CN112553360A - 苦草鉴定相关snp标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明植物分子标记领域，特别是涉及苦草鉴定相关SNP标记及其用途，所述SNP标记包括第一SNP标记至第二十二SNP标记中的一个或几个。本发明还提供了用于检测苦草鉴定相关SNP标记的引物组和试剂盒。本发明的苦草鉴定相关SNP标记填补苦草SNP分子标记开发的技术空白，可实现高通量操作，具有很高的准确性，数据读取简单，节约成本，提高效率，为快速鉴定和评价各苦草亚种亲缘关系提供了科学依据，为建立苦草分子辅助育种技术平台提供理论和数据支持，为选育优质苦草品种提供高效检测方法；为评价我国苦草品种遗传特征、特定苦草品种鉴定等工作提供理论依据和技术手段，具有较为重要的理论价值和应用意义。

Description

苦草鉴定相关SNP标记及其用途

技术领域

本发明涉及植物分子标记领域，特别是涉及苦草鉴定相关SNP标记及其用途。

背景技术

苦草(Vallisneria)，俗称“扁担草”“水韭菜”，隶属于被子植物门(Angiospermae)，单子叶植物纲(Monocots)，沼生目(Helobiae)，水鳖科(Hydrocharitaceae)，多年生无茎沉水草本植物，有匍匐茎，叶呈线形或带形，生长在溪沟、河流等环境中，广泛分布于世界各地，是淡水生态系统的建群物种和重要组成部分。苦草吸附悬浮污染物能力强，具备氮、磷去除能力，能有效缓解水体富营养化程度，有效地抑制藻类的繁殖生长，还能为后续其他水生植物的生长提供保障，使其成为水质净化、水域生态修复的先锋物种，太和水公司选育的矮型苦草，因其矮型化、四季常绿、耐污染、耐弱光等特点，其根茎叶发达、光合作用强，可产生大量的原生氧，能够高效吸收、转化氮磷等营养盐，适用于我国各种水体。同时配置各种高低不同、形态各异、色泽有别的水下草坪和水下森林，在满足水下生态物种多样性的同时，构建优美的水下景观，在水域生态修复工程中得到广泛应用。近年来，工程上应用的苦草种类繁多，命名和分类混乱，由于苦草形态受环境及主观因素影响较大，形态学鉴定结果可靠性较低，加之形态鉴定方法周期长，因此，开发用于区分不同苦草亚种的分子标记十分必要。

SNP标记(single nucleotide polymorphism marker)是分子标记中在当前遗传标记开发中研究最多、最热，也是应用前景最广的分子标记，利用SNP标记可以快速准确的鉴定不同苦草亚种，国内对于苦草SNP标记开发方法还未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一组苦草鉴定相关的SNP标记，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一组苦草鉴定相关的SNP标记，所述SNP 标记包括第一SNP标记至第二十二SNP标记中的一个或几个。

一组用于苦草鉴定的引物组，所述引物组包括用于检测第一SNP标记至第二十二SNP 标记的引物对。

一种用于苦草鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。

所述的SNP标记、所述的引物组或所述的试剂盒在苦草品系鉴定、建立苦草分子辅助育种技术平台、选育优质苦草品系以及评价苦草品系遗传特征中的用途。

一种苦草的鉴定方法，所述鉴定方法包括用能够特异性识别苦草SNP标记的引物组或试剂盒检测苦草的SNP标记。

优选的，所述试剂盒中包括所述能够特异性识别苦草SNP标记的引物组。

优选的，所述引物组包括SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.66所示的引物对。

更优选的，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂、利用所述引物组进行PCR反应的试剂。

优选的，所述苦草的SNP标记包括第一SNP标记至第二十二SNP标记中的一种或几种。

优选的，所述鉴定方法包括以下步骤：

1)用所述引物组以待测苦草的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

2)对PCR扩增产物测序；

3)根据步骤2)的测序结果构建系统发育树。

优选的，所述鉴定方法具体包括以下步骤：

1)用所述引物组以待测苦草的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

2)将PCR扩增产物进行延伸；

3)将延伸产物进行毛细管电泳检测；

4)读取数据并分析。

优选的，所述鉴定方法具体包括以下步骤：

1)将PCR获得的扩增产物进行纯化后再延伸，延伸时采用混孔延伸；

2)将延伸获得的产物纯化后再进行毛细管电泳；

3)延伸使用的引物如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.102；

4)数据分析得到的一致度越高、越接近100％，待测苦草与太和水有限公司选育的矮型苦草的群体关系越近；当一致度为100％时，待测苦草与太和水有限公司选育的矮型苦草的为同一品系。

优选的，所述苦草的鉴定方法为苦草品系的鉴定方法。

如上所述，本发明的苦草鉴定相关SNP标记及其用途，具有以下有益效果：

1)填补苦草SNP分子标记开发的技术空白。

2)可对苦草属所有的种类进行鉴定，可实现高通量操作，具有很高的准确性，数据读取简单，节约成本，提高效率。

3)为快速鉴定和评价各苦草亚种亲缘关系提供了科学依据，为建立苦草分子辅助育种技术平台提供理论和数据支持，为选育优质苦草品种提供高效检测方法；为评价我国苦草品种遗传特征、特定苦草品种鉴定等工作提供理论依据和技术手段，具有较为重要的理论价值和应用意义。

