CN103866009B - 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改进的茎环引物qRT‑PCR检测miRNA的方法，包括：（1）miRNA检测引物的设计：茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；（2）将靶标miRNA反转录成cDNA；（3）定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。本发明的方法特异性好、灵敏性高，且只需合成一种下游引物，采用SYBR Green I荧光染料法，大大节约了成本。

Description

一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于miRNA的检测方法领域，特别涉及一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNAs（miRNAs）是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，主要通过信使RNA的直接剪切或间接抑制翻译在转录后水平调控靶基因的表达。MicroRNAs在个体发育的不同时期如细胞分化、增殖、凋亡等及不同组织中有不同的表达模式，表明其在发育和分化中起着重要的调控作用。

传统的miRNA检测技术如northern hybridization，microarray，对低丰度的miRNA的扩增敏感性差。qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)法是检测基因表达量最灵敏、可靠的方法，但常规的qRT-PCR技术难以检测约22bp的miRNAs，为克服这个问题，开发了茎环引物逆转录法、poly-A加尾法等。通过延长逆转录产物的长度，便于qPCR引物设计，以利于PCR产物扩增。

Chen等开发的Taqman探针qRT-PCR检测法，采用基因特异的茎环引物，增强了RNA-DNA杂化双链的热稳定性，及茎环引物所产生的空间约束，使逆转录具有较高的灵敏性和特异性。但此方法成本较高，且Taqman探针只结合到逆转录产物的部分cDNA序列无法完全保证其特异性，亦无法通过融解曲线分析PCR反应的特异性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，该方法特异性好、灵敏性高，且只需合成一种下游引物，采用SYBR Green I荧光染料法，大大节约了技术成本。

本发明的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括：

（1）miRNA检测引物的设计：

茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；

qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；

（2）采用步骤（1）设计的miRNA检测引物将靶标miRNA反转录成cDNA；

（3）定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。

步骤（1）中所述的靶标miRNA为miR-505-3P-RT¹、miR-505-3P-RT²或miR-16-RT。

所述的miR-505-3P-RT¹对应的miRNA检测引物为：

PCR-F¹:GCGAGCACCGTCAACACTTG;PCR-R¹:TGGTGTCGTGGAGTCGGC.

所述的miR-505-3P-RT²对应的miRNA检测引物为：

PCR-F²:GCGAGCACCGTCAACACT,PCR-R²:TGGTGTCGTGGAGTCGGC.

所述的miR-16-RT对应的miRNA检测引物为：

PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT.

步骤（3）中所述的PCR扩增中PCR反应终体系20μL包括：10μL2×SYBR Green PCRmaster mix，0.4μL ROX，2.5μL cDNA模板，3μL PCR上下游引物2μM,4.1μL水，同时设阴性对照；PCR循环条件为95℃预变性2min，95℃变性15s，62℃延伸32s，共40个循环。

本发明基于茎环引物逆转录和SYBR Green qPCR检测法，将Taqman探针改为SYBRGreen荧光染料（百泰克），并通过优化逆转录茎环引物的长度，建立改进的茎环引物RT-PCR实时定量检测方法。

本发明的茎环引物在靶标miRNA存在的条件下，能够高特异和高灵敏的结合到靶标miRNA上，得到延长的逆转录产物。qPCR中所使用的荧光染料SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号实时检测出PCR体系存在的双链DNA数量。设计原理如图1所示。

为实现上述目的，本发明所提供的茎环引物如下：

茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列；

本发明中对Stem-loop引物进行优化，其中通用的茎环序列保持不变，将其互补配对的特异引物序列延长4bp。

qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，为提高上游引物的退火温度，在其5’末端的增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近。

有益效果：

（1）本发明的检测miRNA的方法中，设计的PCR下游引物是针对茎环逆转录引物通用的茎环序列的，其可以通用，故只需合成一种下游引物，且采用SYBR Green I荧光染料法，大大节约了技术成本。

（2）本发明引物具有良好的特异性，qPCR的融解曲线只有单一的峰。并且能够很好的区分靶标miRNA和其前体，相同浓度下成熟miRNA和其前体可相差8个Ct值。

（3）本发明引物具有良好的灵敏性，检测范围可以跨越7个浓度梯度，对低通量的miRNA具有较高的准确度和精确度。

（4）本发明中miRNA的检测方法可用于快速高效的检测小鼠组织样本中靶标miRNA的表达量差异，且可较好的适用于不同组织。

附图说明

图1本发明的stem-loop qRT-PCR原理示意图；

图2实施例1中引物序列；

图3优化引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；

图4优化引物的PCR产物融解曲线；

图5优化引物可以区分成熟miR-505-3P和它的前体；

图6合成的miR-505-3P的扩增曲线；

图7优化后引物与优化前引物的标准曲线；

图8从不同组织中提取RNA样本，利用本发明设计的引物检测miR-505-3P的相对表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1、miRNA检测引物的设计

