CN107043830A - 一种同时检测石斑鱼nnv和sgiv病毒的双重pcr引物及应用 - Google Patents

一种同时检测石斑鱼nnv和sgiv病毒的双重pcr引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用。该引物包括NNV‑CPF4：5’‑CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG‑3’，NNV‑CPR3：5’‑CACTAGGGAACCGGATGACCC‑3’；GIV‑CP287F：5’‑GGCTCGGCGCAAACGGTACC‑3’和GIV‑CP605R：5’‑GGCAACACTACGGTGGGCAGAG‑3’。本发明的引物不仅可以检测石斑鱼上的NNV和SGIV病毒，还可以检测石斑鱼GIV和其它鱼类中的NNV，以质粒为检测对象双重PCR最低能检出RGNNV和SGIV的量分别为20 pg和0.125 pg。

Description

一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用
技术领域
本申请属于水产病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用。
背景技术
石斑鱼属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)的一类鱼类总称，主要在我国广东、海南、广西、福建、浙江等沿海一带养殖，是我国南方渔民重要的经济来源之一。随着网箱高密度精养实验取得成功，石斑鱼养殖产业已渐成规模，但是石斑鱼的各种病害随着养殖规模的扩大呈迅速上升趋势。石斑鱼病害发生频繁，经常造成大面积鱼苗死亡，成鱼死亡率也很高，给养殖业带来巨大损失，严重制约我国南方石斑鱼产业的发展。由于病毒寄生在寄主的细胞内，所以病毒病是鱼类疾病中最难以治疗的一类疾病，至今尚无理想的治疗方法，主要是以预防为主。已有研究表明，在世界各地养殖石斑鱼中引起病毒病的主要是诺达病毒科的神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)和虹彩病毒科的虹彩病毒(Iridoviruses)这两种。
为了防止石斑鱼病毒病的发生和蔓延，确保石斑鱼育苗不带病毒是整个石斑鱼产业生产中的最为重要的一环。加强对鱼苗早期病毒的检测，就能够从源头上有效地控制病毒的扩散，确保石斑鱼养殖的安全，因此对石斑鱼鱼苗病毒的检测技术和方法就成为了病毒控制的关键点。赤点石斑鱼神经坏死病毒(Redspotted grouper nervous necrosisvirus,RGNNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是感染我国南方石斑鱼的两个最主要的病毒。赤点石斑鱼神经坏死病毒是罗达病毒科(Nodaviridae)β-罗达病毒属(Betanodavirus)的成员之一，而新加坡石斑鱼虹彩病毒则属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员。目前，受NNV感染的鱼类主要包括鳗鲡目、鳕形目、鲈形目、鲽形目和鲀形目等10目33科50余种。根据病毒衣壳蛋白序列可分为5种血清型，即赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosisvirus,RGNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfin flouder NNV，BFNNV)、黄带拟鰺神经坏死病毒(striped jack NNV，SJNNV)、大菱鲆神经坏死病毒(turbot NNV，TNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(tiger puffer NNV,TPNNV)。所有石斑鱼分离的NNV都属于RGNNV血清型。
根据前期对海南省石斑鱼养殖基地病毒病普查的基础上，发现RGNNV和SGIV经常复合侵染，给水产养殖业造成了严重的经济损失。已有许多文献报道用PCR或RT-PCR的方法来检测石斑鱼病毒病原，但是它们都是针对单个病毒来检测，未开展同时检测RGNNV和SGIV的技术或方法。由于目前缺乏有效的疫苗和治疗药物，因此快速、灵敏和同时检测2种病毒病原对预防这两种病毒感染尤其重要。其次，由于NNV病毒序列有一定的变异性，目前还未有报道利用NNV保守引物来检测多种NNV病毒。再次，与单个PCR相比，双重PCR设计的引物需要有更高的特异性，如引物之间不能有匹配或形成二聚体、退货温度不能差距过大、假阳性或非特异扩增、PCR产物的长度及在耙序列内位置选择等。因此，申请人通过对RGNNV和SGIV的序列设计引物，发明了一种简单、灵敏且能同时检测RGNNV和SGIV的双重PCR检测技术和方法，具有很高的实用价值和应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物，所述的引物包括：NNV-CPF4：5’-CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG-3’，NNV-CPR3：5’-CACTAGGGAACCGGATGACCC-3’，GIV-CP287F：5’-GGCTCGGCGCAAACGGTACC-3’和GIV-CP605R：5’-GGCAACACTACGGTGGGCAGAG-3’。