4)数据读取简单，可以直接通过荧光信号峰判断待测苦草是否为太和水公司选育的矮型苦草。

附图说明

图1显示为本发明的毛细管电泳测序仪3730xl参数设置图。

图2显示为利用本发明的SNP标记对15个群体(18个样本)构建的系统发育树。

具体实施方式

除非下文另外定义，本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。

术语：“单核苷酸多态性”或“SNP”是指当在基因组序列中一个核苷酸[例如，腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G))]改变为另一个核苷酸时发生的DNA序列变化或遗传性变型。

术语：SNAPSHOT方法是一种基于荧光标记ddNTP单碱基延伸原理用于SNP分型的微测序技术。同一反应体系中若含有针对不同SNP的等位基因特异性引物，而它们5’端长度不同，则可实现多个SNP同步分析。分型方法包括：PCR扩增、引物延伸反应和电泳分型。

本发明提供一组苦草鉴定相关的SNP标记，所述SNP标记包括以下中的一种或几种：

1)第一SNP标记，所述第一SNP标记为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第40位碱基A或G；

2)第二SNP标记，所述第二SNP标记为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列自5’端起第68位碱基G或A；

3)第三SNP标记，所述第三SNP标记为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列自5’端起第53位碱基G或T；

4)第四SNP标记，所述第四SNP标记为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列自5’端起第71位碱基G或A；

5)第五SNP标记，所述第五SNP标记为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列自5’端起第62位碱基G或A；

6)第六SNP标记，所述第六SNP标记为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列自5’端起第65位碱基C或G；

7)第七SNP标记，所述第七SNP标记为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列自5’端起第64位碱基A或G；

8)第八SNP标记，所述第八SNP标记为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列自5’端起第44位碱基T或C；

9)第九SNP标记，所述第九SNP标记为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列自5’端起第69位碱基A或T；

10)第十SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列自5’端起第56位碱基G或A；

11)第十一SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列自5’端起第61位碱基C或T；

12)第十二SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列自5’端起第61位碱基C或T；

13)第十三SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列自5’端起第49位碱基C或T；

14)第十四SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列自5’端起第53位碱基A或G；

15)第十五SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列自5’端起第38位碱基T或C；

16)第十六SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列自5’端起第55位碱基C或T；

17)第十七SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列自5’端起第60位碱基T或G；

18)第十八SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列自5’端起第63位碱基G或A；

19)第十九SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列自5’端起第46位碱基A或G；

20)第二十SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列自5’端起第49位碱基T或C；

21)第二十一SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列自5’

端起第56位碱基C或T；

22)第二十二SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列自5’

端起第55位碱基T或C。

在本发明中，每个SNP标记都被认为与苦草鉴定相关联的SNP。所述苦草鉴定中的苦草是指苦草属(Vallisneria)，苦草属隶属于水鳖科(Hydrocharitaceae)，是沉水草本植物，花单性，雌雄异株。苦草属植物广泛分布于全世界，共有10～14种。所述苦草属包括苦草品系、刺苦草品系、密刺苦草品系、矮型苦草(或称矮生苦草)品系、亚洲苦草品系、密齿苦草品系、大苦草品系。本发明中所述苦草鉴定包括苦草品系鉴定。优选的，包括太和水有限公司选育的矮型苦草品系的鉴定，亦即鉴定未知的苦草或苦草品系是否为太和水有限公司选育的矮型苦草品系。太和水有限公司选育的矮型苦草品系属于四季常绿矮型苦草品系。

在一种实施方式中，所述苦草鉴定相关的SNP标记包括第一SNP标记至SNP标记第二十二SNP标记。

在一较佳实施例，第一SNP标记至SNP标记第二十二SNP标记为苦草品系鉴定相关的 SNP标记。以上SNP标记可用于鉴别所有苦草属，但由于不同种的苦草通常可以通过形态学、一代测序等其他简便方法判断，因此本发明的SNP标记在不同的苦草品系鉴定中发挥的价值远比在不同种之间发挥的鉴定价值要高。

