CN114717325B - 大型溞鉴定用ssr标记组合及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及浮游动物分子标记领域，特别是涉及培育种大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途，所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合包括以下中的一项或多项：ZSC_320、ZSC_448、ZSC_546、ZSC_679、ZSC_748、ZSC_761、ZSC_1372、ZSC_1701、ZSC_18335、ZSC_875、ZSC_1797、ZSC_1890、ZSC_2050、ZSC_2586、ZSC_2799、ZSC_2828、ZSC_3113、ZSC_3761、ZSC_3833、ZSC_4037、ZSC_4319、ZSC_10218、ZSC_6980、ZSC_7904、ZSC_8717、ZSC_9631。本发明大型溞鉴定相关SSR标记可为评价我国大型溞品种遗传特征、大型溞品种鉴定等工作提供理论依据和技术手段。

Description

大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途
技术领域
本发明涉及浮游动物分子标记领域，特别是涉及大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途。
背景技术
大型溞(Daphnia magna)属于溞科(Daphniidae)、溞属(Daphnia)，是水域生态系统的重要组成物种，主要生活在淡水湖泊、河流、池塘和水库中。大型溞可直接滤食浮游植物，常用于控制水体中浮游植物的种群数量和群落结构，可一定程度上抑制微囊藻华的发生。大型溞具有分布广、适应性强、繁殖期短，可在实验室大规模培养等特点，且对水环境中多种有毒物质高度敏感，因此被广泛应用于水污染监测和水生生物毒理研究。同时也是生命科学研究领域较为理想的模式生物。
SSR(simple sequence repeats)即简单重复序列，也称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，是一种以特异引物PCR为基础的DNA分子标记技术。它是基因组内以1～6个核苷酸为重复单元组成的短串联重复序列，广泛分布于基因组的各个区域。SSR是目前最常用的微卫星标记之一，因具有数量多、共显性、操作简便、结果稳定、多态性高、可重复性强等优点，已广泛用于基因定位、遗传图谱构建、指纹图谱分析、亲缘关系鉴定以及多样性评价等研究中。国内对于大型溞SSR标记开发的研究还鲜有报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种培育种大型溞鉴定用SSR标记组合，所述SSR标记包括以下中的一项或多项：ZSC_320、ZSC_448、ZSC_546、ZSC_679、ZSC_748、ZSC_761、ZSC_1372、ZSC_1701、ZSC_18335、ZSC_875、ZSC_1797、ZSC_1890、ZSC_2050、ZSC_2586、ZSC_2799、ZSC_2828、ZSC_3113、ZSC_3761、ZSC_3833、ZSC_4037、ZSC_4319、ZSC_10218、ZSC_6980、ZSC_7904、ZSC_8717、ZSC_9631。
SSR标记ZSC_320的重复单元为CAG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_448的重复单元为TTG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_546的重复单元为TGT，重复次数为6。
SSR标记ZSC_679的重复单元为TTG，重复次数为7。
SSR标记ZSC_748的重复单元为AAC，重复次数为7。
SSR标记ZSC_761的重复单元为AAC，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1372的重复单元为GTT，重复次数为7。
SSR标记ZSC_1701的重复单元为CAG，重复次数为5。
SSR标记ZSC_18335的重复单元为TC，重复次数为7。
SSR标记ZSC_875的重复单元为ACC，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1797的重复单元为CAA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1890的重复单元为CAA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_2050的重复单元为TGC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_2586的重复单元为GCC，重复次数为8。
SSR标记ZSC_2799的重复单元为AGA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_2828的重复单元为AGA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_3113的重复单元为AAG，重复次数为5。
SSR标记ZSC_3761的重复单元为CAG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_3833的重复单元为AAC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_4037的重复单元为ACA，重复次数为6。
