CN103740851B - 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒及其检测方法,涉及MicroRNA。试剂盒设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。提取样本中miRNA,若为血清/血浆或其他体液样本,则在样本充分裂解后加入试剂盒提供的浓度为5n?mol的外源性参照cel-miR-395μL,漩涡震荡;若为细胞或组织样本,则无需加入外源性参照cel-miR-39;采用试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA;采用试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增;综合分析仪器给出的各项数据,设定合理的阈值和基线,进行结果分析。
Description
技术领域
本发明涉及MicroRNA,尤其是涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子,参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用,具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA,后转运出细胞核,通过剪切形成成熟miRNA,通过与Ago蛋白等形成RISC(RNA诱导的沉默复合体),部分抑制或降解靶mRNA序列,参与基因表达调控(BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281-297)。
由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色,精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义。目前,检测miRNA的方法主要有northernblot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中,northernblot技术是RNA检测的早期手段之一,但其特异性和敏感性低,如果样本RNA含量低或存在降解,可能检测不到;原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况,同时对miRNA进行半定量检测,其不足地方在于不能准确检测到低表达的miRNA;微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术,能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA,但存在芯片制作费时,费力和标记成本高,检测灵敏度和特异性低等问题。
实时荧光定量技术(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一,具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前,用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括miRNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分,其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种:同聚物加尾法和茎环逆转录法;荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法,其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针(一种适合于扩增短片段的荧光探针),由于成熟的miRNA具有片段短小的特点,要特异的检测,探针法更有优势,在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别,扩增成熟的miRNA序列,而miRNA的前体并未被扩增,Taqman-MGB探针检测miRNA缺点在于合成价格贵,不利于推广。
目前,AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.RapiddetectionofthehepatitisBvirusYMDDmutantusingAllGloTMprobes[J].ClinChimActa,2011,412(11-12):1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.TheestablishmentandevaluationofdiagnosticaccuracyofAllGlo(TM)probe-basedtechniquesforinvasiveaspergillosis[J].ZhonghuaNeiKeZaZhi,2010,49(2):142-145)、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
目前大量研究表明,hsa-miR-191-5p与癌症的发生有关。NagpalN等研究发现hsa-miR-191可直接受雌激素受体的调控,从而促进乳腺癌细胞的增殖,侵袭,耐药和存活。(NagpalN,AhmadHM,MolpariaB,KulshreshthaR.MicroRNA-191,anestrogen-responsivemicroRNA,functionsasanoncogenicregulatorinhumanbreastcancer.Carcinogenesis2013,34:1889-1899)QinS等研究显示hsa-miR-191-5p在结肠癌中表达上调,并且与结肠癌的临床分期,淋巴结转移,肝转移和肿瘤侵袭有关。(QinS,ZhuY,AiF,LiY,BaiB,YaoW,etal.MicroRNA-191correlateswithpoorprognosisofcolorectalcarcinomaandplaysmultiplerolesbytargetingtissueinhibitorofmetalloprotease3.Neoplasma2013)目前hsa-miR-191-5p与癌症的关系越来越得到重视。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有检测miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷,提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒。
本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p的检测方法。
所述hsa-miR-191-5p为一种人源性miRNA,其核苷酸序列为:SEQIDNO.15'-CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG-3'。
所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶;隔板设在盒体内,外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上,外源性参照瓶内装有外源性参照,茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂,实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
所述外源性参照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为:SEQIDNO.25'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3';其工作浓度可为5nmol。
所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT缓冲液(所述5×RT缓冲液由250mmolTris-HCl、375mmolKCl、15mmolMgCl2、50mmolDTT组成)、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA,浓度为100nmol)。
所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-191-5p的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成:
所述hsa-miR-191-5p的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.35'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAGCTGCT-3';
所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.45'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3';
所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.55'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500mmolKCl)、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
所述特异正向引物由hsa-miR-191-5p的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成:
所述hsa-miR-191-5p的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.65'-TACCAACGGAATCCCAAA-3';