所述第一SNP标记的等位基因型包括AA基因型、AG基因型和GG基因型。

所述第二SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

所述第三SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GT基因型和TT基因型。

所述第四SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

所述第五SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

所述第六SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CG基因型和GG基因型。

所述第七SNP标记的等位基因型包括AA基因型、AG基因型和GG基因型。

所述第八SNP标记的等位基因型包括TT基因型、TC基因型和CC基因型。

所述第九SNP标记的等位基因型包括AA基因型、AT基因型和TT基因型。

所述第十SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

所述第十一SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CT基因型和TT基因型。

所述第十二SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CT基因型和TT基因型。

所述第十三SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CT基因型和TT基因型。

所述第十四SNP标记的等位基因型包括AA基因型、AG基因型和GG基因型。

所述第十五SNP标记的等位基因型包括TT基因型、TC基因型和CC基因型。

所述第十六SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CT基因型和TT基因型。

所述第十七SNP标记的等位基因型包括TT基因型、TG基因型和GG基因型。

所述第十八SNP标记的等位基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

所述第十九SNP标记的等位基因型包括AA基因型、AG基因型和GG基因型。

所述第二十SNP标记的等位基因型包括TT基因型、TC基因型和CC基因型。

所述第二十一SNP标记的等位基因型包括CC基因型、CT基因型和TT基因型。

所述第二十二SNP标记的等位基因型包括TT基因型、TC基因型和CC基因型。

所述各SNP标记与其SNP位点序号对应如下表所示：

SNP标记	SNP位点序号
		第一SNP标记	Re344168_1
第二SNP标记	Re462581_1
		第三SNP标记	Re547001_1
第四SNP标记	Re567049_1
		第五SNP标记	Re568567_1
第六SNP标记	Re569904_1
		第七SNP标记	Re572019_1
第八SNP标记	Re588584_1
		第九SNP标记	Re598414_1
第十SNP标记	Re601118_1
		第十一SNP标记	Re623292_1
第十二SNP标记	Re625719_1
		第十三SNP标记	Re632532_1
第十四SNP标记	Re642863_1
		第十五SNP标记	Re656094_1
第十六SNP标记	Re656788_1
		第十七SNP标记	Re657798_1
第十八SNP标记	Re660420_1
		第十九SNP标记	Re667567_1
第二十SNP标记	Re683984_1
		第二十一SNP标记	Re687111_1
第二十二SNP标记	Re689563_1

本发明提供一组用于苦草鉴定的引物组，所述引物组包括用于检测第一SNP标记，第二SNP标记，第三SNP标记，第四SNP标记，第五SNP标记，第六SNP标记，第七SNP标记，第八SNP标记，第九SNP标记，第十SNP标记，第十一SNP标记，第十二SNP标记，第十三SNP标记，第十四SNP标记，第十五SNP标记，第十六SNP标记，第十七SNP标记，第十八SNP标记，第十九SNP标记，第二十SNP标记，第二十一SNP标记，第二十二SNP标记中任一或任意多个SNP标记的引物对。各引物对的正向和反向核苷酸序列选自SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.66中的一项或几项。

具体的，所述引物对包括第一引物对、第二引物对直至第二十二引物对。第一引物对用于检测第一SNP标记，第二引物对用于检测第二SNP标记，第三引物对用于检测第三SNP标记，以此类推直至第二十二引物对与第二十二SNP标记。

对于上述例示的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。

将上述例示的引物的具体碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为 75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上。

对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。

根据本发明的实施例，上述引物具有非常好的特异性，利用上述引物能够准确有效的对待测苦草相关SNP标记所在的片段进行PCR扩增。

本发明提供一种用于苦草鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂、利用所述引物进行PCR反应的试剂。

在一种实施方式中，所述从样品中提取基因组DNA的试剂可以采用现有的试剂盒。

在一种实施方式中，利用所述引物组进行PCR反应的试剂可选自DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP混合物和水性介质，或选自上述几种试剂的预混液。例如，所述预混液选自EXTaq(HS)：Premix Ex Taq^TMHot Start Version,takara(RR030Q)。

所述PCR缓冲液通常可以向PCR体系提供最合适的酶催反应的条件。所述缓冲液只要起到上述作用即可。

所述dNTP混合物通常作为DNA合成中的原料，具体可以包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。

所述水性介质通常可以用于调节PCR体系中各组分的浓度，通常可以作为稀释溶剂。

本发明提供所述苦草鉴定相关的SNP标记、用于检测所述SNP标记的引物组、用于检测所述SNP标记的试剂盒在苦草品系鉴定、建立苦草分子辅助育种技术平台、选育优质苦草品系、评价苦草品系遗传特征中的用途。

对本发明的SNP标记的检测方法不做具体限定。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应 (PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性高、灵活性强、高通量、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物、扩增400-700bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。

本发明提供一种苦草的鉴定方法，所述鉴定方法包括用所述引物或所述试剂盒检测苦草的SNP标记。

在一种实施方式中，所述鉴定方法包括以下步骤：

1)用所述引物组以待测苦草的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

2)对PCR扩增产物测序；

3)根据步骤2)的测序结果构建系统发育树。

步骤2)中测序采用现有的测序方法，例如Sanger测序。

系统发育树可以采用现有的软件及方法构建。例如使用Phylip.695，按照最大似然法 (Maximum Likelyhood Method)构建ML聚类图。

在一种实施方式中，所述鉴定方法具体包括以下步骤：

1)用所述引物组以待测苦草的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

2)将PCR扩增产物进行延伸；

3)将延伸产物进行毛细管电泳检测；

4)读取数据并分析。

在一种实施方式中，步骤2)中利用单孔或混孔进行延伸。所述单孔即每孔只能检测一个 SNP位点。所述混孔即每孔可以同时检测多个SNP位点，同时对多达10个SNP进行多重分析。混孔检测可以实现一个样本通过一次PCR就可以检测所有SNP位点。可以通过现有技术实现混孔检测，例如使用SNaPshot Multiplex Kit。混孔检测可以节约成本，提高效率。