SSR标记ZSC_4319的重复单元为CTT，重复次数为7。
SSR标记ZSC_10218的重复单元为GTT，重复次数为6。
SSR标记ZSC_6980的重复单元为ACA，重复次数为6。
SSR标记ZSC_7904的重复单元为AAC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_8717的重复单元为GCC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_9631的重复单元为CAG，重复次数为6。
本发明还提供一组用于培育种大型溞鉴定的引物组，所述引物组包括用于检测所述SSR标记的引物对。
本发明还提供一种用于培育种大型溞鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。
本发明还提供所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合、所述引物组、所述试剂盒在大型溞鉴定、大型溞种群亲缘关系判断、建立大型溞辅助育种技术平台、选育优质大型溞品种、评价大型溞遗传特征中的用途。
本发明还提供一种培育种大型溞的鉴定方法，所述鉴定方法包括用所述引物组或所述试剂盒检测待测大型溞的SSR标记，根据获得的SSR标记信息确认待测大型溞是否为培育种大型溞。
如上所述，本发明的大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途，具有以下有益效果：
1、填补了大型溞SSR分子标记开发的技术空白。
2、适用于高通量操作，具有很高的准确性。
3、数据读取简单，可以直接通过荧光信号峰判断供试品种是否为太和水公司选育的大型溞。
4、可为快速鉴定和评价各大型溞种群亲缘关系提供科学依据，可为建立大型溞分子辅助育种技术平台提供理论和数据支持，可为选育优质大型溞品种提供高效的检测方法；可为评价我国大型溞品种遗传特征、特定大型溞品种鉴定等工作提供理论依据和技术手段，具有较为重要的理论价值和应用意义。
附图说明
图1显示为本发明实施例2中13个大型溞种群的系统发育树。
具体实施方式
本发明提供一种培育种大型溞鉴定用SSR标记组合，所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合包括以下中的一项或多项：ZSC_320、ZSC_448、ZSC_546、ZSC_679、ZSC_748、ZSC_761、ZSC_1372、ZSC_1701、ZSC_18335、ZSC_875、ZSC_1797、ZSC_1890、ZSC_2050、ZSC_2586、ZSC_2799、ZSC_2828、ZSC_3113、ZSC_3761、ZSC_3833、ZSC_4037、ZSC_4319、ZSC_10218、ZSC_6980、ZSC_7904、ZSC_8717、ZSC_9631。
SSR标记ZSC_320的重复单元为CAG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_448的重复单元为TTG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_546的重复单元为TGT，重复次数为6。
SSR标记ZSC_679的重复单元为TTG，重复次数为7。
SSR标记ZSC_748的重复单元为AAC，重复次数为7。
SSR标记ZSC_761的重复单元为AAC，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1372的重复单元为GTT，重复次数为7。
SSR标记ZSC_1701的重复单元为CAG，重复次数为5。
SSR标记ZSC_18335的重复单元为TC，重复次数为7。
SSR标记ZSC_875的重复单元为ACC，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1797的重复单元为CAA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_1890的重复单元为CAA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_2050的重复单元为TGC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_2586的重复单元为GCC，重复次数为8。
SSR标记ZSC_2799的重复单元为AGA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_2828的重复单元为AGA，重复次数为5。
SSR标记ZSC_3113的重复单元为AAG，重复次数为5。
SSR标记ZSC_3761的重复单元为CAG，重复次数为6。
SSR标记ZSC_3833的重复单元为AAC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_4037的重复单元为ACA，重复次数为6。
SSR标记ZSC_4319的重复单元为CTT，重复次数为7。
SSR标记ZSC_10218的重复单元为GTT，重复次数为6。
SSR标记ZSC_6980的重复单元为ACA，重复次数为6。
SSR标记ZSC_7904的重复单元为AAC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_8717的重复单元为GCC，重复次数为6。