所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.75'-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3';
所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.85'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。
所述通用反向引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.95'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。
所述AllGlo探针由hsa-miR-191-5p的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel-miR-39的特异探针组成;
所述hsa-miR-191-5p的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.10MAR-TTGCACTGGATACGACCAGCTGCT-MAR;
所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP;
所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p的检测方法,其步骤如下:
1)采用常规方法提取样本中miRNA,若为血清/血浆或其他体液样本,则在样本充分裂解后加入所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒提供的浓度为5nmol的外源性参照cel-miR-395μL,立即进行漩涡震荡15s;若为细胞或组织样本,则无需加入外源性参照cel-miR-39;
2)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA;
3)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增;
4)综合分析仪器给出的各项数据,设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline),进行结果分析。
所述AllGlo探针可采用美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司的荧光定量探针,它拥有普通Taqman,Taqman-MGB及分子信标(molecularbeacon)探针所有优点,克服了目前这几种探针的最大弊端,它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限制,利用了美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料,标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团,而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火温度)的化学基团,提高探针特异性,杂交特异性大大提高,在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团,提高荧光增量。
所述AllGlo探针具有以下优势:①提高Tm值(可达10℃以上),探针更短可以达到15~16个碱基,可以适用A,T含量比较高的序列设计探针;②加大了多重荧光定量的选择,因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团,打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难,不受淬灭基团波长限制;③大大提高信噪比,无背景信号,空间距离近,更好的淬灭效果;④成本较低,价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半,具有MGB探针所有优势。
本发明采用了AllGlo探针技术,建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法,与taqman-MGB探针法相比,线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR灵敏度最低可达10拷贝/μL,最高可达107拷贝/μL。
本发明采用了AllGlo探针技术,设计了特异性引物和相应的AllGlo探针,探针分别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP),并对该技术反应条件进行优化,建立了一种AllGlo探针荧光定量PCR技术检测hsa-miR-191-5p的方法,应用前景广阔。
本发明的有益效果如下:
本发明提供了一种基于AllGlo探针RT-qPCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒和检测方法,其特异性和敏感性高,可快速准确检测样本中miRNA的含量,与现有技术相比具有以下优势:
1.与northernblot,miRNA芯片相比,AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高,价格比miRNA芯片要便宜;
2.与taqman-MGB探针相比,AllGlo探针采用相同的荧光基团,互为报告基团和淬灭基团,一方面释放的荧光信号更强,另一方面本底信号更低;而且合成程序简单,价格仅相当于Taqman-MGB的一半。
3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料检测miRNA方法,基于AllGlo探针检测miRNA的反应时间大大缩短,而且敏感性与特异性要明显高于基于SYBGreen检测miRNA的方法;
4.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测hsa-miR-191-5p的方法,适合于作为筛选miRNA的临床样本验证,为进一步研究miRNA在相关疾病中扮演的作用起到推动作用。
附图说明
图1为本发明基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒实施例的结构组成示意图。
具体实施方式
实施例1
参见图1,本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒实施例,设有盒体1、隔板2、外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5;隔板2设在盒体1内,外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5插在隔板2上,外源性参照瓶3内装有外源性参照,茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆转录试剂,实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。
①所述外源性参照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其工作浓度可为5nmol,其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率;
②茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT缓冲液(5×RT缓冲液由250mmolTris-HCl,375mmolKCl,15mmolMgCl2,50mmolDTT组成)、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA,浓度为100nmol);
③实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500mmolKCl)、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
实施例2
血清或血浆hsa-miR-191-5p的检测,包括以下步骤:
1.收集血浆或血清:
抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管或无抗凝剂管中,立即将上述试管颠倒混匀6~8次,然后将上述试管置于离心机3000r离心10min,结束后取出置于试管架上,小心吸取上清置于新的1.5mL的无RNA酶的离心管中,将装有上清的1.5mL的离心管置于离心机中13000r离心10min,结束后将上层血浆或血清转移至新的1.5mL无RNA酶的离心管中(此步骤注意不要吸取到下层的细胞沉淀。),每管分装400~500μL,取200μL用于下一步提取,其余血浆或血清于-80℃冻存。
2.提取microRNA
采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501),按照操作说明书进行样本(血浆或血清)miRNA提取,其中200μL血浆或血清在加入同等体积的裂解液剧烈震荡30s后静置5min,然后加入外源性参照cel-mir-39(其工作浓度为5nmol)5μL,后按照说明书操作进行,最后用30μL的去核酶水溶解miRNA,于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度,取纯度A260/A280比值在1.6~2.2之间,取浓度2~20ng/μL的已提取的miRNA用于下游的逆转录,其余的miRNA均于-80℃冻存。
3.miRNA的逆转录:
3.1将逆转录所需成分于室温下溶解,震荡混匀后置于冰上;请按照表1配制逆转录反应液。
表1
组分 | 加入体积(μL) |
MMLV逆转录酶(200单位/μL)(promega公司) | 0.4 |
MMLV5倍逆转录酶缓冲液(promega公司) | 8 |
脱氧核苷混合液(10mL) | 1.6 |
RNA酶抑制剂(40单位/μL) | 0.4 |
