CN116064507B - 大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段、遗传性别标记引物及应用 - Google Patents

大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段、遗传性别标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段、遗传性别标记引物及应用；特异性DNA片段分别为下列之一：Contig‑1上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Contig‑1下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Contig‑2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Contig‑2下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；大刺鳅性别鉴定的遗传性别标记引物，其为引物对1，包括Contig‑1上游引物和Contig‑1下游引物。将该特异性DNA片段及遗传性别标记引物应用于大刺鳅全雄性育种。本发明适用范围广、耗时短，检测结果准确。

Description

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段、遗传性别标记引物及应用
技术领域
本发明属于生物遗传基因和鱼类性别鉴定技术，具体涉及一种大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段、遗传性别标记引物及应用。
背景技术
近年来，随着测序技术的发展日益趋于成熟，目前许多动物的性别标记开发已经被广泛应用于尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等。但是这些分子标记开发主要是通过随机扩增多态DNA（Random amplified polymorphic DNA, RAPD）、微卫星标记（Simple sequence repeat, SSR）、单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphic, SNP）等技术获得，这些遗传性别分子标记的开发具有价格昂贵、工作量大的特点。而重测序技术为遗传性别标记的开发提供了一种高效手段，目前通过重测序技术方法已成功开发出应用于大刺鳅遗传性别鉴定的特异性分子标记。
大刺鳅（Mastacembelus armatus）隶属于合鳃目（Symbranchiformes）刺鳅科（Mastacembelidae）刺鳅属（Mastacembelus）的一种淡水鱼类，俗称角罗鳅、刀鳅等，主要分布在东南亚多国以及我国广东、广西、福建、海南等地，并且大刺鳅营养丰富、肉质极佳、深受消费者喜爱。大刺鳅的生长过程呈现性别二态性，同龄的商品鱼中，雄鱼的体重比雌鱼的体重重20％以上，因此大刺鳅的全雄单性育种具有更高的经济价值。
中国发明申请号 202010057366.8的文献公开了大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段及应用，本发明在2b-RAD-seq技术的基础上，并利用基因组步移技术，开发了大刺鳅雄性性别特异性标记，所述的特异性DNA片段为SEQID NO .1或SEQ ID NO .2所示，针对该特异性序列，可以利用常规PCR扩增和普通琼脂糖电泳对大刺鳅的性别进行鉴定，其用于大刺鳅性别鉴定的引物为：CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC和ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG。但是，该文献提供的技术方案还存在着如下不足：首先，其采用的测序方法只能为2b-RAD-seq，适用群体为养殖家系F1子代群体，标记条带判断依据为：雌性：无条带，雄性：431bp/746bp；仅能对雄性进行准确的判定，而不能对雌性、雄性两性进行准确的判断，也不能对更为广泛的野生群体和养殖群体进行准确的判断，因此难以将其应用于大刺鳅的大范围群体性别鉴定和育种。
此外，根据已知的大刺鳅基因组序列发现其具有较为明显的性染色体，本发明人团队通过对大刺鳅雌雄基因组测序分析并与该段基因组进行比对，发现雄性基因组具有许多特异性DNA片段，因此推测大刺鳅性别决定为雄性异配，采用单一特异性DNA片段难以对其性别进行准确的判定。全雄大刺鳅单性育种首先需要满足获得伪雌鱼，然而获得伪雌鱼的主要途径是通过遗传雄鱼诱导性逆转得到。不论是通过大刺鳅外部形态观察还是传统测交实验方法鉴定亲本，都需要花费大量时间和人力物力。而现在已有的大刺鳅标记仅为一种家系通用标记，且仅在雄性个体中显示条带，局限性较大。因此，开发一种直观、准确，适应范围广泛的鉴定遗传雄性的分子标记及方法，并应用在大刺鳅全雄育种中、进行大范围推广和普及，具有重大的实际意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于，提供一种大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段、遗传性别标记引物及应用，采用新的技术方案，为大刺鳅提供多种群可用的、高稳定性的遗传性别标记引物，该引物能在分子水平上鉴定雌雄大刺鳅；同时改进大刺鳅性别鉴定的方法，使其满足生产过程中适用范围广、耗时短、检测结果准确等要求。
为实现上述第一目的，本发明采用以下技术方案：
一种大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，其特征在于，所述的特异性DNA片段分别为下列之一：Contig-1上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Contig-1下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Contig-2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Contig-2下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一种大刺鳅性别鉴定的遗传性别标记引物，该遗传性别标记引物为引物对1，其包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物；
所述引物对1的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-1上游引物：5’-CCATTCAGCATTACACCATACA-3’；
Contig-1下游引物：5’-TTCCCCTACCAAATCACCA-3’。
该遗传性别标记引物为引物对2，其包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物；
所述引物对2的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-2上游引物：5’-TGCTACTGTCCAAAGTAAACAGG-3’;
Contig-2下游引物：5’-CGGGCAGAATCACTCAAA-3’。
一种采用前述遗传性别标记引物，进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：设计引物对1和引物对2；
S2：大刺鳅DNA样品制备；
S3：以上述步骤S2获得的DNA样品作为模板，采用步骤S1设计获得的引物对1和引物对2进行PCR扩增，通过凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示具有一条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雌性大刺鳅；若电泳结果显示具有两条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雄性大刺鳅。
所述步骤S2中的DNA样品制备，是采用DNA提取试剂盒进行大刺鳅DNA的提取。
所述步骤S3中采用引物对1或者引物对2进行PCR扩增时，采用的25μL的PCR反应体系中包括：大刺鳅DNA样品100ng，Contig-1或者Contig-2的上下游引物各1μL，2×TaqMasterMix 12.5μL，加ddH2O至25μL体系。
所述的步骤S3中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序为：首先 95℃预变性3min；再95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共20个循环；再95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸1min，共15个循环；再72℃最终延伸5min。
所述的步骤S3在进行电泳检测鉴定时，采用质量百分含量为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段条带数以及长度。
所述步骤S3电泳检测结果中，扩增出的特异性条带为一条时大刺鳅为雌性，特异性条带为两条时大刺鳅为雄性；引物对1的X染色体上产物的特异性条带长度为354bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为473bp；引物对2的X染色体上产物的特异性条带长度为649bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为491bp。
一种前述大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段在大刺鳅全雄性育种中的应用。
一种前述大刺鳅遗传性别标记引物在大刺鳅全雄性育种中的应用。
本发明至少具有以下有益效果：
（1）本发明提供的大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，是基于雌雄大刺鳅的WGSseq基因组测序技术和数据，综合利用基因组组装和比对等分析方法，设计出的四段能够相互配合的DNA片段，其稳定性好、适用范围大，两两结合、组成两组分子标记引物对，能够广泛适用于鉴定覆盖珠江流域各野生群体和养殖群体的大刺鳅遗传性别，该引物对可同步对雌雄两性大刺鳅的性别进行快速、准确的鉴定，可实现产业生产过程中，在大范围、多种群中快速、准确通过筛选出的大刺鳅遗传性别标记，能够在分子水平上快速、准确的鉴定雌雄大刺鳅的性别，能够满足大刺鳅规模化育种、生产等需求。
（2）本发明提供的利用该特异性DNA片段及其分子标记引物对，对大刺鳅遗传性别进行鉴定的方法，是基于雌雄大刺鳅的WGS seq基因组测序数据，利用两对特异性引物对，将大刺鳅的DNA样品进行PCR反应即可鉴定出大刺鳅性别，相较于传统的性别鉴定方法，该方法适用性更强、耗时更短、效率和准确性更高。
（3）本发明提供的特异性DNA片段及遗传性别标记引物的应用，能够在分子水平上鉴定雌雄大刺鳅，综合利用基因组组装和比对等分析方法，能够将其应用于多种群的大刺鳅规模化全雄单性育种、生产等过程中，满足生产需求。
附图说明
图1为本发明实施例大刺鳅染色体候选片段获取方法示意图；
图2为本发明实施例大刺鳅特有候选片段长度分布情况示意图（横坐标为候选片段bp长度，纵坐标为候选片段个数）；
图3为本发明实施例在雌雄样本中检测到特异性扩增片段的2对引物的PCR产物电泳图；
图4为本发明实施例引物Contig-1F/R对珠江流域东江、北江、西江、潭江的野生群体（雌雄各8尾）检测PCR产物电泳图。
具体实施方式
以下结合附图1-4与具体实施案例对本发明的技术方案进行进一步详细的说明，以便本领域的技术人员充分理解本发明的技术方案。本发明实施案例中的所有所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
本实施例提供的大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，分别为下列之一：Contig-1上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Contig-1下游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；Contig-2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Contig-2下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。详见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的基因序列表。
本实施例提供的包括前述大刺鳅性别鉴定特异性DNA片段的遗传性别标记引物，分别为引物对1和引物对2，两组引物对均可以单独适用。
其中，引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物；