SSR标记ZSC_9631的重复单元为CAG，重复次数为6。
在一种实施方式中，所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合包括以下所有：ZSC_320、ZSC_448、ZSC_546、ZSC_679、ZSC_748、ZSC_761、ZSC_1372、ZSC_1701、ZSC_18335、ZSC_875、ZSC_1797、ZSC_1890、ZSC_2050、ZSC_2586、ZSC_2799、ZSC_2828、ZSC_3113、ZSC_3761、ZSC_3833、ZSC_4037、ZSC_4319、ZSC_10218、ZSC_6980、ZSC_7904、ZSC_8717、ZSC_9631。
SSR标记是一种基于特异性引物PCR扩增的分子标记，由2到6个核苷酸序列重复单元组成。其标记两端的序列较为保守，根据这一保守区域设计引物，通过PCR技术实现SSR标记位点扩增，可直接反映不同样本或物种间该DNA片段的遗传多态性。本申请中各SSR标记重复次数大于5。上述SSR标记均为完全型SSR标记，即重复单元以不间断的重复方式首尾相连，一个SSR标记的序列长度即为重复单元中碱基的个数乘以重复次数。
所述大型溞(Daphnia magna)是枝角目溞科的一种甲壳动物。所述大型溞鉴定为大型溞属或种的鉴定，即指鉴定不同属或不同种的大型溞。但是，由于不同属的大型溞通常可以通过形态学、一代测序等其他简便方法判断，因此本发明的SSR标记主要用于鉴定不同种的大型溞，即在不同种的大型溞鉴定中发挥的价值远比在不同属之间发挥的鉴定价值要高。
在一种实施方式中，所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合能够鉴定待测大型溞是否为太和水有限公司培育的大型溞，简称为太和水大型溞或培育种大型溞。太和水大型溞是经过近10年针对性的驯化改良得到的一种可控蓝藻的食藻虫，相对于自然种食藻虫具有以下特征：1)大型化，成体个体一般在4-6.5mm之间，口器口径相比野生大型溞大；2)可摄食蓝藻团块，可消化吸收蓝藻，抗蓝藻毒素能力增强；3)野外稳定性增强；4)能滤食最大直径80—160μm的食物颗粒。太和水大型溞的获得方法按照公开号为CN104787893B的专利中的驯化方法得到。
本发明提供一组用于培育种大型溞鉴定的引物组，包括用于检测所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合的引物对。
在一种实施方式中，所述引物组包括第一引物对至第二十六引物对，第一引物对至第二十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:52所示。
具体的，用于检测ZSC_320标记的第一引物对如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，用于检测ZSC_448标记的第二引物对如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4、用于检测ZSC_546标记的第三引物对如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示、用于检测ZSC_679标记的第四引物对如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示、用于检测ZSC_748标记的第五引物对如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示、用于检测ZSC_761标记的第六引物对如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示、用于检测ZSC_1372标记的第七引物对如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示、用于检测ZSC_1701标记的第八引物对如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示、用于检测ZSC_18335标记的第九引物对如SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示、用于检测ZSC_875标记的第十引物对如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示、用于检测ZSC_1797标记的第十一引物对如SEQID NO:21～SEQ ID NO:22所示、用于检测ZSC_1890标记的第十二引物对如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24所示、用于检测ZSC_2050标记的第十三引物对如SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26所示、用于检测ZSC_2586标记的第十四引物对如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示、用于检测ZSC_2799标记的第十五引物对如SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30所示、用于检测ZSC_2828标记的第十六引物对如SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示、用于检测ZSC_3113标记的第十七引物对如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示、用于检测ZSC_3761标记的第十八引物对如SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示、用于检测ZSC_3883标记的第十九引物对如SEQ IDNO:37～SEQ ID NO:38所示、用于检测ZSC_4037标记的第二十引物对如SEQ ID NO:39～SEQID NO:40所示、用于检测ZSC_4319标记的第二十一引物对如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42所示、用于检测ZSC_10218标记的第二十二引物对如SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:44所示、用于检测ZSC_6980标记的第二十三引物对如SEQ ID NO:45～SEQ ID NO:46所示、用于检测ZSC_7904标记的第二十四引物对如SEQ ID NO:47～SEQ ID NO:48所示、用于检测ZSC_8717标记的第二十五引物对如SEQ ID NO:49～SEQ ID NO:50所示、用于检测ZSC_9631标记的第二十六引物对如SEQ ID NO:51～SEQ ID NO:52所示。
上述的引物组中各引物对的上游引物(F)的序列均如前面的序列号所示，下游引物(R)的序列均如后面的序列号所示。例如第二十六引物对中，上游引物(F)的序列如SEQID NO:51所示，下游引物(R)的序列如SEQ ID NO:52所示，其他引物对同理。
对于上述例示的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。
将上述例示的引物的具体碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上。
对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。
根据本发明的实施例，上述引物具有非常好的特异性，利用上述引物能够准确有效的对待测大型溞的SSR标记所在的片段进行PCR扩增。
本发明提供一种用于培育种大型溞鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂、利用所述引物进行PCR反应的试剂。
在一种实施方式中，所述从样品中提取基因组DNA的试剂可以采用现有的试剂盒。
在一种实施方式中，利用所述引物组进行PCR反应的试剂可选自DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP混合物和水性介质，或选自上述几种试剂的预混液。例如，所述预混液选自EXTaq(HS)：Premix Ex TaqTM Hot Start Version,takara(RR030Q)。
所述PCR缓冲液通常可以向PCR体系提供最合适的酶催反应的条件。所述缓冲液只要起到上述作用即可。
所述dNTP混合物通常作为DNA合成中的原料，具体可以包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。
所述水性介质通常可以用于调节PCR体系中各组分的浓度，通常可以作为稀释溶剂。
本发明还提供所述培育种大型溞鉴定用SSR标记组合、所述SSR引物组、所述试剂盒在培育种大型溞鉴定、大型溞种群亲缘关系判断、建立大型溞辅助育种技术平台、选育优质大型溞品种、评价大型溞遗传特征中的用途。
对本发明的SSR标记的检测方法不做具体限定。测序可以实现SSR标记的检测。其中，测序是一种准确性高、灵活性强、高通量、检测周期短的检测技术。只需在SSR标记的两侧设计一对引物、扩增产物，再通过测序即可直接检测SSR标记位点。
本发明提供一种培育种大型溞的鉴定方法，所述鉴定方法包括用所述引物组或所述试剂盒检测待测大型溞的SSR标记，根据获得的SSR标记信息确认待测大型溞是否为培育种大型溞。
在一种实施方式中，所述鉴定方法包括以下步骤：
1)用所述引物组以待测大型溞的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
2)对PCR扩增产物测序，测序结果包括待测大型溞的26个SSR标记信息；
3)分析步骤2)获得的数据，若SSR标记重复单元和重复个数均与上述相同，则判定待测大型溞为培育种大型溞，否则，则非培育种大型溞。
在一种实施方式中，PCR扩增结束后用琼脂糖电泳对SSR标记位点扩增结果进行判断，扩增成功后再进行步骤2)。
步骤2)中测序采用现有的测序方法，例如毛细管电泳测序。
步骤3)还可以替换为使用一致度P值判断野生群体大型溞与培育种大型溞的差异，即是否为同一品种。计算公式为P＝(m-n)/(m)*100％，其中P：一致度；m：SSR标记的总个数，即m＝26；n：待测大型溞与培育种大型溞的SSR标记差异位点数。若待测大型溞的SSR标记组合中所有SSR标记与培育种大型溞的SSR标记组合结果完全一致，即一致度P＝100％，则属于培育种大型溞(DZ)。若一致度P≠100％，则待测大型溞并非培育种大型溞；P值越大，即相同SSR标记位点数越多，则一致度越高，与培育种大型溞(DZ)群体关系更近。
系统发育树可以采用现有的软件及方法构建。例如使用POPTREE，按照最大似然法(Maximum Likelyhood Method)构建ML聚类图。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
需要说明的是，本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得或为常规选择。
实施例1：26个多态性SSR位点标记的筛选