本发明的另一个目的在于提供一种双重PCR引物在制备同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒试剂盒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物，包括：NNV-CPF4：5’-CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG-3’，NNV-CPR3：5’-CACTAGGGAACCGGATGACCC-3’，GIV-CP287F：5’-GGCTCGGCGCAAACGGTACC-3’和GIV-CP605R：5’-GGCAACACTACGGTGGGCAGAG-3’。
一种双重PCR引物在制备同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒中的应用，包括利用上述引物制备检测NNV和/或SGIV试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的应用过程如下：
(1)提取待检石斑鱼样品头部的总DNA和总RNA；
(2)反转录提取的总RNA得cDNA；
(3)将提取的总DNA和cDNA混合，以此为模板，进行PCR扩增，体系如下：
25μL扩增体系：
模板1μL；
SinoBio 2×Master Mix，12.5μL(Mg2+终浓度为2mM)；
NNV-CPF4和NNV-CPR3，各1μL(5μM)；
GIV-CP287F和GIV-CP 605R，各1μL(1μM)；
ddH2O，加至25μL；
反应程序为：先94℃变性2min；然后94℃、30sec，56℃、30s，72℃、1min，共35个循环；最后72℃、10min；
结果判定：对上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若待检样品的仅扩增出一条带，且长度在886～892bp区间内，表明样品中含有NNV；若待检样品仅扩增出一条带，且长度为319bp，表明样品中含有SGIV；若待检样品出现两条特异的扩增条带，一条带的长度在886～892bp区间内，另一条带为319bp，则表明样品中含有NNV和SGIV病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次提供了可同时检测石斑鱼NNV和SGIV的双重PCR引物，该引物保守性高，灵敏度好，不仅可检测石斑鱼上的RGNNV和SGIV病毒，还可以检测石斑鱼的GIV和其它鱼类中的NNV病毒，如条斑星鲽神经坏死病毒(BFNNV)、黄带拟鰺神经坏死病毒(SJNNV)、大菱鲆神经坏死病毒(TNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(TPNNV)等。
利用质粒作为检测对象，双重PCR最低能检出RGNNV和SGIV的量分别为20pg和0.125pg。
总体而言，本发明所提供的引物对于规范化、标准化石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR检测具有十分重要的应用价值，同时也为该病毒的预防奠定了一定的前期检测基础和科学依据，因而具有较好地实用价值。
附图说明
图1为双重PCR法检测RGNNV和SGIV病毒样品的凝胶电泳图；
其中，M：2000bp DNA marker；1～10为，pMD18T-SGIVCP和pUC57-NNVRNA2质粒(v/v＝1:1)混合样以不同数稀释模板的双重PCR结果；CK-，阴性对照。
图2为提取石斑鱼总DNA后的电泳图；
其中，M：1000bp DNA ladder marker；1为，待检样品1J；2为，待检样品2J；3为，待检样品7k；4为，待检样品8k。
图3为提取石斑鱼总RNA后的电泳图；
其中，M：2000bp DNA marker；1为，待检样品1J；2为，待检样品2J；3为，待检样品7k；4为，待检样品8k。
图4为石斑鱼待检样品的双重PCR检测的凝胶电泳图；
其中，M：2000bp DNA marker；1为，待检样品1J；2为，待检样品2J；3为，待检样品1J&7k；4为，待检样品2J&8k；5为，待检样品7k；6为，待检样品8k；CK-，空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分物料情况简要介绍如下。
生物材料样品：
S1为通过测序确认同时感染了RGNNV和SGIV病毒的石斑鱼样品；待检的1J、2J、7k、8k共4个样品为疑似受到病毒感染的石斑鱼鱼苗，鱼苗大小为2.2～2.5cm，其采自海南省文昌地区的石斑鱼养殖基地。1J、2J生理病症表现为：石斑鱼鱼苗濒临死亡、游泳异常、身体变黑等临床病症；7k、8k生理病症表现为：鳃轻微出血等临床病症；
阴性对照样品(CK-)，即经PCR检测没有受到RGNNV和SGIV病毒感染的样品，鱼苗无症状，实验室-80℃保存备用；
上下游引物合成，由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；
pUC57-NNVRNA2质粒(400ng/uL)，是通过将RNA2全长片段(KM095959.1)插入pUC-57载体的XbaI和HindIII两个酶切位点之间制得。