所述引物对1的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-1上游引物：5’-CCATTCAGCATTACACCATACA-3’；
Contig-1下游引物：5’-TTCCCCTACCAAATCACCA-3’。
Contig-1上游引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.2所示；
引物对2，其包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物；
所述引物对2的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-2上游引物：5’-TGCTACTGTCCAAAGTAAACAGG-3’;
Contig-2下游引物：5’-CGGGCAGAATCACTCAAA-3’。
Contig-2上游引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.3所示，Contig-2下游引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.4所示。
本发明实施例上述大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段及遗传性别分子标记引物，是通过以下步骤获得，其具体包括：
（一）测序文库构建及重测序
1.大刺鳅DNA样品的制备：
野生种大刺鳅繁殖期间，在潭江流域获得大刺鳅雌雄各8尾，并随机抽取剪样雌性3尾和雄性3尾个体尾鳍，一次按照雌鱼F1-F3、雄鱼M1-M3编号，采用常规柱式离心法（通用型柱式基因组提取试剂盒，背景为上海迈宝科技有限公司），参照说明书进行操作步骤以制备DNA样品，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳和酶标仪（BioTek Instruments, Inc.）进行质量和浓度检测，达到测序要求。
2.测序文库的构建和高通量测序：
取雌鱼F1-F3、雄鱼M1-M3的DNA样品，分别构建350bp-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq X Ten平台进行双末端（Pair-End）PE150测序。文库构建步骤具体参考Novogene NGS DNA Library Prep Kit说明书，测序由背景诺禾致源科技股份有限公司完成。其中分别获得雌、雄基因组测序clean data：42Gb和64Gb。
（二）性染色体特异DNA片段的富集
1.候选DNA片段的获得
用雌鱼F1-F3、测序reads和雄鱼M1-M3测序reads采用bwa v0.7.17-r1188（http://bio-bwa.sourceforge.net/）软件的aln方法进行比对到NCBI大刺鳅雄性染色体基因组，得到雄鱼测序reads都能比对上，但是雌鱼测序reads比对不上的区域（图1）。总共筛选得到6条雄性特异DNA片段，这些雄鱼DNA片段的长度主要分布于500-1000bp，占总数的50.0%；长度≧300bp的Contig占总数的100%。这6条Contig中包含来自Y染色体的特异性DNA片段（参见图2）。
（三）雄性特异分子标记的筛选
1.引物设计与合成：
基于上述6条雄鱼DNA序列，采用Primer5软件（软件使用参照Primer PREMIERVersion5.0 for Windows and Power Macintosh）设计PCR引物，引物按照DCQ-xxF/R编号（xx代表Contig号），如Contig-1的引物编号为DCQ-1F/R（F代表上游引物，R代表下游引物，下列同上）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
2.雄性特异分子标记的筛选及确认：
选择上述6对引物对雌雄各8尾个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系为25μL，包括2×Taq MasterMix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）12.5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA100ng，加ddH2O至25μL体系。PCR反应程序为：95℃预变性3min；再95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共20个循环；再95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸1min，共15个循环；再72℃最终延伸5min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，只有两对引物能在雌性个体中获得一条扩增条带，在雄性个体中能获得两条扩增条带（图3），其余均存在非特异性杂带和无法判断的弥散条带；各引物分别是DCQ-1F/R和DCQ-2F/R，它们分别对应的是Contig-1和Contig-2。
通过此6对引物在大刺鳅雌雄各8个个体中的PCR扩增，确认了其中2条Contig：DCQ-1和DCQ-2是性染色体特异DNA片段，可以作为大刺鳅的遗传性别标记。
实施例2
本实施案例提供采用实施例1的遗传性别标记引物，进行大刺鳅性别鉴定的方法，包括以下步骤：
S1：设计大刺鳅的遗传性别分子标记引物（引物对1和引物对2），具体操作参照实施例1；
S2：大刺鳅DNA样品制备：
从珠江流域东江、北江、西江、潭江等地获得目测已经性成熟的大刺鳅野生品种，经解剖得到雌、雄性别大刺鳅各8尾。分别剪下尾鳍，利用试剂盒采取常规柱式离心法（通用型DNA小量提取试剂盒，广州迈宝生物科技有限公司），参照说明书步骤操作进行DNA样品制备。
S3：PCR扩增验证：
以上述步骤S2获得的DNA样品作为模板，采用步骤S1设计获得的引物对1和引物对2进行PCR扩增，通过凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示具有一条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雌性大刺鳅；若电泳结果显示具有两条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雄性大刺鳅。