在一种实施方式中，将PCR获得的扩增产物进行纯化后再延伸。

在一种实施方式中，将延伸获得的产物纯化后再进行毛细管电泳。

在一种实施方式中，延伸使用的引物如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.102。

具体的，数据读取和分析可以根据不同的实验目的更换不同的内标。

在一种实施方式中，内标为市售的GS120-LIZ，内标片段大小分别为15、20、25、35、50、62、80、110、120。

具体的，数据分析时根据一致度判断待测苦草与太和水有限公司选育成的矮型苦草是否为同一品系，以及与太和水有限公司选育成的矮型苦草之间群体关系的远近。当一致度越高、越接近100％时，待测苦草与太和水有限公司选育成的矮型苦草的群体关系越近。当一致度为 100％时，说明待测苦草与太和水有限公司选育成的矮型苦草为同一品系。

所述一致度通过下述方法计算：P＝(m-n)/(m-u)*100％；其中，P为一致度、n为差异位点数、m为位点总数(22)、u为Null值位点数。

由于待测苦草与太和水有限公司选育的苦草品系均为苦草属，同时各品系之间还可能存在杂交的情况，做系统发育树不能将亲缘关系很近的品系区分开来，因此根据一致度判断亲缘关系比系统发育树更准确。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得或为常规选择。

实施例1多态性SNP位点标记的筛选

(1)引物设计

对太和水有限公司的矮型苦草的最初100个SNP位点用Primer 3软件开发SNP引物，引物序列如表3所示。使用Sanger测序对RAD-seq测序获得的SNP进行验证，选择GS1a、GS4a、 TH7、SH14、HH23共5个样本对100个位点进行测序验证，扩增采用加尾引物，测序引物使用通用Common-F(AGTCACGACGTTGTAAAACGAC)，扩增体系和程序如下：

表1扩增程序

表2扩增体系

(2)开发试验

通过Sanger测序筛选获得具有初步多态性的29个位点，之后采用SNAPSHOT进行群体验证。实验流程如下：

取1μl DNA样本进行凝胶电泳鉴定条带，然后使用Nano-100紫外分光光度计测定DNA 浓度并将样品稀释到5～10ng/μl。引物稀释到实验要求浓度50μM，在扩增引物Premix体系 100μl中每条引物加入1μl，延伸引物Premix体系在25μl中每条引物加入1μl。

1)多重PCR反应(20μl)：

4μl扩增引物Premix，10μL ExTaq(HS)，2μL DNA，4μL H₂ O

程序：

95℃2min+(95℃20s+65°(TD-0.5/C)40s+72℃1min)*12+(95℃20s+59°30s+72℃1min)*24+72℃10min+4℃∞

2)PCR扩增产物纯化

在15μL PCR产物中加入5μL SAP酶和2μL Exonuclease I酶，37℃水浴60分钟，然后 75℃灭活15分钟。

3)SNAPSHOT多重单碱基延伸反应

5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2μL纯化后多重PCR产物，1μL延伸引物Premix， 2μL H₂O

程序：95℃10s+(95℃10s+50℃5s+60℃30s)*35+60℃30s+4℃∞

4)延伸产物纯化

在10μL延伸产物中加入1μL SAP酶，37℃水浴60分钟，然后85℃灭活15分钟。

5)延伸产物上ABI3730XL测序仪测序

取1μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD，8.5μL Hi-Di混匀，95℃变性5分钟后，上ABI3730XL测序仪测序

6)将ABI3730XL测序仪器上检测到的原始数据导入GeneMapper 4.0(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)进行分析。

预开发引物序列信息(表3)及分孔情况(表4)如下表所示：

表3预开发引物序列信息

表4分孔情况

经过2次开发实验，对引物序列、引物比例及实验体系进行优化，原29个位点中7个位点(Re654330_1、Re659448_1、Re687832_1、Re592992_1、Re689819_1、Re675055_1、Re677724_1)无法通过SNAPSHOT进行检测，将其取消后，剩余22个位点可按原方案进行SNAPSHOT检测。

实施例2

实施例2和3对太和水公司选育的矮型苦草(GS)及14个野生苦草群体(太湖TH、洪湖HH、上海SH、淮安HA、黄山HS、杭州HZ、广州GZ、大理DL、昆明KM、贵阳GY、柳州LZ、长沙CS、鹰潭YT、景德镇JDZ)为例，利用实施例1中筛选的22个SNP多态性位点进行鉴定过程并构建其系统发育树。

