CN108034729B - 一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a及其扩增引物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST‑STR标记Lv‑F36a及其扩增引物和应用。本发明利用关联分析方法确定1个与凡纳滨对虾生长性状相关的EST‑STR标记，并进一步分析该EST‑STR位点的等位基因片段长度与生长性状的关联性，该EST‑STR位点扩增片段长度包含424bp、434bp、438bp和440bp的基因型仅在生长快速的凡纳滨对虾中检测到，且在生长快和生长慢的个体中差异显著，提示上述4个基因型为生长快速的优势基因型。本发明建立了凡纳滨对虾生长快速优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾优良品种奠定基础。

Description

一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a及其 扩增引物和应用
技术领域：
本发明涉及水产生物技术领域，具体涉及一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a及其扩增引物和应用。
背景技术：
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是全世界产量最大的养殖对虾。由于人工繁育群体容易引起遗传衰退，因此，必须通过良种选育才能保障凡纳滨对虾养殖业的可持续发展。近年来，以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术在水产育种中得到了广泛应用，加快了良种选育的进程。
微卫星(microsatellite)，又称短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)，为共显性标记，具有多态性丰富、重复性好、遗传稳定和可检测杂合子等优点，弥补了扩增片段长度多态性(amplified fragmentlength polymorphism,AFLP)和随机扩增多态性(random amplified polymorphic DNA,RAPD)等技术的不足，是目前在水产养殖动物遗传育种领域应用较广泛的分子标记技术。然而，迄今为止，凡纳滨对虾EST-STR标记的开发较少，尚无与性状相关联的EST-STR标记的开发。因此，本发明针对凡纳滨对虾的生长性状开发凡纳滨对虾生长性状相关EST-STR标记，以期用于凡纳滨对虾生长快速优良品种的辅助选育，从而加快凡纳滨对虾优良品种的选育进程。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a及其扩增引物和应用。以期用于凡纳滨对虾生长快速优良品种的辅助选育，从而加快凡纳滨对虾优良品种的选育进程。
为实现上述发明目的，本发明以生长快和生长慢的凡纳滨对虾DNA为模板，通过PCR扩增和测序来检测这些模板在8个高度多态性EST-STR位点的等位基因片段长度，并通过关联分析方法确定与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记，同时提供EST-STR位点扩增引物，建立凡纳滨对虾生长快速优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾优良品种奠定基础。
本发明的第一个目的是提供一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a的扩增引物，包括以下引物：
F：5’-GCCTCGGTAACATTGTGAAGAG-3’；
R：5’-ACAGCAACCAGGGTATTCAGG-3’。
优选，所述的扩增引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
所述的荧光基团优选为TAMRA、HEX或FAM。
本发明的第三个目的是提供上述的EST-STR标记Lv-F36a或扩增引物在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种凡纳滨对虾生长快速优良品种的选育方法，包括以下步骤：提取待测凡纳滨对虾基因组DNA作为模板，用上述的扩增引物进行PCR扩增，采用测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用软件读取等位基因片段的长度，选择扩增片段长度包含424bp、434bp、438bp或440bp的个体进行留种和建立家系，以选育凡纳滨对虾生长快速优良品种。
所述的提取待测凡纳滨对虾基因组DNA具体为：取待测凡纳滨对虾的1个腹肢，以腹肢作为材料提取基因组DNA。
所述的PCR扩增，其反应体系优选为25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL、5U/μL高保真PCR酶0.2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
所述的PCR扩增，其反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
本发明利用项目组筛选到的8个高度多态性的EST-STR标记的扩增引物对生长快和生长慢的凡纳滨对虾的基因组DNA模板进行PCR扩增，采用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，利用GeneMapper 3.2软件读取等位基因片段的长度，利用关联分析方法分析这8个EST-STR位点与生长性状的关联性，确定1个与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记(编号为Lv-F36a)，并进一步分析该EST-STR位点的等位基因片段长度与生长性状的关联性，该EST-STR位点扩增片段长度包含424bp、434bp、438bp和440bp的基因型仅在生长快速的凡纳滨对虾中检测到，且在生长快和生长慢的个体中差异显著(P<0.05)，提示上述4个基因型为生长快速的优势基因型。本发明建立了凡纳滨对虾生长快速优良品种分子标记辅助选育的技术体系，为快速选育凡纳滨对虾优良品种奠定基础。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序工作由上海生物工程有限公司完成。
实施例1：
1、生长快和生长慢凡纳滨对虾样本的收集