(1)样本采集
本研究所用材料为一个培育种大型溞种群和12个野生大型溞种群，培育种大型溞种群取自上海太和水环境科技发展股份有限公司的育种基地(也可称太和水培育种)，野生种群采自12个不同区域的水体(分别为烟台YT、济宁JN、云南YN、海南HNa、江苏JS、北京BJ、湖南HNb、山西SX、辽宁LN、广东GD、安徽AH、四川SC)。每个采样点随机采取数百个大型溞成年个体带回实验室培养。
(2)基因组DNA提取
选用TIANGEN DP304试剂盒提取50个单克隆培养的成体大型溞基因组DNA，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性，经紫外分光光度计检测DNA的纯度及浓度，保障所获得基因组DNA的品质能符合建库条件。将DNA样品稀释成30ng/μL，于-20℃保存备用。
(3)简化基因组测序
将四个群体(DZ、YN、JN、YT)中的基因组DNA进行等量融合，由上海迈浦生物科技有限公司按照如下操作实施建库测序处理：
1)限制性内切酶EcoRI酶切基因组DNA，酶切片段两端分别连接PCR扩增所需的引物序列、Illumina测序引物结合位点序列、区分不同样品的短标签序列以及区分不同样品的barcode序列。
2)将上述连接产物在pooling池中混合，物理方法随机打断成不同长度的片段并纯化。采用琼脂凝胶电泳筛选回收大小400～500bp的片段；配置末端修复反应体系(包括5×ERAEnzyme Mix、10×ERA Buffer、ddH2O)，在恒温混匀仪(ThermoMixer C,Eppendorf,德国)对筛选的片段进行末端修复反应，修复的片段末端加入碱基A并纯化。
3)将步骤2)得到的产物加上局部双链分叉Y型DNA。用琼脂糖凝胶回收纯化并富集RAD-tags，构建pair-end文库。
4)使用Illumina MiSeq PE150系统进行PCR扩增和富集RAD-tags，配对末端文库的构建以及测序。
5)由于Illumina Hiseq的原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续组装的质量。为保证后续的生物信息分析的准确性，使用trimmomatic软件过滤原始数据，从而得到高质量的测序数据(clean data)以保证后续分析的顺利进行，具体步骤及顺序如下：
(a)去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；
(b)将序列末端(3’端)质量较低(质量值小于20)的碱基修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10的碱基，则将整条序列剔除，否则保留；
(c)去除含N比率超过10％的reads；
(d)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于75bp的序列。
(4)SSR位点开发
SSR位点开发或称SSR位点筛选主要包括单一性和多态性筛选，单一性通过PCR、琼脂糖凝胶电泳判断是否有产物和产物是否单一；多态性筛选通过荧光引物PCR、毛细管电泳判断峰型是否合格和是否多态。具体操作过程如下：
1)微卫星位点检索
使用MISA软件(http://pgrc.ikpgatersleben.de/misa)检索合格的SSR位点，检索原则为标记重复单元在2-6bp的微卫星位点，重复次数大于5。
2)引物设计
使用PRIMER 3(Li and Durbin,2010)软件设计SSR引物；最小TM值为55℃，最优TM值为57℃。
3)引物合成
本开发方案采用加尾法进行SSR多态位点开发，分5批共合成100对普通引物，所有引物均委托第三方公司合成。
4)多态性筛选
多态性筛选选取6个样本(YN、HNa、JN、DZ、GD、JS)，SSR分型后以样本间包含不同基因型并且DZ峰型稳定作为多态性位点筛选标准，共筛选出29个具有多态性的预选位点。实验操作如下：
(a)样本及引物稀释：样本工作液浓度30ng/ul，引物工作液50μmol/L。
(b)PCR反应：
PCR扩增体系为20μL，包括10μL Taq Master Mix(2×)，30ng/μLDNA模板1μL，分型通用引物(即Common-famF，序列如SEQ ID NO:59所示)1μL，正向引物0.2μL，反向引物1μL，补充ddH2O 7μL。在Mastercycler pro PCR仪上进行PCR扩增反应，94℃预变性5min；94℃下变性处理30s，55℃-58℃退火30s(各引物序列如SEQ ID NO:1～ID NO:58所示，各引物的反应复性温度见表1)，72℃延伸30s，扩增循环35次；最后在72℃下延伸10min，4℃保温。
表1：SSR标记位点信息
Figure BDA0003538322350000101
Figure BDA0003538322350000111
Figure BDA0003538322350000121
(c)琼脂糖电泳检测及稀释：
电泳条件：1.5％琼脂糖凝胶，电压200V，电泳时间15min；电泳结束后用溴化乙锭(EB)染色，在凝胶成像系统中进行观察并拍照记录，根据电泳结果对位点扩增结果进行判断。
(d)毛细管电泳：
标准品LIZ500分析测试：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500，按引物合成批次进行分组。预配置HIDI：内标上机缓冲液，比例为990：10；混合缓冲液：样品的比例为9：1；预变性：程序为95℃3min，完成后放置于冰水混合物中极速冷却；使用3730XL检测处理后样本。