本实施例中采用引物DCQ-1F/R和DCQ-2F/R对上述雌、雄各8个大刺鳅DNA样品进行PCR验证。PCR扩增反应总体系为25μL，包括2×Taq MasterMix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）12.5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA100ng，加ddH2O至25μL体系。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；再95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共20个循环；再95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸1min，共15个循环；再72℃最终延伸5min。
PCR反应结束后，产物经质量百分含量为1.2％的琼脂糖凝胶电泳。最终，引物DCQ-1F/R和DCQ-2F/R均能在雌雄个体的DNA样品中扩增出特异性条带。且DCQ-1F/R的X染色体上产物的特异性条带长度为354bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为473bp（见图4）；DCQ-2F/R的X染色体上产物的特异性条带长度为649bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为491bp。这表明遗传性别分子标记DCQ-1F/R和DCQ-2F/R可用于鉴定大刺鳅的性别。
实施例3
本实施例采用1、2分别提供的大刺鳅遗传性别标记引物和鉴定方法，应用于大刺鳅全雄育种，其包括以下步骤：
（1）待大刺鳅育苗养殖至20日龄，用包含100mg/kg的雌激素17β-雌二醇等的鳗鱼饲料投喂幼鱼，持续投喂两个月，养殖期间采用自然光照，培育水温保持27-29℃，饱食投喂。
（2）采用实施案例2中的方法，对投喂了激素的大刺鳅进行筛选，得到遗传型为XY型的雌鱼，获得伪雌鱼，具体操作参照例2。
（3）将标记鉴定出的XY伪雌鱼继续养到性成熟，在繁殖季节与正常XY雄鱼进行交配，获得的后代中包含XY和YY的雄鱼。
（4） 采用雄性特异分子标记通过PCR电泳跑胶或测交手段将后代中YY超雄鱼进一步筛选出来，将得到的YY超雄鱼养殖到性成熟之后，与XX雌鱼进行交配得到全雄鱼子代。
本发明上述实施例提供的特异性DNA片段、遗传性别标记引物、鉴定方法及应用，重点是针对现有技术的不足，采用WGS seq基因测序技术和数据，综合利用基因组组装和比对等分析方法，设计出四段能够相互配合的DNA片段，其稳定性好、适用范围大，两两结合、组成两组分子标记引物对，能够在分子水平上鉴定雌雄大刺鳅，能够广泛适用于鉴定覆盖珠江流域各野生群体和养殖群体的大刺鳅遗传性别，该引物对可同步对雌雄两性大刺鳅的性别进行快速、准确的鉴定，可实现产业生产过程中，在大范围、多种群中快速、准确通过筛选出的大刺鳅遗传性别标记，能够在分子水平上快速、准确的鉴定雌雄大刺鳅的性别，能够满足不同地域分布的多种群大刺鳅规模化育种、生产等需求，而且成本低，易于实施。
以上实施案例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施案例，本实施案例下的技术人员均属于本发明保护的范围。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

Claims (8)

1.一种大刺鳅性别鉴定的遗传性别标记引物，其特征在于，该遗传性别标记引物为引物对1，其包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物；
所述引物对1的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-1上游引物：5’-CCATTCAGCATTACACCATACA-3’；
Contig-1下游引物：5’-TTCCCCTACCAAATCACCA-3’。
2.一种大刺鳅性别鉴定的遗传性别标记引物，其特征在于，该遗传性别标记引物为引物对2，其包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物；
所述引物对2的从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-2上游引物：5’-TGCTACTGTCCAAAGTAAACAGG-3’;
Contig-2下游引物：5’-CGGGCAGAATCACTCAAA-3’。
3.一种采用权利要求1或2任一项所述遗传性别标记引物进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：设计引物对1或引物对2；
S2：大刺鳅DNA样品制备；
S3：以上述步骤S2获得的DNA样品作为模板，采用步骤S1设计获得的引物对1或引物对2进行PCR扩增，通过凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示具有一条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雌性大刺鳅；若电泳结果显示具有两条DNA特异性条带，此时所检测的大刺鳅为雄性大刺鳅。
4.根据权利要求3所述遗传性别标记引物进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，
所述步骤S2中的DNA样品制备，是采用DNA提取试剂盒进行大刺鳅DNA的提取。
5.根据权利要求3所述遗传性别标记引物进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，
所述步骤S3中采用引物对1或者引物对2进行PCR扩增时，采用的25μL的PCR反应体系中包括：大刺鳅DNA样品100ng，Contig-1或者Contig-2的上下游引物各1μL，2×TaqMasterMix 12.5μL，加ddH2O至25μL体系。
6.根据权利要求3所述遗传性别标记引物进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，
所述的步骤S3中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序为：首先 95℃预变性3min；再95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共20个循环；再95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸1min，共15个循环；再72℃最终延伸5min；
所述的步骤S3在进行电泳检测鉴定时，采用质量百分含量为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段条带数以及长度。
