CN102618659A - 鸭性别鉴定用pcr引物、鉴定方法及试剂盒 - Google Patents

鸭性别鉴定用pcr引物、鉴定方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭性别鉴定用PCR引物，引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。另外，本发明还提供了一种利用鸭性别鉴定用PCR引物鉴定鸭性别的方法和包含所述鸭性别鉴定用PCR引物的试剂盒，该方法为：以待测鸭的总DNA为模板，采用鸭性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，判定鸭性别。本发明利用同时存在于鸭性染色体W染色体和Z染色体上的CHD1基因序列合理设计PCR引物，然后结合PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术确定个体鸭的性别，具有操作简单方便，鉴别快速，结果准确等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力，易出错的缺点。

Description

鸭性别鉴定用PCR引物、鉴定方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种鸭性别鉴定用PCR引物、鉴定方法及试剂盒。
背景技术
目前，鸭子性别的鉴定方法一般为外形鉴别法、鸣管鉴别法、摸肛鉴别法和翻肛鉴别法。外形鉴别法和鸣管鉴别法虽然简单方便，但准确率较低，容易出现鉴别错误；而摸肛鉴别法和翻肛鉴别法必须在鸭子出壳后12h内进行操作，在此时间内，雌雄雏鸡生殖隆起的性状最显著，孵出后24小时以上，肛门发紧，难于翻开，而且生殖突起萎缩，甚至陷入泄殖腔深处，不便观察。
因此，需要开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别鸭子性别的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于胚胎期及出雏后鸭性别快速鉴定的PCR引物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鸭性别鉴定用PCR引物PF(SEQ ID NO.1)和PR(SEQ ID NO.2)，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物PF：5′-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3′；
下游引物PR：5′-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3′。
本发明还提供了一种利用上述鸭性别鉴定用PCR引物鉴定鸭性别的方法，其特征在于，该方法为：以待测鸭的总DNA为模板，采用鸭性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物只出现495bp的特异性扩增条带时判定为雄性鸭，当扩增产物出现495bp的特异性扩增条和351bp的特异性扩增条时判定为雌性鸭。
上述的方法，所述PCR扩增的反应体系由以下成分组成：模板DNA45ng～55ng，2×PCR扩增缓冲液12.5μL，5μmol/L上游引物2μL，5μmol/L下游引物2μL，加水至25μL。
上述的方法，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，然后经94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
上述的方法，所述495bp的特异性扩增条带的核苷酸序列(SEQ IDNO.3)为：
AGTGCATTGC AGAAACAATA TTACAAGTAA CTATTTTCTT TAAATTTCAT CGTTTTAATT    60
ATATGTCTGC ATACAAATTA CTGGTTTAAT ATTTTTCATA ATGCAGTCTG AATTTGGGGC    120
AAAATAGTAA AAATCAAGCA CCTTTTTAGG ATTTCATAAC AGTAAAGTTC TGTGAAGCAG    180
AGGTTTATTG GTCTAATCTG TCTATTTTGC TTCTGTTGTT TGGCGTATTT GTATATTTTC    240
ACTAGGACTT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA GTTTGTTTAT ATTTTGAGAG CTTGTCTTGC    300
CTCCACATAT GGTTATTTAC ACCATGTCTT ATGTCATAGG TGGATTTTAA CAAGGAATTA    360
TAAAGCCCTC AGTAAAGGTT CAAAAGGCAG TACCTCTGGC TTTCTGAACA TTATGATGGA    420
ACTCAAAAAG TGTTGTAACC ATTGCTACCT CATTAAACCA CCAGATGATA ATGAATTCTA    480
TAATAAACAG GAGGC                                                     495
上述的方法，所述351bp的特异性扩增条带的核苷酸序列(SEQ IDNO.4)为：
AGTGCATTGC AGAAGCAATA TTACAAGTAA GTAATGACAC TTTTAAAATC GCACTATTTT    60
AATTAGATGT CTGTATGAAA AGTAATGAAG TGTAATAGTT TTCATGATGC AATTTGAAAT    120
GATATTTTGA GAGCTTACCA TTTGTGGAAA TATGACATGT TAGAAATTAC TTCCACTACA    180
CGTTTTATAT CATAGGTGGA TTTTAACCAG GAATTATAAA GCCCTGAGTA AAGGTTCAAA    240
AGGCAGTACC TCAGGCTTTT TGAACATCAT GATGGAACTC AAGAAGTGTT GTAACCATTG    300
CTACCTCATT AAACCACCAGATGATAATGAATTCTATAATAAACAGGAGGC    351
另外，本发明还提供了一种鸭性别鉴定用试剂盒，其特征在于，包含上述鸭性别鉴定用PCR引物。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明利用同时存在于鸭性染色体W染色体和Z染色体上的CHD1基因序列合理设计PCR引物，然后结合PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术，根据PCR扩增片段的长度检测个体鸭是否含有W染色体，从而确定个体鸭的性别，具有操作简单方便，鉴别快速，结果准确等优点，避免了采用传统方法耗时、耗力，易出错的缺点。
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例2的PCR扩增产物的部分电泳图谱。
具体实施方式
实施例1
利用同时存在于鸭性染色体W染色体和Z染色体上的CHD1基因序列设计一对PCR引物PF(SEQ ID NO.1)和PR(SEQ ID NO.2)；所述引物的序列为：
上游引物PF：5′-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3′；
下游引物PR：5′-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3′。
本发明的鸭性别鉴定方法通过以下实施例2和实施例3进行描述：
实施例2
步骤一、将102只高邮鸭的抗凝血液经常规裂解和消化处理后，应用传统的苯酚/氯仿法提取总DNA，并将总DNA浓度稀释至50ng/μL作为模板DNA；
步骤二、采用含有PCR引物PF(SEQ ID NO.1)和PR(SEQ ID NO.2)的试剂盒对步骤一中所述模板DNA中的CHD1基因进行PCR扩增，PCR扩增反应体系(25μL体系)为：模板DNA 45ng～55ng，2×PCR扩增缓冲液12.5μL，5μmol/L上游引物2μL，5μmol/L下游引物2μL，加水至25μL；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，然后经94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min；
步骤三、取5μL步骤二中所得PCR扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，部分电泳图谱见图1，图中从左至右，其中泳道1-8为高邮鸭样品，泳道9为Marker，结果显示：第一泳道、第二泳道、第六泳道和第七泳道均显示两条条带，两条条带分别为核苷酸序列见SEQ ID NO.3的495bp的特异性扩增条带和核苷酸序列见SEQ ID NO.4的351bp的特异性扩增条带和核苷酸序列，命名为ZW型，属雌性鸭；第三泳道、第四泳道、第五泳道和第八泳道均显示一条核苷酸序列见SEQ IDNO.3的495bp的特异性扩增条带，命名为ZZ型，属雄性鸭；鉴定结果与高邮鸭个体性别记录结果一致，见表1。
表1高邮鸭鉴定结果
  基因型   ZZ型   ZW型
  数量(只)   48   54
实施例3
步骤一、将8只山麻鸭、8只兴义鸭、8只广西小麻鸭和8只云南麻鸭的抗凝血液分别经常规裂解和消化处理后，应用传统的苯酚/氯仿法提取总DNA，并将总DNA浓度稀释至50ng/μL作为模板DNA；
步骤二、采用含有PCR引物PF(SEQ ID NO.1)和PR(SEQ ID NO.2)的试剂盒对步骤一中所述模板DNA中的CHD1基因进行PCR扩增，PCR扩增反应体系(25μL体系)为：模板DNA 45ng～55ng，2×PCR扩增缓冲液12.5μL，5μmol/L上游引物2μL，5μmol/L下游引物2μL，加水至25μL；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，然后经94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min；
步骤三、取5μL步骤二中所得PCR扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，当电泳结果出现两条条带时命名为ZW型，属雌性鸭；当电泳结果仅出现一条条带时命名为ZZ型，属雄性鸭；鉴定结果与个体性别记录的结果一致，见表2。
表2四种不同品种鸭检测结果
  品种   ZZ型   ZW型
  山麻鸭   3只   5只
  兴义鸭   2只   6只
  广西小麻鸭   4只   4只
  云南麻鸭   0只   8只
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Figure IDA0000154683920000021