(1)样本采集及保存：采集太和水公司选育的矮型苦草(GS)及14个野生苦草群体(太湖TH、洪湖HH、上海SH、淮安HA、黄山HS、杭州HZ、广州GZ、大理DL、昆明 KM、贵阳GY、柳州LZ、长沙CS、鹰潭YT、景德镇JDZ)，实验室内清水暂养三天，然后使用5‰高锰酸钾稀释液浸泡15min，去除叶片表面微生物，避免后续DNA提取实验造成污染；浸泡后选取健康叶片清水洗净擦干，放入10ml离心管，标记好后放入-80℃冰箱冻存待用。

(2)植物组DNA提取：选用TIANGEN DP305试剂盒提取选取苦草材料的叶片基因组DNA。

(3)PCR扩增：利用实施例1中筛选所得22个SNP多态性引物对(如表3所示)进行PCR扩增。首先将表3的引物按表5比例混合，以提取的基因组DNA为模板扩增。

表5标记引物混合比例

引物工作液浓度为50μM，各加上正反向引物和去离子水后总体积100μl，扩增体系如下表：

表6扩增体系

试剂	体积(μl)
		EXTaq(HS)	5
Pmix	1
		H<sub>2</sub>O	3
DNA	1
		Total	10

其中EXTaq(HS)为Premix Ex Taq^TMHot Start Version，takara(RR030Q)；Pmix为表6中的引物混合液；DNA为浓度稀释到30ng/μl后加1μl。

扩增程序为：95℃2min；12×(94℃20s；65℃(TD-0.5/C)40s；72℃1min)；24×(94℃ 20s；59℃30s；72℃1min)；72℃10min。前12个循环退火温度每循环降低0.5℃。

实验操作如下：

1)根据实验样本量配置EXTaq、Pmix、H₂O预混液。

2)取96孔PCR板，每孔加入上述预混液9μl。

3)加入稀释后的DNA 1μl到孔中。

4)覆盖橡胶垫后，1500rpm离心30s。

5)放入PCR仪中，运行PCR程序。

备注：实验全程在冰盒上操作。

(4)PCR产物纯化：将步骤(3)总扩增产物按如下纯化体系及步骤操作。

表7纯化体系

试剂	体积(μl)
		H<sub>2</sub>O	1
FASTAP	1
		EXO 1	0.05
PCR产物	3
		Total	5

纯化程序：37℃50min；85℃15min；4℃forever

实验操作

1)根据样本量配置H20、FASTAP、EXOI预混液。

2)取新96孔PCR板，将2.1的PCR产物取3μl加入到新的PCR板中。

3)每孔加入1)中的预混液2μl。

4)覆盖橡胶垫后，1500rpm离心30s。

5)放入PCR仪中，运行纯化程序。

备注：实验全程在冰盒上操作。

(5)延伸反应：将步骤(4)得到的纯化产物按如下比例混合并进行延伸。

表8延伸引物混合比例

表9延伸体系

引物工作液50uM，延伸引物和去离子水后总体积25μl。

表10延伸体系

试剂	体积(μl)
		SNP KIT	1
Pmix	1
		纯化产物	3
Total	5

延伸程序：95℃30s；35×(95℃10s；50℃5s；60℃30s)；60℃30s；4℃forever 实验操作如下

1)根据实验样本量配置SNP KIT、Pmix预混液。

2)取96孔PCR板，加入上述纯化产物3μl。

3)每孔加入上述预混液2μl。

4)覆盖橡胶垫后，1500rpm离心30s。

5)放入PCR仪中，运行延伸程序。

备注：实验全程在冰盒上操作。

(6)延伸产物纯化：将步骤(4)得到的延伸产物按如下纯化体系及实验步骤操作

表11纯化体系

试剂	体积(μl)
		H<sub>2</sub>O	1.5
FASTAP	0.5
		延伸产物	5
Total	7

纯化程序：37℃50min；85℃15min；4℃forever

实验操作

1)根据样本量配置H₂O、FASTAP预混液。

2)将1)的预混液加入到2.3延伸产物中

3)覆盖橡胶垫后，1500rpm离心30s。

4)放入PCR仪中，运行纯化程序。

备注：实验全程在冰盒上操作。

(7)毛细管电泳检测：将步骤(6)得到的纯化产物按下列体系及操作检测

表12检测体系

试剂	体积
		Liz 120	0.5μl
HiDi	8.5μl
		纯化后产物	1μl
total	10μl

测序仪3730xl参数设置如图1所示。

实验操作

1)预配置LIZ120、HIDI预混液。

2)取96孔板，每孔加入9μl的1)预混液。

3)加入1μl纯化产物到96板孔中。

4)覆盖橡胶垫后，1500rpm离心30s。

5)放入PCR仪中，95℃运行5min。

6)经过5)处理后的产物上毛细管电泳检测(3730xl)。

7)数据读取：将步骤6)得到的检测合格的样品上机读取数据，数据采用GeneMapper 4.0(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)软件进行读取；内标选择 GS120-LIZ。根据产品介绍内标片段大小分别为15，20，25，35，50，62，80， 110，120。分析相关的panel、bin和Analysis Methods文件。bin文件中每个位点的等位基因位置可根据实际位置微调。

