CN114891900A

CN114891900A - 一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物

Info

Publication number: CN114891900A
Application number: CN202210758961.3A
Authority: CN
Inventors: 吴小易; 陈廷; 周智愚; 张金枫; 任春华; 陈小丽; 孙彩云; 刁德华; 胡超群
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: CN114891900B

Abstract

本发明公开了一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物。本发明利用棕点石斑鱼基因组数据，多重筛选和验证，获得8个SSR标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～8所示。本发明所述SSR标记，该标记具有多态性好、杂合度高的特点；其检测引物具有扩增稳定、重复性好的特点。本发明的SSR标记引物与方法可用于棕点石斑鱼人工养殖群体、增殖放流群体、野生群体的种群遗传多样性分析，在棕点石斑鱼人工养殖和增殖放流方面具有应用前景。

Description

一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物。

背景技术

棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)，俗名“老虎斑”，隶属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)。分布于红海、印度洋非洲东岸至太平洋波利尼西亚、北达琉球群岛、南至澳大利亚等海域等，栖息深度1-60米，体长可达120 厘米，属于暖水性近岸及珊瑚礁鱼类，生活在水质清澈的珊瑚礁、潟湖，肉食性，以鱼类、头足类、甲壳类为食。棕点石斑鱼具有富含营养、肉质鲜美、低脂肪、高蛋白等特点，是高档筵席必备之上等食用鱼。其价格昂贵，具有很高的经济价值，是我国沿海地区重要的养殖鱼类，并其在中国和东南亚国家得到了广泛养殖。除此以外，棕点石斑鱼自然数量稀少，近些年来高强度的捕捞压力已经使其资源处于枯竭状态，需要将人工增殖培育的棕点石斑鱼幼苗投放到放流海域，以恢复或增加天然种群数量。人工增养殖虽然经济效益巨大，通过增殖放流可以显著提高放流海域的生物量和种群规模，但存在遗传多样性不断下降，种质资源严重退化的问题。因此，亟需通过分子生物学等技术，对棕点石斑鱼养殖群体、放流群体和自然群体等的种群遗传多样性进行评估。

遗传分子标记中，现今使用较频繁的是序列分子标记、简单序列重复 (SSR)和单核苷酸多态性(SNP)三种标记，每种分子标记都有各自的优缺点。SSR(Simple SequenceRepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。微卫星在染色体上呈随机分布，以多拷贝方式均匀分布在真核生物的基因组中，其多态性是由重复次数不同及重复程度的不完全造成。对于已知的一条微卫星DNA序列，由于其重复序列区具有相当高的突变率(每世代10²-10⁶次的突变)，从而产生了高水平的等位基因多态性，而位于重复区两端的侧翼区序列则相对保守。因此，利用侧翼区序列就可以设计出特异引物对该位点进行扩增，从而用于相关的多态性研究。

SSR分子标记的开发方法包括：基因组酶切杂交法、随机扩增杂交法、锚定PCR扩增法、富集文库分离法、基于AFLP的SSR快速分离法和基于转录组测序的EST-SSR法。目前使用最广泛的是高通量、操作简便的EST-SSR 法。然而，由于EST-SSR法所获得的SSR标签位于转录区域，是基因组上SSR 密度较低的区域，且可能与性状关联发生正选择，并不能完全准确反映中性的种群基因流动情况。本发明的目的在于开发一套基于基因组的SSR标记技术，可用于棕点石斑鱼人工养殖群体、增殖放流群体、野生群体的种群遗传多样性分析，在棕点石斑鱼人工养殖和增殖放流方面具有应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物。该标记多态性强、杂合度高，可用于棕点石斑鱼人工养殖群体、增殖放流群体、野生群体的种群遗传多样性分析。

本发明的第一个目的在于提供一种高效评估棕点石斑鱼种群遗传多样性的SSR标记，包括如下分子标记中的至少一种：EFDSSR-01、EFDSSR-02、 EFDSSR-03、EFDSSR-04、EFDSSR-05、EFDSSR-06、EFDSSR-07、 EFDSSR-08；