Claims (7)

1.一种鸭性别鉴定用PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物PF：5′-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3′；
下游引物PR：5′-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3′。
2.一种利用如权利要求1所述鸭性别鉴定用PCR引物鉴定鸭性别的方法，其特征在于，该方法为：以待测鸭的总DNA为模板，采用鸭性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物只出现495bp的特异性扩增条带时判定为雄性鸭，当扩增产物出现495bp的特异性扩增条和351bp的特异性扩增条时判定为雌性鸭。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系由以下成分组成：模板DNA 45ng～55ng，2×PCR扩增缓冲液12.5μL，5μmol/L上游引物2μL，5μmol/L下游引物2μL，加水至25μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，然后经94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述495bp的特异性扩增条带的核苷酸序列为：
AGTGCATTGC AGAAACAATA TTACAAGTAA CTATTTTCTT TAAATTTCAT CGTTTTAATT    60
ATATGTCTGC ATACAAATTA CTGGTTTAAT ATTTTTCATA ATGCAGTCTG AATTTGGGGC    120
AAAATAGTAA AAATCAAGCA CCTTTTTAGG ATTTCATAAC AGTAAAGTTC TGTGAAGCAG    180
AGGTTTATTG GTCTAATCTG TCTATTTTGC TTCTGTTGTT TGGCGTATTT GTATATTTTC    240
ACTAGGACTT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA GTTTGTTTAT ATTTTGAGAG CTTGTCTTGC    300
CTCCACATAT GGTTATTTAC ACCATGTCTT ATGTCATAGG TGGATTTTAA CAAGGAATTA    360
TAAAGCCCTC AGTAAAGGTT CAAAAGGCAG TACCTCTGGC TTTCTGAACA TTATGATGGA    420
ACTCAAAAAG TGTTGTAACC ATTGCTACCT CATTAAACCA CCAGATGATA ATGAATTCTA    480
TAATAAACAG GAGGC                                                495
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述351bp的特异性扩增条带的核苷酸序列为：
AGTGCATTGC AGAAGCAATA TTACAAGTAA GTAATGACAC TTTTAAAATC GCACTATTTT    60
AATTAGATGT CTGTATGAAA AGTAATGAAG TGTAATAGTT TTCATGATGC AATTTGAAAT    120
GATATTTTGA GAGCTTACCA TTTGTGGAAA TATGACATGT TAGAAATTAC TTCCACTACA    180
CGTTTTATAT CATAGGTGGA TTTTAACCAG GAATTATAAA GCCCTGAGTA AAGGTTCAAA    240
AGGCAGTACC TCAGGCTTTT TGAACATCAT GATGGAACTC AAGAAGTGTT GTAACCATTG    300
CTACCTCATT AAACCACCAG ATGATAATGA ATTCTATAAT AAACAGGAGG C             351
7.一种鸭性别鉴定用试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述鸭性别鉴定用PCR引物。
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Granted publication date: 20140917

Termination date: 20200418

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