pMD18T-SGIVCP质粒(250ng/uL)的制备，是通过TA连接将GIV-CP287F和GIV-CP605R引物扩增的PCR片段插入pMD18T载体中。
实验仪器及试剂：
凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；
无RNA酶去离子水，生工生物工程(上海)股份有限公司；
Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒，Takara生物技术有限公司；
2×Taq Master Mix试剂盒，近岸蛋白质科技有限公司；
总DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；
TRIzol reagent，上海英俊生物技术有限公司。
实施例1：
一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的试剂盒，包括：
NNV-CPF4：5’-CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG-3’，NNV-CPR3：5’-CACTAGGGAACCGGATGACCC-3’，GIV-CP287F：5’-GGCTCGGCGCAAACGGTACC-3’和GIV-CP605R：5’-GGCAACACTACGGTGGGCAGAG-3’。
以上所述试剂盒的使用方法，包括：
(1)提取待检石斑鱼样品头部的总DNA和总RNA；
(2)反转录提取的总RNA得cDNA；
(3)将提取的总DNA和cDNA混合，以此为模板，进行PCR扩增，体系如下：
25μL扩增体系：
模板1μL；
SinoBio 2×Master Mix，12.5μL(Mg2+终浓度为2mM)；
NNV-CPF4和NNV-CPR3，各1μL(5μM)；
GIV-CP287F和GIV-CP 605R，各1μL(1μM)；
ddH2O，加至25μL；
反应程序为：先94℃变性2min；然后94℃、30sec，56℃、30s，72℃、1min，共35个循环；最后72℃、10min；
结果判定：对上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若待检样品的仅扩增出一条带，且长度在886～892bp区间内，表明样品中含有NNV；若待检样品仅扩增出一条带，且长度为319bp，表明样品中含有SGIV；若待检样品出现两条特异的扩增条带，一条带的长度在886～892bp区间内，另一条带为319bp，则表明样品中含有NNV和SGIV病毒。
实施例2：
试剂盒的灵敏度检测：
(1)以制备的pUC57-NNVRNA2质粒(400ng/μL)和pMD18T-SGIVCP质粒(250ng/μL)按照(v/v)1:1混合做原液，再以1:10，1:50，1:100，1:500，1:103，1:5×103，1:104，1:105，1:106的倍数进行稀释，以此为模板，按照实施例1中体系和方法对RGNNV和SGIV病毒的灵敏度双重PCR检测实验；
结果如图1所示，利用质粒作为检测对象，双重PCR最低能检出RGNNV和SGIV的量分别为20pg和0.125pg。
实施例3：
一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的试剂盒的应用：
本实施例以石斑鱼S1作为阳性对照，以经PCR检测没有受到RGNNV和SGIV病毒感染的石斑鱼样品作为阴性对照。待检的为1J、2J、7k、8k四个疑似病毒感染的石斑鱼样品。
(1)提取石斑鱼样品的总DNA，备用；
提取总DNA具体步骤参考如下：
A.取待检石斑鱼鱼苗(2.2～2.5cm)头部，样品约0.2g置于研钵中，液氮冷冻后，研磨成粉末，并将研磨后的粉末转入1.5mL离心管中；
B.然后按照北京天根生化科技有限公司总DNA提取试剂盒说明书进行；
C.最后加入20uL双蒸馏水溶解总DNA，再加60uL双蒸馏水(1:3)稀释，-80℃保存备用，此即为所提取的S1总DNA样品；
取5μL提取后的总DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)提取石斑鱼样品的总RNA，备用；
提取总RNA具体步骤参考如下：
A.取待检石斑鱼鱼苗(2.2～2.5cm)头部，样品约0.2g置于研钵中，液氮冷冻15s后，研磨成粉末，并将研磨后的粉末转入1.5mL离心管中；
B.于步骤A的离心管中加入1mL预冷的Trizol regent试剂，混匀后，室温放置5min；
C.加入200μL氯仿，用手颠倒混匀15s，室温放置2～3min，4℃12 000×g离心15min；
D.取上清500uL，加入500uL 100％的异丙醇，室温放置10min，4℃12 000×g离心10min；
E.去清洗液，沉淀用1mL 75％乙醇清洗，涡旋混匀，4℃7 500×g离心5min；
F.去清洗液，瞬时离心，去剩余的清洗液，加入50uL无RNA酶水，-80℃保存备用，此即为所提取的S1总RNA样品；
取5μL提取后的总RNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)按照Takara生物技术有限公司的Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒，以第(2)步中所提取的S1总RNA为模板，进行第一链cDNA合成；
