CN108624702A - 一种简便快速鉴别鸟类性别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别鸟类性别的特异性核苷酸为：SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸。其鉴别方法：首先，从鸟类羽毛羽根中分别提取DNA，加入组织缓冲液与蛋白酶k处理后，无需纯化，吸取上清液直接作为PCR模板DNA，而后利用该特异性核苷酸引物进行PCR扩增，PCR产物加入不含SDS的Loading Buffer后，经1.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后，DNA图谱为单一条带，可以判定该个体性别为雄性；电泳后，DNA图谱为两条带，可以判定该个体性别为雌性；本发明的方法摒弃了翻肛鉴别、腹腔镜检等损伤性方法，采用了拔取羽毛作为样本的非损伤性方法具有简便快捷，省时省力，成本更低，实用性更强的特点。

Description

一种简便快速鉴别鸟类性别的方法

技术领域

本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法领域，特别是涉及一种无创伤式经济快捷且操作简单的鸟类性别鉴定的检验方法。

背景技术

在全世界现有鸟类中有超过50%的品种为单态性鸟类，即指无论处于幼鸟或处于成鸟时期，均无法通过外观及其它行为判断其性别。目前，常用于鉴定鸟类性别的方法主要包括翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇鉴定、核型分析法等，但以上方法存在应激性伤害性强、准确性不高、操作复杂困难等缺点。因此，建立一种准确简便且为非损伤性取样的方法十分重要，目前利用分子生物学技术手段，通过聚合酶链式反应(PCＲ)扩增法使得鸟类性别鉴定取得突破性进展，其中较多被鉴定的序列包括Ellegren等（1996）提出的CHD1基因、Friddfssen等（1998）提出的ATP5A1基因及Itch等（2001）提出的EE0. 6序列等。CHD1基因应用最为普遍，该基因位于性染色体，Griffiths等（1998）提出雌鸟拥有两个同源拷贝CHDZ和CHDW, 而雄鸟只拥有前者，由于二者具有一定同源性，因此引物设计尤为重要。据报道，已有研究对一些珍惜禽类如火烈鸟、朱鹮、丹顶鹤等，通过分子生物学进行了性别鉴定，并取得显著进展。然而，现有的研究涉及繁育保育越来越多的鹦鹉、鸽子以及鹩哥的内容较少，鹦鹉、鸽子以及鹩哥均属于单形态鸟类，无法通过外观分辨其性别，其中鹦鹉作为鸟纲最大科之一的种类更是繁多，包括2科、82属、358种，并全部列入《世界自然保护联盟》（IUCN）2012年濒危物种红色名录ver 3.1中。此外，通过现有的引物对鹦鹉和鸽子进行了性别鉴定，发现现有的引物与鹦鹉、鸽子以及鹩哥的基因组吻合度较低，无法扩增出两者的CHD1基因，PCR效果较差，并且即便扩增出产物，却出现已知性别的雌性和雄性均只出现雄性一条带，而不出现特异性的雌性条带，甚至出现大量非特异性杂带，研究结果表明利用现有的引物及方法无法对鹦鹉、鸽子以及鹩哥进行准确的性别鉴定。因此快速准确地进行性别鉴定对鹦鹉、鸽子以及鹩哥的育种、保护及生产都具有十分重大的意义和经济价值，还可为今后人工饲养繁殖濒危鸟类以及国际交流濒危鸟类提供可靠的技术资料，对鸟类生态学、细胞遗传学、进化生物学和分类学等研究都有重要的意义。此外，现在应用的通过非损伤性取样方法主要为拔取带有羽根的羽毛，而从羽毛组织中提取DNA的方法主要为用苯酚氯仿萃取法，该方法为耗时长的DNA纯化法，样本需研磨、破碎等特殊处理，且苯酚、氯仿均为有毒化学试剂，对环境具有一定的污染，因此对从羽毛组织中提取DNA的过程进行优化是十分有意义的。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种应用范围广泛，灵敏度高，稳定性强，准确有效，方便快捷的鸟类性别鉴定方法。在对从外观上无法辨别性别的鸟类进行性别鉴定的研究中，提高对目的鸟类应用的广泛性，减少对动物模型的损伤，减少人力，减少污染，减少成本，操作流程简便快捷，提高实验的准确率、成功率并使实验结果更具科学性和可靠性。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是:

通过对比基因组法对NCBI数据库中公布的多种鸟类的CHD1 序列进行比对，确定在所有鸟类中较为保守的区域，设计一对原创性引物，引物名称为TDM1012F（核苷酸序列如SEQID NO:1 所示，5’-CGTGGCAACAGAGTACTGATT-3’和