其中，所述EFDSSR-01～EFDSSR-08的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～8所示。

实验表明，本发明提供的以上标记多态性强、杂合度高。

本发明通过在Genbank下载纹鳃棘鲈基因组，递交号为PRJDB9369，总长为748.23Mb，GC含量为39.5％，scaffoldN50长度为30.01Mb，contig N50 长度为1.08Mb。使用misa软件对SSR序列进行预测，选取3～4个重复单元的SSR，并计算出预期杂合度最高的SSR位点。

由此获得棕点石斑鱼基因组中多态性极高的SSR位点8个，标记编号为： EFDSSR-01、EFDSSR-02、EFDSSR-03、EFDSSR-04、EFDSSR-05、EFDSSR-06、 EFDSSR-07和EFDSSR-08；

所述的EFDSSR-01的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的EFDSSR-02的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的EFDSSR-03的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的EFDSSR-04的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的EFDSSR-05的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的EFDSSR-06的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的EFDSSR-07的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的EFDSSR-08的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第二个目的在于提供一种棕点石斑鱼的SSR标记的扩增引物，该引物扩增稳定、重复性好。

利用primer3软件，对筛选后的SSR批量设计PCR扩增产物长度为 200～300bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组Blast比对，挑选出特异性引物，在非SSR区域理论上没有序列扩增出，并且在SSR区域可以扩增出来。对SSR扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度(58～60℃)、GC值控制在50％～60％之间。通过PCR扩增，毛细管电泳检测扩增产物大小，筛选得到上述的8对特异性扩增、高多态性的SSR标记引物，所述的扩增引物包括：

扩增EFDSSR-01位点的引物对：

EFDSSR-01-F：5'-GGGGATATGAGGCTACACGC-3'(SEQ ID NO.9)；

EFDSSR-01-R：5'-TGGTCGATAGCTTCCTGCAC-3'(SEQ ID NO.10)；

扩增EFDSSR-02位点的引物对：

EFDSSR-02-F：5'-CCTCTGTTCGCACTACAGCT-3'(SEQ ID NO.11)；

EFDSSR-02-R：5'-ATTGCCTGAGTGGACCTGTG-3'(SEQ ID NO.12)；

扩增EFDSSR-03位点的引物对：

EFDSSR-03-F：5'-GCCCACTTACTGGATGGCTT-3'(SEQ ID NO.13)；

EFDSSR-03-R：5'-GCCCAGTGTCTGTTGACTCA-3'(SEQ ID NO.14)；

扩增EFDSSR-04位点的引物对：

EFDSSR-04-F：5'-TTTCCTACAACGCTGGTGGG-3'(SEQ ID NO.15)；

EFDSSR-04-R：5'-ACCACACAGAGATGCACTGG-3'(SEQ ID NO.16)；

扩增EFDSSR-05位点的引物对：

EFDSSR-05-F：5'-AGGCAAAGCAGCAAACTTGG-3'(SEQ ID NO.17)；

EFDSSR-05-R：5'-TCTGTGCTAGGTTTCTGTGCA-3'(SEQ ID NO.18)；

扩增EFDSSR-06位点的引物对：

EFDSSR-06-F：5'-GAACAGGTAGAACGGCACCA-3'(SEQ ID NO.19)；

EFDSSR-06-R：5'-TGCTGCCTACAGTCTAGGGT-3'(SEQ ID NO.20)；

扩增EFDSSR-07位点的引物对：

EFDSSR-07-F：5'-ACAAGGAGCACTATGAAGCGT-3'(SEQ ID NO.21)；

EFDSSR-07-R：5'-CGCGCTAACGGCAACAAATA-3'(SEQ ID NO.22)；

扩增EFDSSR-08位点的引物对：

EFDSSR-08-F：5'-CCCAGGCCTCCCTAGAAGAT-3'(SEQ ID NO.23)；

EFDSSR-08-R：5'-CCATGCTGAGGTTCAGGGTT-3'(SEQ ID NO.24)。

一些具体实施方案中，所述的扩增引物的正向引物的5'端标记有荧光基团；进一步，所述的荧光基团为ROX、FAM、HEX或TAMRA。

本发明的第三个目的在于提供一种棕点石斑鱼SSR标记的检测试剂盒，包含上述的扩增引物以及可接受的其他试剂盒组分。

一些具体实施方案中，所述可接受的其他试剂盒组分包括如下至少一种：不含

Mg²⁺的10×PCRbuffer、MgCl₂、dNTP、高保真PCR酶、无菌双蒸水。

本发明的第四个目的在于提供所述的SSR标记、所述的扩增引物或所述的试剂盒在棕点石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种高效评估棕点石斑鱼群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：

