CN117646083B - 用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别引物及鉴定方法 - Google Patents
用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别引物及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，公开了一种鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的KASP引物组以及鉴别方法。本发明筛选出了能够鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的特异性引物组，采用本发明的引物组不仅可以实现两种柳树种间杂交子代的鉴定，还能够排除花粉污染的杂交子代；本发明的鉴定方法可以代替传统的PCR鉴定方法，方便快捷的实现簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代准确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别引物及鉴定方法。
背景技术
柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)树种的统称，具有自然分布广、遗传变异丰富、无性繁殖容易、生长速度快、适应性强等特征，广泛应用于防风固沙、生态修复、生物质能源林和园林绿化等。柳属资源丰富，全球有520多个种，其中分布在中国的有257个种，122个变种和33种变型，柳属还存在大量的种间杂交种。近年来柳树育种学家充分利用柳属种间易于杂交的特性，大量开展种间杂交选育速生、抗逆性强的柳树新品种选育研究。簸箕柳(S.suchowensis)和三蕊柳(S.triandra)是柳编工艺品的主要原材料之一，簸箕柳原产江苏，主要分布在山东南部、江苏、浙江北部和河南东部，而三蕊柳主要分布在东三省及山东、江苏和浙江等地。近年来研究发现，柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)是危害簸箕柳的主要食叶害虫之一，而三蕊柳对柳蓝叶甲具有完全抗性。利用簸箕柳和三蕊柳配制种间杂交，有望选育出速生、抗柳蓝叶甲的新品种。但开展种间杂交子代的真实性鉴定是育种学家和科研工作者的一个首要任务。
形态特征是传统植物传统分类的最基本和最直接的方法，但柳属植物为柔荑花序，花部形态简单，且同种不同居群间的特征变异也较大，通过形态学鉴定柳属种间杂交子代的真实性耗时耗力。随着分子生物学的发展，RAPD、AFLP、SSR等标记均被用于柳树亲缘关系分析或种间杂交子代的真实性鉴定，但RAPD标记一般采用琼脂糖凝胶进行分离，分辨率较低，而AFLP和SSR标记一般需要对引物5’端进行荧光基团标记，且分型需要用ABI3730XL等专用仪器，操作复杂且成本较高。
关于柳树种间杂交子代的鉴别，Hardig(2000)等用43个RAPD标记、一个cpDNA基因的限制性酶切片段和rDNA测序来证明Salix sericea和S.eriocephala的种间杂交，但是RAPD分辨率低，限制性酶切片段和测序操作复杂、测序成本较高。之后Fogelqvist(2015)采用GoldenGate Assay对384个SNP位点和4个cpSSR位点对三种柳树种间杂交进行检测，发现19％的子代为真实的柳树种间杂交个体，但是GoldenGate Assay检测SNP位点耗时耗力，而且成本较高。Seo等利用雌、雄花各12个和9个形态学特征准确鉴定了黄花柳(S.caprea)和细柱柳(S.gracilistyla)的种间杂交子代(Seo et al.,2021)，但柳属植物为柔荑花序，花部形态简单，且同种不同居群间的特征变异也较大，通过形态学鉴定柳属种间杂交子代的真实性耗时耗力。
随着高通量测序技术的发展，遍布于基因组的SNP标记成为第三代分子标记而被广泛用于重要性状基因定位、分子标记辅助选择育种、品种指纹图谱构建等。常用的SNP位点检测方法有Sanger测序法、TaqMan荧光探针法、液相芯片杂交法和竞争性等位基因特异性PCR法(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)法。其中KASP标记技术是英国KBioscience公司研发的SNP位点高通量检测方法，该方法克服了直接测序法和TaqMan荧光探针法成本高的缺点，被广泛应用于位点少、样本量多的SNP分型中。而现有技术中并未有成熟应用的用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别的KASP标记及引物。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别引物及鉴定方法，提高柳树中间杂交子代
