标记的特异性引物分别进行PCR扩增；
（3）、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的PCR扩增，其反应体系为：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mM MgCl2 2.0 μL，10 mM dNTPs 0.5 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2 μL，10 μM 正向引物0.5 μL，10 μM 反向引物0.5 μL，25 ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 18.3 μL，共计25 μL。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的PCR扩增，其扩增反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，按权利要求1所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记组的特异性引物组的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸6分钟；所述的凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记组的特异性引物组的退火温度分别为：微卫星位点Lv-Os001：55℃，微卫星位点Lv-Os005：55℃，微卫星位点Lv-Os006：55℃，微卫星位点Lv-Os007：60℃，微卫星位点Lv-Os011：60℃。
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