（1）茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列；优化的茎环引物，将与靶标miRNA互补配对的碱基数从7bp增加到11bp。

（2）qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端，5’末端的加了8bp的尾巴，引物设计如图2所示。

2、验证引物的特异性和灵敏性

（1）反转录

采用SuperScript II Reverse Transcriptase试剂盒（Fermentas）进行反转录，反应终体系10μL包括：6.25μL DNase I处理的总RNA,0.5μL茎环引物（2μM），0.5μL dNTPMix(10mM)。首先反应在16℃进行15min后，加入剩余体系（2μL5×RT buffer，0.5μLRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase（200U/μL）,0.25μL RNase inhibitor（20U/μL）），反应程序为：35℃60min,80℃15min。

（2）实时定量PCR扩增

PCR反应终体系20μL包括：10μL2×SYBR Green PCR master mix，0.4μL ROX，2.5μL cDNA模板，3μL PCR上下游引物（2μM）,4.1μL水，同时设阴性对照。PCR循环条件为95℃预变性2min，95℃变性15s，62℃延伸32s，共40个循环。电泳结果显示，优化后的引物只有单一的条带，且阴性对照无引物二聚体条带，如图3所示。样本融解曲线也只有在Tm值80℃左右有单一的峰，如图4所示。

合成的成熟miRNA和前体模板稀释到相同的浓度1.08×108/RT反应下，如图5所示，只有miRNA前体存在时，所得到的Ct值比成熟的miRNA至少高8.3个Ct值，说明如果检测的成熟miRNA和前体是在同一浓度下，其前体对成熟miRNA的检测结果只有0.31%的影响。用总RNA代替合成的miRNA模板，结果显示，前体的Ct值比成熟的miRNA高至少10个Ct值，表明在组织样本中miRNA的前体是低丰度的。

将合成的miR-505-3P RNA模板10倍稀释7个浓度梯度，如图6、7，结果显示，和原来的逆转录引物相比，优化引物的CT值和RNA模板呈现了更好的线性，表明优化的引物具有更高的效率和更灵敏的检测范围。

3、利用优化引物对不同组织中的miRNA进行检测

以2个品系（转基因和C57BL/6）小鼠的丘脑、垂体、卵巢、肌肉和脂肪组织为样本。分别取5、15、25、35日龄颈椎脱臼处死，迅速取出下丘脑、垂体、卵巢、肌肉、脂肪样本。具体依据TRIzol提取试剂盒说明书提取总RNA。具体流程如下：

a.匀浆处理：将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

c.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

d.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

e.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

f.2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

g.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

h.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟。加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。

结果显示，我们的方法可以检测到120个不同组织中的microRNA样本，且发现在转基因和C57BL/6小鼠的不同时间点下，相较于其他组织，在肌肉和脂肪组织中差异显著，这与本实验室在表型上观测到的数据是一致的，如图7所示。

Claims (2)

1.一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括：

(1)miRNA检测引物的设计：

茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA 3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；

qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；

其中，靶标miRNA为miR-505-3P-RT¹、miR-505-3P-RT²或miR-16-RT；

所述的miR-505-3P-RT¹对应的miRNA检测引物为：

PCR-F¹:GCGAGCACCGTCAACACTTG；PCR-R¹:TGGTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-505-3P-RT¹的序列为：

GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCAGAAAAAC；

所述的miR-505-3P-RT²对应的miRNA检测引物为：

PCR-F²:GCGAGCACCGTCAACACT,PCR-R²:TGGTGTCGTGGAGTCGGC；

miR-505-3P-RT²的序列为：

GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGCAGAAAACCAGC；

所述的miR-16-RT对应的miRNA检测引物为：

PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT；PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT；

miR-16-RT的序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA；

(2)采用步骤(1)设计的miRNA检测引物将靶标miRNA反转录成cDNA；

(3)定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR扩增中PCR反应终体系20μL包括：10μL 2×SYBR Green PCR mastermix，0.4μL ROX，2.5μL cDNA模板，3μL PCR上下游引物2μM,4.1μL水，同时设阴性对照；PCR循环条件为95℃预变性2min，95℃变性15s，62℃延伸32s，共40个循环。