TDM1020R（核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示）5’-CCATACCTCTGATCCTTCTGC-3’。

该引物序列与其他已报道的鉴定鸟类性别的引物序列完全不同，可用于几乎所有鸟类性别的分子鉴定。首先，从鸟类羽毛羽根中分别提取DNA，加入组织缓冲液与蛋白酶k处理后，无需纯化，吸取上清液直接作为PCR模板DNA，而后利用该引物进行PCR扩增，PCR产物加入不含SDS的Loading Buffer后，经1.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后，DNA图谱为单一条带，可以判定该个体性别为雄性；电泳后，DNA图谱为两条带，可以判定该个体性别为雌性。 作为一种优选方案，上述鉴别方法中，所述PCR扩增的反应体系为 ：25μL体系

模板DNA1μL

10×PCR缓冲液2.5μL

dNTPs 0.5μL

Mgcl2+（25mM）1.5μL

10μM上游引物1μL

10μM下游引物1μL

Taq DNA聚合酶0.2μL

ddH2O 18.3μL。

作为一种优选方案，上述鉴定方法中，所述鸟类为鹦鹉、鸽子以及鹩哥。

本发明进一步公开了快速鉴别鸟类性别的特异性核苷酸在用于鉴别鹦鹉、鸽子或鹩哥性别方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 ：

（1）本发明的方法具有简便快捷，成本低，实用性强，成功率高，重复性好的特点，在保守区域设计的引物就不同鸟类性别鉴定而言应用的广泛性强，PCR扩增效果好，灵敏度高，稳定性好，电泳检测结果显示雌雄条带对比清晰，特异性强，用于鉴别鸟类性别十分准确，尤其可用于鉴别无法通过外观分辨出性别的鸟类。

（2）本发明的方法在鉴别鸟类性别的方法上摒弃了翻肛鉴别、腹腔镜检等损伤性方法，采用了拔取羽毛作为样本的非损伤性方法。

（3）本发明的方法在鉴别鸟类性别提取羽毛样本DNA过程中，摒弃了传统有毒害副作用的苯酚氯仿萃取法以及耗时耗力的DNA纯化法，采用了简便快捷，省时省力，成本更低，实用性更强的方法。

附图说明

图1是鹦鹉 PCR 产物电泳后的图谱，1、3、5、7 为658 bp 单一条带，判定个体性别为雄性 ；2、4、6、8为双带，即含一条461 bp 的带和一条445 bp 的带，判定个体性别为雌性；其中和尚鹦鹉及紫蓝金刚鹦鹉的条带均具有特异性，雄性和尚鹦鹉（9）为一条带，长度716bp，雌性和尚鹦鹉（10）则是长度为716bp和449bp的两条带；雄性紫蓝金刚鹦鹉（11）为一条带，长度577 bp，雌性紫蓝金刚鹦鹉（12）则是长度为577bp和318bp的两条带 ；

图2是鸽子 PCR 产物电泳后的图谱，1、3、4、5 为566 bp 单一条带，判定个体性别为雄性 ；2、6 为双带，即含一条566 bp 的带和一条303 bp 的带，判定个体性别为雌性；

图3是鹩哥 PCR 产物电泳后的图谱， 1、3 为643bp 单一条带，判定个体性别为雄性 ；2、4为双带，即含一条643 bp 的带和一条445 bp 的带，判定个体性别为雌性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用的蛋白酶K、loading buffer 等试剂均有市售。

实施例1：

1.准备羽毛样本及DNA提取

（1）拔取已知性别的鹦鹉、鸽子以及鹩哥翅膀内侧或尾部下方带有羽根的羽毛3-5根，放入高压消毒过的离心管内待用；

（2）组织缓冲液37℃预热5-10min；取1.5mL无菌离心管，加入100μL组织缓冲液， 10μL蛋白酶k，轻微涡旋混匀。

（3）用消毒过的剪刀和镊子取1-2根长约1-2 mm的羽根，移至上述离心管中；

（4）65℃恒温，900rpm混匀震荡30-40min，然后95℃恒温，900rpm混匀震荡5min。

（5）12000rpm（~13400×g）离心6min。

（6）吸取上清液转移至新的无菌离心管中，裂解混合液于4℃或-20℃放置备用或直接用于PCR扩增。

2. 引物设计

通过对比基因组法对NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中公布的多种鸟类的CHD1序列进行比对，确定在鸟类中较保守的区域，利用Oligo 7.60 Demo软件设计一对原创性引物：TDM1020F（核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示）和TDM1020R（核苷酸序列如SEQID NO:2 所示）。该引物序列与现有报道的鸟类性别鉴定的引物序列完全不同，可用于几乎所有鸟类性别鉴定。