特异性茎环逆转录引物(1μL) | 各1.2,共2.4 |
无核酶水 | 25.2 |
总体积 | 38 |
注:表1中特异性逆转录引物各1.2μL分别是指目的hsa-miR-191-5p的特异逆转录引物和外源性参照cel-miR-39的特异引物。
3.2将配好的38μL混合液分装于无RNA酶的PCR管中,后加入2μL已提取富集的miRNA溶液,用无RNA酶枪头充分混匀(此操作尽量避免气泡的产生),短暂离心甩至管底后置于普通PCR仪(Biorad公司生产)上,逆转录反应条件如表2。
表2
步骤 | 条件 |
1 | 25℃5min |
2 | 42℃60min |
3 | 70℃15min |
反应结束后置于4℃或冰上。
4.实时荧光定量PCR检测hsa-miR-191-5p
4.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解,混匀后置于冰上。
4.2配制PCR反应混合液如表3。
表3
组分 | 每管体积(μL) |
dNTP混合液(10m mol) | 2 |
MgCl2(25m mol) | 2 |
10×Taq缓冲液(无Mg2+) | 2 |
Taq(5单位/μL)(takara公司) | 0.2 |
正向引物(10μmol) | 0.4 |
反向引物(10μmol) | 0.4 |
探针(10μmol) | 0.2 |
去核酶水 | 10.8 |
总体积 | 18 |
4.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液,每管加入2μL的cDNA,充分混匀,整个过程在冰上进行,避免气泡的产生。
4.4荧光定量PCR反应反应条件如表4。
表4
检测在实时荧光定量PCR仪器上进行,可使用ABI7300,7500(美国AppliedBiosystems公司)等多种仪器。
5.数据分析与标准化处理:应用ABI仪器自带软件以及Excel进行数据分析,用上述方法可测的样本(血清或血浆)中hsa-miR-191-5p和外源性对照cel-mir-39的CT值,根据参照的CT值水平求得hsa-miR-191-5p在血清或血浆中的相对含量,以qPCR中相对定量的2-ΔCt方式表示血清或血浆中目的hsa-miR-191-5p的水平(ΔCt为hsa-miR-191-5p与外源参照的Ct值之差)。
实施例3.组织或细胞miRNA检测
1.样品处理:
a.组织:将组织在液氮中磨碎。每30~50mg动物组织或者100mg植物组织加1mL裂解液MZ(天根生物科技有限公司生产),用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的10%。
b.单层培养细胞:直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞,每10cm2面积加1mLMZ。用取样器抽打几次。
c.细胞悬液:离心800r5min取细胞,弃上清。加入1mL裂解液MZ,振荡器振荡或移液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涤细胞,以免降解RNA。
2.组织,细胞miRNA提取和富集
采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501),按照操作说明书进行组织或细胞miRNA提取,最后用50μL的去核酶水溶解RNA,于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度,
3.组织,细胞miRNA的逆转录及实施荧光定量检测。
后续步骤参照实施例2的步骤2~4,但作以下更改:
①在实施例2步骤2中逆转录反应液的混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物要换成U6的特异引物,引物的浓度及体积不变;
②后续实时荧光定量的PCR混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物和探针要换成U6的特异引物和探针。
可应用范围:
基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒及其检测方法可应用于人类组织、血细胞及体液中细胞hsa-miR-191-5p表达水平的检测,以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。
Claims (4)
1.基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,其特征在于所述hsa-miR-191-5p为一种人源性miRNA,其核苷酸序列为:SEQIDNO.15'-CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG-3';
所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶;隔板设在盒体内,外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上,外源性参照瓶内装有外源性参照,茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂,实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂;
所述外源性参照采用cel-miR-39,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为:SEQIDNO.25'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3';其工作浓度为5nmol/L;
所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品,浓度为100nmol/L;所述5×RT缓冲液由250mmolTris-HCl、375mmolKCl、15mmolMgCl2、50mmolDTT组成;
所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10×Taq缓冲液、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针;所述10×Taq缓冲液包括100mmolTris-HCl,500mmolKCl;
所述AllGlo探针由hsa-miR-191-5p的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel-miR-39的特异探针组成;
所述hsa-miR-191-5p的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.10MAR-TTGCACTGGATACGACCAGCTGCT-MAR;
所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP;
所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为:
SEQIDNO.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
2.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,其特征在于所述特异的miRNA的逆转录引物由hsa-miR-191-5p的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成;
所述hsa-miR-191-5p的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.35'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAGCTGCT-3';
所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.45'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3';
所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQIDNO.55'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
3.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,其特征在于所述特异正向引物由hsa-miR-191-5p的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成;
所述hsa-miR-191-5p的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.65'-TACCAACGGAATCCCAAA-3';
所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.75'-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3';
所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.85'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。
4.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-191-5p检测试剂盒,其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列为:
SEQIDNO.95'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。
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