反转录体系设计如下：
步骤(1)中所提取总RNA(0.5μg/μL)，2μL；
Random primers(25μM)，1μL；
无RNA酶去离子水，加至10μL；
70℃保温10min后迅速在冰上冷却2min以上，继续加入以下试剂进行反应；
5×M-MLV buffer，2μL；
dNTP mixture(10μM)，0.5μL；
RNase Inhibitor(40U/μL)，0.25μL；
RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μL)，0.5μL；
无RNA酶去离子水，加至总体积20μL；
反应程序为：先30℃反应10min，42℃反转录60min，然后，70℃保温15min后冰上冷却；加20uL双蒸馏水(1:1)稀释，-20℃保存备用，此即为制备的第一链cDNA样品；
同时，以阴性对照样品的总RNA为模板，进行反转录反应。
(4)按照近岸蛋白质科技有限公司的2×Taq Master Mix试剂盒，以第(1)步中所制备的总DNA和第(3)步中所制备的第一链cDNA按1:1(v/v)混合作为模板，进行双重PCR检测；
25μL扩增体系设计如下：
步骤(1)中所制备的总DNA和步骤(3)中所制备的第一链cDNA混合液，2μL；
SinoBio 2×Master Mix，12.5μL(Mg2+终浓度为2mM)；
NNV-CPF4&CPR3，各1μL(5μM)；
GIV-CP287F&605R，各1μL(1μM)；
ddH2O，加至25μL；
反应程序为：先94℃变性2min；然后94℃、30sec，56℃、30s，72℃、1min，共35个循环；最后72℃、10min；
PCR扩增产物4℃保存备检，或者直接进行后续电泳检测。
(5)对步骤(4)中双重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若待检样品仅扩增出一条带，且长度在886～892bp区间内，表明样品中含有NNV；若待检样品仅扩增出一条带，且长度为319bp，表明样品中含有SGIV；若待检样品出现两条特异的扩增条带，一条带的长度在886～892bp区间内，另一条带为319bp，则表明样品中含有NNV和SGIV病毒；
检测结果表明，S1样品出现两条特异的扩增条带，其中一条的长度在886～892bp区间内，另一条为319bp，表明S1样品中含有RGNNV和SGIV病毒感染，与测序结果一致。
从图2中可以看出，4个待检石斑鱼样品总DNA提取成功；从图3中可以看出，4个待检石斑鱼样品总RNA均含有18S和28S rRNA条带，表明待检石斑鱼样品总RNA提取成功。从图4中可以看出，双重PCR检测结果显示，待检样品1J和2J感染RGNNV，待见样品7k和8k感染SGIV，与测序结果一致。
实施例4：
本发明提供的引物可同时检测感染GIV石斑鱼和感染NNV的其他鱼：
(1)分别提取感染BFNNV的条斑星鲽、SJNNV的黄带拟鰺、TNNV的大菱鲆、TPNNV的红鳍东方鲀等鱼的头部总RNA，并进行反转录，得cDNA；
(2)将样品石斑鱼7k的头部总DNA与分别与上述cDNA(v/v)1:1进行混合，然后利用本发明提供的引物和体系进行双重PCR扩增。
所有样品的检测结果均出现两条特异的扩增条带，其中一条的长度为319bp(SGIV)，另一条的长度在886～892bp区间内，说明本发明的双重PCR引物可用于其他鱼类NNV病毒的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，中国科学院水生生物研究所
<120> 一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用
<130> none
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 1
ccaatgacgt ccatctctca ggtatg 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 2
cactagggaa ccggatgacc c 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 3
ggctcggcgc aaacggtacc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 4
ggcaacacta cggtgggcag ag 22

Claims (2)

1.一种同时检测RGNNV和SGIV病毒所用PCR引物对，其特征在于，该引物具体为：
上游引物NNV-CPF4：5’-CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG-3’，
下游引物NNV-CPR3： 5’-CACTAGGGAACCGGATGACCC-3’，
上游引物GIV-CP287F： 5’-GGCTCGGCGCAAACGGTACC-3’，
和下游引物GIV-CP605R： 5’-GGCAACACTACGGTGGGCAGAG-3’。
2.权利要求1所述的引物在制备同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的检测试剂盒中的应用。
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