(1)收集棕点石斑鱼群体样本，提取棕点石斑鱼个体DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求2、3或4所述的扩增引物进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)扩增的PCR产物进行分型；

(4)对步骤(3)获得的分型结果进行遗传多样性分析。

一些具体实施方案中，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl₂ 2.0μL、10mM dNTP 0.5 μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA 模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL；

一些具体实施方案中，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：

95℃预变性5分钟；

95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；

72℃再延伸6分钟。

一些具体实施方案中，步骤(3)所述的分型，10对多态性SSR标记引物的5'端标记FAM荧光基团，并利用基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

一些具体实施方案中，步骤(4)所述的遗传多样性分析，利用GenAIex 软件进行遗传多样性分析，所述遗传多样性分析的指标包括每个位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)等反映群体遗传多样性的常用指标，以及用以衡量观测杂合度偏离Hardy-weinberg平衡程度的固定指数(F)。

本发明的最后一个目的在于提供上述SSR标记、扩增引物及试剂盒在棕点石斑鱼养殖群体、放流群体、自然群体遗传多样性分析方面的应用。

本发明有效效果如下：

与目前采用的限制性片段长度多态性(RFLP)、随机多态扩增DNA (RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)相比，具有：1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高； 3)以孟德尔方式遗传，呈共显性的优点，在对遗传多样性进行评估时具有优势。

具体实施方式

本发明提供了一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由武汉天一辉远有限公司完成。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：SSR标记对海南西沙群岛附近6尾野生棕点石斑鱼的遗传多样性分析

在Genbank下载斜带石斑鱼基因组，递交号为PRJDB9224，总长为997.41 Mb，GC含量41.3％，scaffoldN50长度42.36Mb，contigN50长度13.22Mb。使用misa软件对SSR序列进行预测，选取3～4个重复单元的SSR，并计算出预期杂合度最高的SSR位点，分别为EFDSSR-01、EFDSSR-02、EFDSSR-03、 EFDSSR-04、EFDSSR-05、EFDSSR-06、EFDSSR-07和EFDSSR-08，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。

利用primer3软件，对筛选后的SSR批量设计PCR扩增产物长度为 200～300bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组Blast比对，挑选出特异性引物，在非SSR区域理论上没有序列扩增出，并且在SSR区域可以扩增出来。对SSR扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度(58～60℃)、GC值控制在50％～60％之间。通过PCR扩增，毛细管电泳检测扩增产物大小，筛选得到上述的8对特异性扩增、高多态性的SSR标记引物，所述的引物包括：针对EFDSSR-01位点的EFDSSR-01-F 和EFDSSR-01-R；针对EFDSSR-02位点的EFDSSR-02-F和EFDSSR-02-R；针对EFDSSR-03位点的EFDSSR-03-F和EFDSSR-03-R；针对EFDSSR-04位点的EFDSSR-04-F和EFDSSR-04-R；针对EFDSSR-05位点的EFDSSR-05-F 和EFDSSR-05-R；针对EFDSSR-06位点的EFDSSR-06-F和EFDSSR-06-R；针对EFDSSR-07位点的EFDSSR-07-F和EFDSSR-07-R；针对EFDSSR-08位点的EFDSSR-08-F和EFDSSR-08-R(表1)。

采集来自中国海南西沙群岛附近6尾野生棕点石斑鱼样本，提取DNA并分别使用8对引物(表1)进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型。PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl₂ 2.0 μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM 反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL；其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸 30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。通过8对多态性SSR标记引物的 5'端标记FAM荧光基团，并利用ABI3730XL进行基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。通过GenAIEx软件进行统计分析，结果如表2所示。