毛细管电泳筛选出的位点共29个，见下表2，其中ZSC_443、ZSC_3704、ZSC_7349不符合峰型判读标准，去掉后即剩余26个多态性SSR位点。
表2
Figure BDA0003538322350000131
(5)群体验证
对筛选出的表2中的26个位点在13个样本中进行大量群体的验证，实验步骤与(4)多态性筛选相同。群体结果显示26个SSR位点在13个样本中均可采样，证明26个位点可以作为鉴定大型溞的SSR标记。
(6)检测结果
将上一步得到的检测合格的样品数据采用GeneMapper 3.5软件进行读取，得到SSR位点的特征信息。
实施例2：26个SSR多态性位点的多态性及其系统发育树构建
本实施例以对太和水公司选育的大型溞(DZ)及12个野生大型溞群体(采自烟台YT、济宁JN、云南YN、海南HNa、江苏JS、北京BJ、湖南HNb、山西SX、辽宁LN、广东GD、安徽AH、四川SC共12个不同区域的水体，每个采样点随机采取数百个大型溞成年个体带回实验室培养获得)。
(1)取太和水公司选育的大型溞(DZ)及12个野生大型溞群体(烟台YT、济宁JN、云南YN、海南HNa、江苏JS、北京BJ、湖南HNb、山西SX、辽宁LN、广东GD、安徽AH、四川SC)成年个体，选用TIANGEN DP304试剂盒提取50个单克隆培养的成体大型溞基因组DNA，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性，经紫外分光光度计检测DNA的纯度及浓度，保障所获得基因组DNA的品质能符合建库条件。将DNA样品稀释成30ng/μL。以提取的基因组DNA为模板，利用实施例1中筛选所得的26个SSR多态性引物对进行PCR扩增。具体操作如下：
1)样本及引物稀释：样本工作液浓度30ng/μl，引物工作液50μmol/L。
2)PCR反应：
PCR扩增体系为20μL，包括10μL Taq Master Mix(2×)，30ng/μLDNA模板1μL，分型引物1μL，正向引物0.2μL，反向引物1μL，补充ddH2O 7μL。在Mastercycler pro PCR仪上进行PCR扩增反应，94℃预变性5min；94℃下变性处理30s，55℃-58℃退火30s(各引物反应复性温度见Table 2)，72℃延伸30s，扩增循环35次；最后在72℃下延伸10min，4℃保温(2)琼脂糖电泳检测及稀释：
电泳条件：1.5％琼脂糖凝胶，电压200V，电泳时间15min；根据电泳结果对SSR标记位点扩增结果进行判断。去除扩增结果不理想的标记。
(3)毛细管电泳：
标准品LIZ500分析测试：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500，按引物合成批次进行分组。预配置HIDI：内标上机缓冲液，比例为990：10；混合缓冲液：样品的比例为9：1；预变性：程序为95℃3min，完成后放置于冰水混合物中极速冷却；使用3730XL检测处理后样本。
(4)检测结果
将上一步得到的检测合格的样品数据采用GeneMapper 3.5软件进行读取。
(5)数据分析
根据步骤4)显示的26个SSR标记和SSR标记的多态性信息(见表3)。在这里引入一致度P值，计算公式为P＝(m-n)/(m)*100％，其中P：一致度；m：SSR标记的总个数，即m＝26；n：待测大型溞与培育种大型溞的差异位点数。SSR标记组合中所有SSR标记结果完全一致，即一致度P＝100％，则属于培育种大型溞(DZ)。P值越大，即相同SSR标记位点数越多，则一致度越高，与培育种大型溞(DZ)群体关系更近。从表4结果来看，12个野生大型溞群体的SSR标记与培育种大型溞的SSR标记一致度均不等于100％，即12个野生大型溞群体的SSR标记的重复单元或重复个数与培育种大型溞均不完全相同，所以12个野生大型溞群体均不是培育种大型溞。
表3：26个SSR标记的多态性信息
Figure BDA0003538322350000151
Figure BDA0003538322350000161
表4：样本一致度
Figure BDA0003538322350000162
(7)构建系统发育树：
使用本申请中所述26个多态性SSR位点对13个群体构建系统发育树，使用POPTREE软件来构建系统发育树(图1)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海太和水环境科技发展股份有限公司
上海海洋大学
<120> 大型溞鉴定用SSR标记组合及其用途
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaactacac ctacaccagc ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aattcgatga cgggaatc 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaataaaaca accgaaaaat gg 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aacgatttca cttgcacatt ag 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
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<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
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<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 49