第一方面，本发明提供了一种用于簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的鉴别引物，所述引物组合包括如下(a)-(d)中任一，
所述(a)包括SEQ ID NO.1-2所示的正向引物，SEQ ID NO.3所示的反向通用引物；
所述(b)包括SEQ ID NO.4-5所示的正向引物，SEQ ID NO.6所示的反向通用引物；
所述(c)包括SEQ ID NO.7-8所示的正向引物，SEQ ID NO.9所示的反向通用引物；
所述(d)包括SEQ ID NO.10-11所示的正向引物，SEQ ID NO.12所示的反向通用引物。
进一步地，所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、所述SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、所述SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、所述SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的5’端连接有不同的荧光基团标签。
进一步地，所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10的5’端连接有SEQ ID NO.13所示的荧光标记序列。
进一步地，所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11的5’端连接有SEQ ID NO.14所示的荧光标记序列。
第二方面，本发明还提供了一种用于鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括本发明第一方面所述的KASP引物组。
第三方面，本发明还提供了第一方面所述的KASP引物组或第二方面所述的检测试剂盒在鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的方法，
以待测柳树的基因组DNA为模板；
采用第一方面所述的KASP引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
再采用荧光检测平台对扩增产物进行荧光信号扫描与基因分型；
最后扩增产物于37℃保温1min，读取并解析荧光信号，得到清晰直观的基因分型图。
进一步地，若待测柳树现蓝色信号，则该柳树品种为簸箕柳，
进一步地，若待测柳树现红色信号，则该柳树品种为三蕊柳，
进一步地，若待测柳树现绿色信号，则该柳树品种为簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代。
进一步地，所述PCR扩增体系为20μL：10μL 2×CAST-PCR Genotyping MasterMix，2μL 30ng/μL DNA模版，0.15μL 20μM的一条正向引物，0.15μL 20μM的另一条正向引物，0.4μL 20μM的反向引物，用ddH2O补充体积到20μL。
进一步地，所述PCR扩增程序：请补充本申请的扩增程序；37℃1min并采集荧光信号；95℃预变性15min；95℃变性20s，62℃延伸1min，共10个循环，每个循环温度降低0.6℃；95℃变性20s，56℃延伸1min，共34个循环，每个循环结束后分别采集荧光信号；37℃1min并采集荧光信号。
与现有技术相比，本发明筛选出了能够鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的特异性引物组，采用本发明的引物组不仅可以实现两种柳树种间杂交子代的鉴定，还能够排除花粉污染的杂交子代；本发明的鉴定方法可以代替传统的PCR鉴定方法，方便快捷的实现簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代准确鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。
图1为实施例2中KASP分型图：X轴和Y轴的散点图表示簸箕柳、三蕊柳及种间杂交子代的标记鉴别；蓝点、红点和绿点分别代表母本簸箕柳纯合子、父本三蕊柳纯合子和种间杂交子代杂合子。
图2为实施例3中KASP分型图：X轴和Y轴的散点图表示簸箕柳、三蕊柳及种间杂交子代的标记鉴别；蓝点、红点和绿点分别代表母本簸箕柳纯合子、父本三蕊柳纯合子和种间杂交子代杂合子。
图3为实施例4中KASP分型图：X轴和Y轴的散点图表示簸箕柳、三蕊柳及种间杂交子代的标记鉴别；蓝点、红点和绿点分别代表母本簸箕柳纯合子、父本三蕊柳纯合子和种间杂交子代杂合子。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
实施例1
将三蕊柳15个个体和簸箕柳2个个体的重测序序列比对到簸箕柳基因组，采用FreeBayes的方法，在三蕊柳全基因组内共检测到674,144个和簸箕柳相比为纯合突变的位点，这些SNP位点初步认定为是簸箕柳和三蕊柳特异的。从每条染色体上随机选择10个位点，共190个SNP位点用于KASP引物设计，最后合成10组引物用于实验验证。