7.根据权利要求3所述遗传性别标记引物进行大刺鳅性别鉴定的方法，其特征在于，
所述步骤S3电泳检测结果中，扩增出的特异性条带为一条时大刺鳅为雌性，特异性条带为两条时大刺鳅为雄性；引物对1的X染色体上产物的特异性条带长度为354bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为473bp；引物对2的X染色体上产物的特异性条带长度为649bp，Y染色体上产物的特异性条带长度为491bp。
8.一种权利要求1或2任一项所述大刺鳅遗传性别标记引物在大刺鳅全雄性育种中的应用。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100941780B1 (ko) * 2009-09-09 2010-02-11 주식회사 두원식품 담수어를 이용한 시즈닝의 제조방법
CN102618659A (zh) * 2012-04-18 2012-08-01 江苏省家禽科学研究所 鸭性别鉴定用pcr引物、鉴定方法及试剂盒
CN105557569A (zh) * 2014-12-26 2016-05-11 赣州市水产研究所 一种大刺鳅的池塘养殖方法
CN107691894A (zh) * 2017-11-17 2018-02-16 福建天马科技集团股份有限公司 一种大刺鳅幼鱼配合饲料
CN108048530A (zh) * 2018-01-23 2018-05-18 广州大学 基于EST序列开发EPICs引物的方法
CN111154852A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 中国科学院水生生物研究所 大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段及应用
CN111876498A (zh) * 2020-09-11 2020-11-03 江苏省淡水水产研究所 一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法
CN111996261A (zh) * 2020-07-31 2020-11-27 湖南银鱼农业科技有限公司 罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用
CN112746111A (zh) * 2021-01-20 2021-05-04 广东梁氏水产种业有限公司 斑鳢雄性分子标记引物及其应用
CN113684284A (zh) * 2021-09-07 2021-11-23 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法
US11306365B1 (en) * 2021-07-07 2022-04-19 Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy Of Fishery Sciences Molecular marker C42257 for rapidly identifying genetic sex of Marsupenaeus japonicus and applications thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2630173C (en) * 2005-11-18 2018-01-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Feedstuffs for aquaculture comprising stearidonic acid

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100941780B1 (ko) * 2009-09-09 2010-02-11 주식회사 두원식품 담수어를 이용한 시즈닝의 제조방법
CN102618659A (zh) * 2012-04-18 2012-08-01 江苏省家禽科学研究所 鸭性别鉴定用pcr引物、鉴定方法及试剂盒
CN105557569A (zh) * 2014-12-26 2016-05-11 赣州市水产研究所 一种大刺鳅的池塘养殖方法
CN107691894A (zh) * 2017-11-17 2018-02-16 福建天马科技集团股份有限公司 一种大刺鳅幼鱼配合饲料
CN108048530A (zh) * 2018-01-23 2018-05-18 广州大学 基于EST序列开发EPICs引物的方法
CN111154852A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 中国科学院水生生物研究所 大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段及应用
CN111996261A (zh) * 2020-07-31 2020-11-27 湖南银鱼农业科技有限公司 罗氏沼虾性别分子标记引物及其应用
CN111876498A (zh) * 2020-09-11 2020-11-03 江苏省淡水水产研究所 一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法
CN112746111A (zh) * 2021-01-20 2021-05-04 广东梁氏水产种业有限公司 斑鳢雄性分子标记引物及其应用
US11306365B1 (en) * 2021-07-07 2022-04-19 Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy Of Fishery Sciences Molecular marker C42257 for rapidly identifying genetic sex of Marsupenaeus japonicus and applications thereof
CN113684284A (zh) * 2021-09-07 2021-11-23 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"大刺鳅(Mastacembelus armatus)二、三、四碱基重复微卫星标记的筛选和特征分析";房祖业等;《海洋与湖沼》(第1期);180-188 *
大刺鳅雌雄个体形态差异分析;周惠强等;《广东海洋大学学报》;第39卷(第1期);1-6 *

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