以来自于10个不同家系的1月龄凡纳滨对虾虾苗为选择对象，取体重大于0.1克的个体作为生长快的样本，取体重小于0.05克的个体作为生长慢的样本。
2.凡纳滨对虾生长相关EST-STR标记的筛选及等位基因片段长度与生长性状的关联性分析
2.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取
选取生长快和生长慢的虾苗各50条，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
2.2PCR扩增及测序
利用项目组筛选到的8个高度多态性的EST-STR标记的扩增引物(见表1)对生长快和生长慢的凡纳滨对虾基因组DNA模板进行PCR扩增。反应体系25μL，包括：10×PCR buffer(without Mg2+)2.5μL、MgCl2(25mM)2.0μL，dNTP(10mM)0.5μL、高保真PCR酶(
Figure BDA0001491515110000041
HSDNA Polymerase)(5U/μL)0.2μL、正向引物(10μM)0.5μL、反向引物(10μM)0.5μL、DNA模板(25ng/μL)0.5μL、无菌双蒸水18.3μL。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。PCR扩增产物先用2％琼脂糖电泳检测，然后采用3730XL测序仪进行分型，并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值。
表1用于凡纳滨对虾生长性状相关EST-STR标记筛选的引物
Figure BDA0001491515110000051
2.3EST-STR位点与生长性状的关联性分析
统计100个凡纳滨对虾样品用表1的8对EST-STR标记的引物扩增所获得的等位基因片段的具体数值，采用SPSS19.0软件对这些数据进行t检验，结果表明，Lv-2a、Lv-7a、Lv-F8a、Lv-F9a、Lv-F30a、Lv-F31a和Lv-F40a位点的等位基因片段长度在生长快和生长慢的凡纳滨对虾样品中无显著差异，而Lv-F36a位点的等位基因片段长度在生长快和生长慢的凡纳滨对虾样品中差异显著(P<0.05)。100个凡纳滨对虾样品在Lv-F36a位点的等位基因片段长度统计见表2。接着，采用关联分析方法进一步分析了Lv-F36a位点的等位基因片段长度与生长性状的关联性。结果表明，该Lv-F36a位点扩增片段长度包含424bp、434bp、438bp和440bp的基因型仅在生长快速的凡纳滨对虾中检测到，且在生长快和生长慢的个体中差异显著(P<0.05)，提示上述4个基因型为生长快速的优势基因型。而该Lv-F36a位点扩增片段长度包含426bp的基因型仅在生长速度慢的凡纳滨对虾中检测到，且在生长快和生长慢的个体中差异显著(P<0.05)，提示该基因型为生长速度慢的优势基因型。因此，Lv-F36a标记可作为凡纳滨对虾生长性状相关分子标记，用于凡纳滨对虾生长快速优良品种的辅助选育。
表2 100个凡纳滨对虾样品在Lv-F36a位点的等位基因片段长度统计表
Figure BDA0001491515110000061
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a及其扩增引物和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
gcctcggtaa cattgtgaag agtgcacaga ctggcgcatg gaaaaacctt acagttaggg 60
ttagtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag agagagagag agagagagag agagagagag 120
atctattttg atttatttca catgttacaa gctgatgaac ttgattgctt tcaaattctg 180
taagcagtga aatatttata ttagatattt attaatgtac tgaaattcag tttcgtcaca 240
taaaatagtt taggaaagtt atgtaattgg actgtataat tttttattta tttatttttt 300
tatgctttaa agaggaactt ctgtattgag tatatcgagg caaactgtac attttactga 360
tgtgaaatgc agctactaac aagcattatt tatacaggag gctaccctga ataccctggt 420
tgctgt 426

Claims (8)

1.一种与凡纳滨对虾生长性状相关的EST-STR标记Lv-F36a的扩增引物，其特征在于，包括以下引物：
F：5’-GCCTCGGTAACATTGTGAAGAG-3’；
R：5’-ACAGCAACCAGGGTATTCAGG-3’。
2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
3.根据权利要求2所述的扩增引物，其特征在于，所述的荧光基团为TAMRA、HEX或FAM。
4.权利要求1所述的扩增引物在凡纳滨对虾分子标记辅助育种中的应用。
5.一种凡纳滨对虾生长快速优良品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测凡纳滨对虾基因组DNA作为模板，用权利要求3所述的扩增引物进行PCR扩增，采用测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用软件读取等位基因片段的长度，选择扩增片段长度包含424bp、434bp、438bp或440bp的个体进行留种和建立家系，以选育凡纳滨对虾生长快速优良品种。
6.根据权利要求5所述的选育方法，其特征在于，所述的提取待测凡纳滨对虾基因组DNA具体为：取待测凡纳滨对虾的1个腹肢，以腹肢作为材料提取基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系为25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL、5U/μL高保真PCR酶0.2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
8.根据权利要求5～7任一项所述的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
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