3. PCR 扩增

取0.2ml无菌PCR管。25μL的反应体系中加入模板1μL、10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs 0.5μL、Mgcl2+（25mM）1.5μL、10μM的上下游引物各1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL及灭菌蒸馏水18.3μL。配置好PCR反应体系，至于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。PCR反应条件为：94℃ 5min，（94℃ 10s，56℃ 20s，72℃ 30s）35个循环，72℃ 10min，反应产物于4℃保存。

4. 性别判定 将PCR扩增产物采用1.8%琼脂糖凝胶电泳，鹦鹉性别鉴定检测结果如图1所示，凝胶成像系统中雄性鹦鹉的PCR产物电泳结果呈现单一条带，长度为658 bp（如图1-1；1-3；1-5；1-7所示），而雌性鹦鹉呈现两条带，其中包含一条与雄性鹦鹉相同的的长度为658bp 的条带，以及一条长度为461 bp的条带（如图1-2；1-4；1-6；1-8所示）。然而，图1中，1-9和1-10为和尚鹦鹉，1-11和1-12为紫蓝金刚鹦鹉，两者呈现出的条带位置与其他品种的鹦鹉不同，其中雄性和尚鹦鹉呈现单一条带，长度为716 bp，雌性和尚鹦鹉则呈现长度为716bp和449bp的两条带。雄性紫蓝金刚鹦鹉呈现单一长度为577 bp的条带，雌性紫蓝金刚鹦鹉则呈现长度为577bp和318bp的两条带。因此，本发明中设计的引物具有除PCR扩增效果好，电泳结果清晰外，还具有应用的广泛性强，特异性强，灵敏度高的特点。鸽子性别鉴定检测结果如图2所示，雄性鸽的PCR产物电泳结果呈现单一条带，长度为566 bp（如图2-1；2-3；2-4；2-5 所示），雌性则呈现出位置不同的两条带，长度分别为566 bp和303 bp（如图2-2；2-6所示）。鹩哥性别鉴定检测结果如图3所示，雄性鹩哥呈现单一条带，长度为643 bp（如图3-1；3-3 所示），雌性鹩哥则呈现出位置不同的两条带，长度分别为643 bp和445 bp（如图3-2；3-4 所示）。鹦鹉、鸽子及鹩哥的PCR产物电泳呈现结果与取样现场鉴定结果一致。5. 利用 DNAStar 软件对测序结果进行序列分析

选取鉴定成功的雄性雌性鹦鹉、鸽子及鹩哥样本的PCR产物各一份，送往北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，以验证鉴别结果的准确性。通过使用NCBI数据库NCBI BLAST软件对鹦鹉、鸽子及鹩哥样本的PCR产物的测序结果以及峰图进行比对，证实确为CHD1基因（CDH1基因：鸟类的性别决定系统为ZW型(其中雄性为ZZ,雌性为ZW),所以凡是W染色体上的特异序列或基因便成为人们寻找的主要目标，CDH1基因是已经报道过的明确存在于鸟类W染色体上的基因），即雌性鹦鹉、鸽子以及鹩哥所特有基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津海睿斯生物科技有限公司

<120> 一种简便快速鉴别鸟类性别的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtggcaaca gagtactgat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatacctct gatccttctg c 21

Claims (4)

1.一种快速鉴别鸟类性别的特异性核苷酸，其特征在于所述的核苷酸为：SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸。

2.采用权利要求1所述的特异性核苷酸快速鉴别鸟类性别的方法，其特征在于首先，从鸟类羽毛羽根中分别提取DNA，加入组织缓冲液与蛋白酶k处理后，无需纯化，吸取上清液直接作为PCR模板DNA，而后利用该特异性核苷酸引物进行PCR扩增，PCR产物加入不含SDS的Loading Buffer后，经1.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后，DNA图谱为单一条带，可以判定该个体性别为雄性；电泳后，DNA图谱为两条带，可以判定该个体性别为雌性；所述PCR扩增的反应体系为 ：25μL体系

模板DNA1μL

10×PCR缓冲液2.5μL

dNTPs 0.5μL

Mgcl2+（25mM）1.5μL

10μM上游引物1μL

10μM下游引物1μL

Taq DNA聚合酶0.2μL

ddH2O 18.3μL。

3.权利要求2所述的鉴别方法，其中所述的鸟类为鹦鹉、鸽子以及鹩哥。

4.权利要求1所述快速鉴别鸟类性别的特异性核苷酸在用于鉴别鹦鹉、鸽子或鹩哥性别方面的应用。