表1.PCR使用的8对引物

表2. 8个SSR在6尾西沙群岛野生棕点石斑鱼个体中的遗传多样性参数

(N：样品个数、Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：香农多样性指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、F：固定指数、Mean：平均值)

表2结果显示，每个SSR标记的等位基因数(Na)在7～10个之间，平均每个SSR标记有7.875个等位基因，有效等位基因(Ne)在5.143～9.000之间，平均值为6.596；香农信息指数(I)在1.792～2.254之间，平均值为1.961；观测杂合度(Ho)在0.833～1.000之间，平均值为0.937；期望杂合度(He) 在0.806～0.889之间，平均值为0.844；固定指数(F)在-0.220～0.016之间，平均值为-0.111。

实施例2：SSR标记对海南XXX 3个棕点石斑鱼养殖群体的遗传多样性分析

采集海南XXX 3个全同胞家系棕点石斑鱼养殖群体各10尾，使用8对 SSR标记扩增引物(表1)分别对30个个体进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型，方法及步骤参考实施例1，通过软件进行统计分析，结果如表3所示。

表3.海南XXX 3个棕点石斑鱼养殖群体的遗传多样性参数

(N：样品个数、Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：香农信息指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、F：固定指数、Pop：群体、Mean：平均值、SE：标准误)

海南XXX 3个棕点石斑鱼养殖群体平均等位基因数分别为3.875、2.750、 3.250，平均有效等位基因数分别为3.775、2.497、3.001，平均香农信息指数分别为1.335、0.900、1.126，平均观察杂合度分别为1.000、0.850、0.888，平均期望杂合度分别为0.731、0.546、0.658，评估固定指数分别为-0.373、 -0.550、-0.350。结果表明，群体1的遗传多样性更高，合适用作人工增殖放流。

实施例3：SSR标记对一批西沙群岛放流棕点石斑鱼鱼苗的遗传多样性分析

2021年4月，采集西沙群岛放流棕点石斑鱼鱼苗20尾，使用8对SSR 标记扩增引物(表1)分别对20个放流个体进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型，方法及步骤参考实施例1，通过软件进行统计分析，结果如表4所示。

表4.一批西沙群岛放流棕点石斑鱼鱼苗的遗传多样性分析参数

2021年4月，一批西沙群岛放流棕点石斑鱼鱼苗平均等位基因数为6.625，平均有效等位基因数为5.594，平均香农信息指数为1.774，平均观察杂合度为0.906，平均期望杂合度为0.815，评估固定指数为-0.113。该批鱼苗的遗传多样性与野生群体差别较小，人工增殖放流不会降低当地棕点石斑鱼的遗传多样性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物

<130> MP22016970

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtcgatag cttcctgcac tagctgggtc tttaccaggt ttaacaaagg gtaggaccag 60

agcatttttc cagctgctag gcttgcgctg ctgctgctgc tgctgctgct tcttcttctt 120

cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct ttctatttaa 180

tggcggattg caagcaatgt taagtgcata ccgccaccta ctgtacaaga gcgtgtagcc 240

tcatatcccc 250

<210> 2

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attgcctgag tggacctgtg gatggatgga tggatggatg gatggatgga tggatggatg 60

gatggatgga tggaaggatg gaatagatag atagatagat agacagatag atagatagat 120

agatagatag atagatagat agatagacag acagacagac agacagatag atagatagat 180

agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat 240

agatagatag atatttgatt ggagcagctg tagtgcgaac agagg 285

<210> 3

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcccagtgtc tgttgactca ccgaggtgca ccgtgccagc tattcatacc ttcctcccac 60

tctcatttta tttctccagc aaatcagtca gctagccagc taaccaggtg ggaaattcaa 120

gactaaaaca agagctttga ctttgacttt tgacttgaaa ggatgtttga aggtgtctat 180

ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat 240

ctgataagcc atccagtaag tgggc 265

<210> 4

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accacacaga gatgcactgg aactgcagtg agacacaaaa taactaaaaa gaggtggtgg 60