实施例2
利用杂交组合母本XY12(簸箕柳)及5个簸箕柳雄性个体、测序的15个三蕊柳个体及2个偏父本型的杂交子代，提取植株基因组DNA，以双蒸水为对照，对合成的10组引物组进行初步筛选，经ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测。
采用PCR扩增体系为20μL：10μL 2×CAST-PCR Genotyping Master Mix，2μL30ng/μL DNA模版，0.15μL(20μM)正向引物1，0.15μL(20μM)正向引物2，0.4μL(20μM)反向引物，用ddH2O补充体积到20μL。
所述PCR扩增程序：37℃1min并采集荧光信号；95℃预变性15min；95℃变性20s，62℃延伸1min，共10个循环，每个循环温度降低0.6℃；95℃变性20s，56℃延伸1min，共34个循环，每个循环结束后分别采集荧光信号；37℃1min并采集荧光信号。
检测结果发现，引物组Stri08_82809在簸箕柳和三蕊柳中均能扩增出纯合特异性的位点，而在杂交子代中能同时扩增出包含两个树种的特异性位点(图1中A)。同样，引物Stri14_11602(图1中B)、Stri14_12274(图1中C)和Stri17_17031(图1中D)在簸箕柳和三蕊柳中也均能扩增出纯合特异性的位点，而在杂交子代中能同时扩增出包含两个树种的特异性位点(图1中A-D)，引物序列如表1所示。
表1引物组核苷酸序列
其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10的5’端连接有SEQID NO.13所示的荧光标记序列，SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11的5’端连接有SEQ ID NO.14所示的荧光标记序列。
实施例3
采用扩大自然群体数量来验证引物的种特异性。利用簸箕柳和三蕊柳的自然群体各选取的12个和30个个体，提取植株基因组DNA，以双蒸水为对照，对上述四个组引物进行种间特异性的进一步验证。
采用PCR扩增体系为20μL：10μL 2×CAST-PCR Genotyping Master Mix，2μL30ng/μL DNA模版，0.15μL(20μM)正向引物1，0.15μL(20μM)正向引物2，0.4μL(20μM)反向引物，用ddH2O补充体积到20μL。
所述PCR扩增程序：37℃1min并采集荧光信号；95℃预变性15min；95℃变性20s，62℃延伸1min，共10个循环，每个循环温度降低0.6℃；95℃变性20s，56℃延伸1min，共34个循环，每个循环结束后分别采集荧光信号；37℃1min并采集荧光信号。
经荧光定量PCR检测结果表明，四组引物在簸箕柳和三蕊柳自然群体内都是保守的。
引物组Stri08_82809在簸箕柳自然群体12个个体中均为纯合G/G，在三蕊柳自然群体的30个个体中均为纯合A/A，而在真实杂交子代中为杂合G/A(图2中A)。
引物组Stri14_11602在簸箕柳自然群体的12个个体中均为纯合T/T，在三蕊柳自然群体的30个个体中均为纯合C/C，而在真实杂交子代中为杂合T/C(图2中B)。
引物组Stri14_12274在簸箕柳自然群体的12个个体中均为纯合A/A，在三蕊柳自然群体的30个个体中均为纯合G/G，而在真实杂交子代中为杂合A/G(图2中C)。
引物组Stri17_10731在簸箕柳自然群体的12个个体中均为纯合T/T，在三蕊柳自然群体的30个个体中均为纯合C/C，而在真实杂交子代中为杂合T/C(图2中D)。
实施例4
提取簸箕柳、三蕊柳和杂交子代的DNA，将DNA稀释至30ng/μL，利用上述筛选的4组种特异性引物对亲本簸箕柳和三蕊柳，以及杂交子代进行扩增，采用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪进行杂交子代基因型检测。
采用PCR扩增体系为20μL：10μL 2×CAST-PCR Genotyping Master Mix，2μL30ng/μL DNA模版，0.15μL(20μM)正向引物1，0.15μL(20μM)正向引物2，0.4μL(20μM)反向引物，用ddH2O补充体积到20μL。
所述PCR扩增程序：37℃1min并采集荧光信号；95℃预变性15min；95℃变性20s，62℃延伸1min，共10个循环，每个循环温度降低0.6℃；95℃变性20s，56℃延伸1min，共34个循环，每个循环结束后分别采集荧光信号；37℃1min并采集荧光信号。