8)对分型结果进行判定，预设判定方案如下：

a)分型图谱目的区域有正常峰型：正常读取等位基因。

b)分型图谱中有杂峰干扰：按空值Null处理。

c)分型图谱中目的区域无分型结果：按空值Null处理。

d)所有位点分型结果完全一致：一致度P＝100％，属于太和水选育群体(GS)。计算公式：P＝(m-n)/(m-u)*100％；P：一致度、n：差异位点数、m：位点总数(22)、u： Null值位点数。

e)存在分型结果不一致位点：一致度越高(相同位点数越多)，与GS群体关系更近。空值Null：做剔除处理，即在计算P值时剔除Null位点。

9)300个样本一致度结果见表13-1至表13-5。样本的来源见表13-6。

表13-1样本一致度

表13-2样本一致度

表13-3样本一致度

表13-4样本一致度

表13-5样本一致度

表13-6样本来源

采样点	经度	纬度	样本编号
				上海市金山区	121°21'34.7"E	30°50'50.9"N	GS1～GS30
江苏苏州市高新区	120°29'00.2"E	31°12'40.5"N	TH1～TH30
				上海市浦东新区	121°50'09.1"E	30°51'39.5"N	SH1～SH30
江苏淮安市淮阴区	118°55'52.1"E	33°26'30.0"N	HA1～HA30
				湖北荆州市监利市	113°15'10.2"E	29°49'12.1"N	HH1～HH30
安徽黄山市屯溪区	118°20'55.4"E	29°43'07.5"N	HS1～HS30
				浙江杭州市下城区	120°11'0.36"E	30°16'48.77"N	HZ1～HZ30
广东广州市黄浦区	113°27'8.18"E	23°5'40.7"N	GZ1～GZ30
				云南大理白族自治州大理市	100°13'44.86"E	25°37'0.07"N	DL1～DL30
云南昆明市呈贡区	102°46'47.1"E	24°51'01.5"N	KM1～KM30
				贵州贵阳市观山湖区	106°35'33.49"N	26°38'16.03"N	GY1～GY30
柳州柳州市城中区	109°27'47.9"E	24°21'01.7"N	LZ1～LZ30
				湖南长沙市望城区	112°56'08.4"E	28°18'59.3"N	CS1～CS30
江西鹰潭市月湖区	117°04'03.6"E	28°16'29.1"N	YT1～YT30
				江西景德镇市昌江区	117°10'12.7"E	29°15'07.3"N	JDZ1～JDZ30

实施例3构建系统发育树

样本采集、提取基因组DNA、PCR扩增程序同实施例2。对PCR扩增产物进行测序。根据测序结果，使用本申请中所述22个多态性SNP位点对15个群体(18个样本)构建系统发育树，建树使用Phylip.695，按照最大似然法(Maximum Likelyhood Method)构建ML聚类图(图2)。根据构建的系统发育树可直观的看出待测苦草与太和水有限公司选育的矮型苦草品系间的群体亲缘关系。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海太和水环境科技发展股份有限公司

上海海洋大学

<120> 苦草鉴定相关SNP标记及其用途

<160> 102

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattctttca aaccctcaga gcaacgtggt ctttttatar ccgtaggatc ctagatccaa 60

cgggtaagaa tccttgtacg cattacaagg aggctttgca acactaaagt 110

<210> 2

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaggatggt ccatcatgag ttccatcttg gagtattagt agcagtagta gggatgcaaa 60

cggatacrga tatatccgtt tccgtccgct tatatctact accat 105

<210> 3

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaattttat tttttgaatc tgacaatcat caattccttc ataaaagaaa gtkaatttga 60

caagggtcct tcattgaaaa gaaaaaaaca gtgatcttgt gccac 105

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaccaatgg gattgtcttc ccccaaagtt ttctcttgaa tctatcaatg attttgatgg 60

gaatctctcg raaagtcaag tcctcctgga catctaccac tggct 105

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttatggttt tgagcatgaa acaaccttgg aaggttgtag gagcgtggat tcgtgtttct 60

crtcgtgttg aggtagggat catacctatt ctctataacg tcccg 105

<210> 6

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccattaagt tgtttgttca tcgcattact tttaacctca actgtcgtct catattcgat 60

aaaasttctt gtattatgca ggatttggca gcaaggaaga ggatt 105

<210> 7

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aattcgggaa gaggattcag gttatgatta gataagtcta gcctccctta agagggactg 60

ctaragggct tgaagccttg ataattgcct aatagaagtt aggtgaaggc 110

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctgcatgcc caatacatat ccgtccgccg tggtcacctg agtygcggct ctatttctca 60

tgtttgtttg cagccaattt tgcaaaaact agtgtgagct tgtgt 105

<210> 9

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taacatttgg cttaatgtct tcggagatgc ctcgggtttg atggttaata aaaataaatt 60