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<400> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aagtaaaaat gatggatgtc cc 22
<210> 56
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<400> 56
ttaagcggtt cagttgtacc tt 22
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttgatattac agtcagttgc ca 22
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cggtaacata ccaaagtccc 20
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agtcacgacg ttgtaaaacg ac 22

Claims (7)

1.一组用于培育种大型溞鉴定的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测培育种大型溞鉴定用SSR标记组合的引物对，所述引物组包括第一引物对至第二十六引物对，第一引物对至第二十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:52所示。
2.一种用于培育种大型溞鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂、利用权利要求1所述的引物组进行PCR反应的试剂。
4.权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定培育种大型溞、大型溞种群亲缘关系判断、建立大型溞辅助育种技术平台、选育优质大型溞品种、评价大型溞遗传特征中的用途。
5.一种培育种大型溞的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括用权利要求1所述的引物组，或用权利要求2或3所述的试剂盒检测待测大型溞的SSR标记，根据获得的SSR标记信息确认待测大型溞是否为培育种大型溞。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，还包括以下步骤：
1)用权利要求1所述的引物组以待测大型溞的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
2)对PCR扩增产物测序，测序结果包括待测大型溞的26个SSR标记的重复单元和重复个数；
3)根据步骤2)获得的SSR标记的重复单元和重复个数鉴定大型溞，若SSR标记重复单元和重复个数均与下述的SSR标记组合中各SSR标记的重复单元和重复个数相同，则判定待测大型溞为培育种大型溞，否则，则非培育种大型溞：
SSR标记ZSC_320的重复单元为CAG，重复次数为6；
SSR标记ZSC_448的重复单元为TTG，重复次数为6；
SSR标记ZSC_546的重复单元为TGT，重复次数为6；
SSR标记ZSC_679的重复单元为TTG，重复次数为7；
SSR标记ZSC_748的重复单元为AAC，重复次数为7；
SSR标记ZSC_761的重复单元为AAC，重复次数为5；
SSR标记ZSC_1372的重复单元为GTT，重复次数为7；
SSR标记ZSC_1701的重复单元为CAG，重复次数为5；
SSR标记ZSC_18335的重复单元为TC，重复次数为7；
SSR标记ZSC_875的重复单元为ACC，重复次数为5；
SSR标记ZSC_1797的重复单元为CAA，重复次数为5；
SSR标记ZSC_1890的重复单元为CAA，重复次数为5；
SSR标记ZSC_2050的重复单元为TGC，重复次数为6；
SSR标记ZSC_2586的重复单元为GCC，重复次数为8；
SSR标记ZSC_2799的重复单元为AGA，重复次数为5；
SSR标记ZSC_2828的重复单元为AGA，重复次数为5；
SSR标记ZSC_3113的重复单元为AAG，重复次数为5；
SSR标记ZSC_3761的重复单元为CAG，重复次数为6；
SSR标记ZSC_3833的重复单元为AAC，重复次数为6；
SSR标记ZSC_4037的重复单元为ACA，重复次数为6；
SSR标记ZSC_4319的重复单元为CTT，重复次数为7；
SSR标记ZSC_10218的重复单元为GTT，重复次数为6；
SSR标记ZSC_6980的重复单元为ACA，重复次数为6；
SSR标记ZSC_7904的重复单元为AAC，重复次数为6；
SSR标记ZSC_8717的重复单元为GCC，重复次数为6；
SSR标记ZSC_9631的重复单元为CAG，重复次数为6。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，步骤3)还可以替换为计算待测大型溞与培育种大型溞SSR标记组合的一致度P值判断待测大型溞是否为培育种大型溞；一致度P值的计算公式为P＝(m-n)/(m)*100％，其中m为SSR标记的总个数，即m＝26；n为待测大型溞与培育种大型溞的SSR标记差异位点数；若一致度P＝100％，则待测大型溞是培育种大型溞；若一致度P≠100％，则待测大型溞并非培育种大型溞。
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