在对簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的真实性检测，结果显示，引物Stri08_82809在母本簸箕柳中扩增的位点为纯合G/G(图3中A中蓝色圆点)，在父本三蕊柳中扩增的位点为纯合A/A(图3A中红色圆点)，而在杂交子代中，有29个个体同时扩增出G/A杂合位点(图3中A中绿色圆点)，这个杂合位点分别来源于簸箕柳和三蕊柳，说明这些杂交子代中均含有簸箕柳和三蕊柳的遗传信息，为真实的种间杂交子代。但是有两个杂交子代AbF1-003和AbF1-025的扩增结果和母本簸箕柳完全相同，为纯合G/G位点(图3中A中蓝色圆点)，说明这两个个体可能为簸箕柳花粉污染个体。
同样地，引物Stri14_11602在母本簸箕柳中扩增的位点为纯合T/T(图3中B中蓝色圆点)，在父本三蕊柳中扩增的位点为纯合C/C(图3中B中红色圆点)，也在这29个个体中扩增出杂合T/C位点，基因型为T/C(图3中B中绿色圆点)，说明这些这29个个体中均含有簸箕柳和三蕊柳的遗传信息，为真实的种间杂交子代，同样AbF1-003和AbF1-025的扩增结果和母本簸箕柳完全相同的纯合位点(图3中B中蓝色圆点)。
引物Stri14_12274和Stri17_17031的扩增结果和上述两对引物结果一致，在亲本中均扩增出纯合位点，而在真实的杂交子代中扩增出杂合位点，结果见图3C-D。
上述在四个位点扩增结果证实了这29个个体为簸箕柳和三蕊柳真实的种间杂交子代，而AbF1-003和AbF1-025为簸箕柳花粉污染的杂交子代。
因此，本发明的引物组不仅可以实现两种柳树种间杂交子代的鉴定，还能够排除花粉污染的杂交子代；本发明的鉴定方法可以代替传统的PCR鉴定方法，方便快捷的实现簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代准确鉴定。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (7)
1.一种鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的KASP引物组，其特征在于，所述引物组包括如下（a）-（d）中任一，
所述（a）包括SEQ ID NO.1-2所示的正向引物，SEQ ID NO.3所示的反向通用引物；
所述（b）包括SEQ ID NO.4-5所示的正向引物，SEQ ID NO.6所示的反向通用引物；
所述（c）包括SEQ ID NO.7-8所示的正向引物，SEQ ID NO.9所示的反向通用引物；
所述（d）包括SEQ ID NO.10-11所示的正向引物，SEQ ID NO.12所示的反向通用引物；
其中，所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10的5’端连接有SEQID NO.13所示的荧光标记序列，所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.11的5’端连接有SEQ ID NO.14所示的荧光标记序列。
2.一种用于鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的KASP引物组。
3.权利要求1所述的KASP引物组或权利要求2所述的检测试剂盒在鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代中的应用。
4.一种鉴别簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的方法，其特征在于，以待测柳树的基因组DNA为模板；
采用权利要求1所述的KASP引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
再采用荧光检测平台对扩增产物进行荧光信号扫描与基因分型；
最后扩增产物于37℃保温1 min，读取并解析荧光信号，获得基因分型图。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基因分型为，
若待测柳树现蓝色信号，则该柳树品种为簸箕柳，
若待测柳树现红色信号，则该柳树品种为三蕊柳，
若待测柳树现绿色信号，则该柳树品种为簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为20 μL：10 μL 2 ×CAST-PCR Genotyping Master Mix，2 μL 30 ng/μL DNA模版，0.15 μL 20 μM的一条正向引物，0.15 μL 20 μM的另一条正向引物，0.4 μL 20 μM的反向引物，用ddH2O补充体积到20μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序：37℃ 1 min并采集荧光信号；95℃ 预变性15 min；95℃变性20 s，62℃延伸1 min，共10个循环，每个循环温度降低0.6℃；95℃变性20 s，56℃延伸1 min，共34个循环，每个循环结束后分别采集荧光信号；37℃ 1 min并采集荧光信号。
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