tggtttttwa ctatttagtt tccttgatga tgagaaccat tagtt 105

<210> 10

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctacaaagct tcagtgattg taataaaaca cgatctattc actgaaataa catacratat 60

aattgcttct catccaatta ttagctctac caactcttct tatcc 105

<210> 11

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acttggaagt gggaatggca gcaagagcaa caatacctgt agcgctcaac ccaagggaag 60

yagtagcatg gacatcctgg gtagagttgg agtgcaacat attca 105

<210> 12

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctgtggttt tgagcgtggc ttgaccaaag gagtcttgta gaacgtggat tcgtgtttcg 60

ygacgttcta aggtaggtat cctacccatt ttcatagtca tttat 105

<210> 13

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcctaattc tcaactcata tccctaaggg aagaagattt tgatgatcyc tcagaattgt 60

ctgccatact tcctctcatg gaccctccat ttgagaagat cactc 105

<210> 14

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttgtggttt cgagtgtaga atgaccaagg aaggctagag gaacgtggat tcrtgtttcc 60

cgacgtgttg agatagggat caatcatatt tccgtagcca tttga 105

<210> 15

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catccattct aggttgacaa cttgacatct ctttattyag gagatagggg gagtgtacat 60

ataatttgat gtgagttcca tccatgccta gttaaggctt acaaa 105

<210> 16

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagctctttc atgcagacaa cggctcaatt cccagcaagg agaatgatca ccacyagttg 60

ctctccgttt gtgatgccct gttcccggaa tacccaatag gtgga 105

<210> 17

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tttacctcaa tcactctgaa gaggaaatca gatggatgga tttttcaagt tgtcaatack 60

tatggtccat gagccccgga atgcaaacct cactttttaa aggaa 105

<210> 18

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatattgaat atatccatcc agactttaaa cttccaaatt ccttctttga cagacacctt 60

ctrgagcact atgtctactg ctactgactc tttaggcttg cacaa 105

<210> 19

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggattttgtt ggtcgcaagt aattaagtgg aattgtgaat ataccrtgta gtagttggag 60

gcatgaacta tctagttcca gtgagctggt ggttaaatta tttct 105

<210> 20

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccattgagg tcatgaaggc ttttagagga gagggaaaaa ctatagacyg tgggtccatt 60

gaagaatgta gaactattca agaattggat gacttcacat ccgtg 105

<210> 21

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaaagttgaa ttgataaaac gtggcatttt ttacaaacta aagatactga cctctytgaa 60

cccagggaaa caagatgaat aggaaaggga ccaagaacat gtaat 105

<210> 22

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acatgcttcc ctccattctc gaccgactct ttctcaggta tctcctttat acggyccaat 60

tcctgtgaga cagagagcac agccgcatca aacgataaca cattg 105

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcaaaccct cagagcaacg 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aatgcgtaca aggattctta ccc 23

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttggagtatt agtagcagta gtaggga 27

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggtagtaga tataagcgga cgga 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgaatctgac aatcatcaat tcct 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tttttctttt caatgaagga ccct 24

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttcccccaaa gttttctctt ga 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cagtggtaga tgtccaggag ga 22

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

catgaaacaa ccttggaag 19

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gggacgttat agagaatagg tatgatc 27

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gttgtttgtt catcgcatta ctttta 26

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

atcctcttcc ttgctgcca 19

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gggaagagga ttcaggttat gatta 25

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttctattagg caattatcaa ggct 24

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gcccaataca tatccgtccg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tggctgcaaa caaacatgag 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tgggatagca gaaatgggga 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gcattgtcag ttggttgttg g 21

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cggagatgcc tcgggttt 18

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

actaatggtt ctcatcatca aggaaa 26

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gcttcagtga ttgtaataaa acacgat 27

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gttggtagag ctaataattg gatgaga 27

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ggcagcaaga gcaacaatac c 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gcactccaac tctacccagg at 22

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ggcttgacca aaggagtctt gta 23

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

aaatgactat gaaaatgggt aggata 26

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

tgcctaattc tcaactcata tccc 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agtgatcttc tcaaatggag ggtc 24

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

agtgtagaat gaccaaggaa gg 22

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aaatggctac ggaaatatga ttga 24

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tcgtgctttt tatcagtatt aagaag 26

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ttgtttcatt atcagcattt cca 23

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

catccattct aggttgacaa cttga 25

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ttgtaagcct taactaggca tgg 23

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gcagacaacg gctcaattcc 20

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aacagggcat cacaaacgg 19

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

aatcagatgg atggattttt caa 23

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

aaagtgaggt ttgcattccg 20

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

gctcgtggtg tcttgctact tg 22

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

caactgatat cggggctatg c 21

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ttaaacttcc aaattccttc tttgac 26

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

aagcctaaag agtcagtagc agtagac 27

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

ggattttgtt ggtcgcaagt aa 22

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cagctcactg gaactagata gttcatg 27

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

cacgtagcat gtctttggca a 21

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

attgttggga ttatattgga agtg 24

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

cccatgaggt cgtgatgaag 20

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

tgcttttaag gcaattcctt tct 23

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

aaggctttta gaggagaggg aa 22

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

gatgtgaagt catccaattc ttgaa 25

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

ttgaattgat aaaacgtggc at 22

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

atgttcttgg tccctttcct att 23

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acaaccccat gcttgagcc 19

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ccattcgccg tgagattctt 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

catgcttccc tccattctcg 20

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

tgcggctgtg ctctctgtc 19

<210> 79

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

tcaatttgag ttctttacat ttcacc 26

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

tggttgttca atggaaccta caat 24

<210> 81

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

tttttttttt tttttcagag caacgtggtc tttttata 38

<210> 82

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

tttttttttt tttttttttt tttttatcaa ggcttcaagc cct 43

<210> 83

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

tttttttttt tttttttttt ttttccaaat cctgcataat acaagaa 47

<210> 84

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

tttttttttt tttttttttt ttttttttta tgtccaggag gacttgactt t 51

<210> 85

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttaaacat gagaaataga gycgc 55

<210> 86

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt gatccctacc tcaacacga 59

<210> 87

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt taatgaagga cccttgtcaa 60

att 63

<210> 88

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

ttttttcctt ctttgacaga caccttct 28

<210> 89

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

ttttttttct aagggaagaa gattttgatg atc 33

<210> 90

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

tttttttttt acacgatcta ttcactgaaa taacatac 38

<210> 91

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

tttttttttt tttttttttt ttttttttta gggatgcaaa cggatac 47

<210> 92

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

tttttttttt tttttttttt ttttttctca tcatcaagga aactaaatag t 51

<210> 93

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

tttttttttt tttttttttt tttttttttt gatggatttt tcaagttgtc aatac 55

<210> 94

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttctc aggtatctcc tttatacgg 59

<210> 95

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt taggatacct accttagaac 60

gtc 63

<210> 96

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttacaaac taaagatact 60

gacctct 67

<210> 97

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

ttttttttcc caggatgtcc atgctact 28

<210> 98

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

ttttttttgt tgacaacttg acatctcttt att 33

<210> 99

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

tttttttttt tttttttcat cacaaacgga gagcaayt 38

<210> 100

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

tttttttttt tttttttttt ttttcatgcc tccaactact aca 43

<210> 101

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tagaggagag ggaaaaacta tagac 55

<210> 102

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaggctaga ggaacgtgga 60

ttc 63

Claims (8)

1.一组苦草鉴定相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记包括以下中的一种或几种：

1)第一SNP标记，所述第一SNP标记为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第40位碱基A或G；

2)第二SNP标记，所述第二SNP标记为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列自5’端起第68位碱基G或A；

3)第三SNP标记，所述第三SNP标记为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列自5’端起第53位碱基G或T；

4)第四SNP标记，所述第四SNP标记为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列自5’端起第71位碱基G或A；

5)第五SNP标记，所述第五SNP标记为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列自5’端起第62位碱基G或A；

6)第六SNP标记，所述第六SNP标记为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列自5’端起第65位碱基C或G；

7)第七SNP标记，所述第七SNP标记为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列自5’端起第64位碱基A或G；

8)第八SNP标记，所述第八SNP标记为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列自5’端起第44位碱基T或C；

9)第九SNP标记，所述第九SNP标记为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列自5’端起第69位碱基A或T；

10)第十SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列自5’端起第56位碱基G或A；

11)第十一SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列自5’端起第61位碱基C或T；

12)第十二SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列自5’端起第61位碱基C或T；

13)第十三SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列自5’端起第49位碱基C或T；

14)第十四SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列自5’端起第53位碱基A或G；

15)第十五SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列自5’端起第38位碱基T或C；

16)第十六SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列自5’端起第55位碱基C或T；

17)第十七SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列自5’端起第60位碱基T或G；

18)第十八SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列自5’端起第63位碱基G或A；

19)第十九SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列自5’端起第46位碱基A或G；

20)第二十SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列自5’端起第49位碱基T或C；

21)第二十一SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列自5’端起第56位碱基C或T；

22)第二十二SNP标记，所述第十SNP标记为SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列自5’端起第55位碱基T或C。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述苦草鉴定为苦草品系鉴定。

3.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述苦草鉴定为矮型苦草品系鉴定。

4.一组用于苦草鉴定的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测权利要求1-3任一所述SNP标记的引物对。

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列选自SEQ IDNO.23～SEQ ID NO.66中的一项或多项。

6.一种用于苦草鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4或5所述的引物组。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂、利用权利要求4或5所述的引物组进行PCR反应的试剂。

8.权利要求1-3任一所述的SNP标记、权利要求4-5任一所述的引物组或权利要求6-7任一所述的试剂盒在苦草品系鉴定、建立苦草分子辅助育种技术平台、选育优质苦草品系以及评价苦草品系遗传特征中的用途。

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