gtccattagc atatctgtgc ccaggggctt attgtttcat aatcttccca tgctcctttg 120

actttatgtc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta 180

tctatctatc tatctcagtc cagtcccagc caaccgagtg caagtgatgc ccagctctgc 240

ctacgtcaca gcccaaagac acgcccacca gcgttgtagg aaa 283

<210> 5

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgtgctag gtttctgtgc ataacagttt ttatcggata tattttttaa aaatgcaaag 60

gaaaaataca gatttggtgt tcaaaggctt taagttggag atagatagat agatagatag 120

atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagagactt tattgttatt 180

cacatccaca tcgtcaacag tgcacataaa actgaaattt cgttggatct gactctgaat 240

aaaatatgga taaaactaca tagcaaccaa gtttgctgct ttgcct 286

<210> 6

<211> 277

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctgcctac agtctagggt gatcatccta ctgggagcac gaatatgatc agaaagttta 60

atggaaatct ttggtcaatc attagatttc tgacatatcc tgtgtacaga tgcaactttt 120

ggtcacggta tctcatgagg aaagataaga gtccaaaccc tcagggtgta tcctctgcag 180

agcatgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat 240

agatagatag atagatatgg tgccgttcta cctgttc 277

<210> 7

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcgctaacg gcaacaaata gatcccccgt gagggttttt taaattaaat taaaaattaa 60

attagatttt taagcaaggg tttgactctt tattaggaaa tgggtgcaca cgacatactg 120

acacagtcaa ttagaaatta attcataact ttttgaataa gcccagttga aatctgcaat 180

aataataata ataataataa taataataat aataataata ataatatgtg gtgatcacaa 240

aaacgcttca tagtgctcct tgt 263

<210> 8

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatgctgag gttcagggtt ctacactaca tcactttact agttcttcat ctcctctgcc 60

tcctcatttt gtactgtttt tgctcttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc 120

tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc gttctttcaa caactattga 180

atgggttgta aaattgttgg gtagatgtga acctgggtag tacagataat atggcttccc 240

cacagacagg gctagattaa tcttctaggg aggcctggg 279

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggatatga ggctacacgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggtcgatag cttcctgcac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctctgttcg cactacagct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgcctgag tggacctgtg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcccacttac tggatggctt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcccagtgtc tgttgactca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttcctacaa cgctggtggg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accacacaga gatgcactgg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggcaaagca gcaaacttgg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctgtgctag gtttctgtgc a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaacaggtag aacggcacca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgctgcctac agtctagggt 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acaaggagca ctatgaagcg t 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgcgctaacg gcaacaaata 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cccaggcctc cctagaagat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccatgctgag gttcagggtt 20

Claims

1.一种棕点石斑鱼的SSR分子标记，其特征在于，包括如下分子标记中的至少一种：EFDSSR-01、EFDSSR-02、EFDSSR-03、EFDSSR-04、EFDSSR-05、EFDSSR-06、EFDSSR-07、EFDSSR-08；

2.权利要求1所述的SSR分子标记的扩增引物。

3.根据权利要求2所述的扩增引物，其特征在于，包括：

扩增EFDSSR-01的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-02的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-03的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-04的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-05的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-06的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-07的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示的上、下游引物；

扩增EFDSSR-08的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23～24所示的上、下游引物。

4.根据权利要求3所述的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物的上游引物的5'端标记有荧光基团；所述的荧光基团为ROX、FAM、HEX或TAMRA。

5.一种用于棕点石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～4任一项所述的扩增引物以及可接受的其他试剂盒组分。

6.权利要求1所述的SSR标记、权利要求2～4任一项所述的扩增引物或权利要求5所述的试剂盒在棕点石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定中的应用。

7.一种高效评估棕点石斑鱼种群遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)收集棕点石斑鱼群体样本，提取棕点石斑鱼个体DNA；

2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求2～4任一项所述的扩增引物进行PCR扩增；

3)对步骤2)扩增的PCR产物进行分型；

4)对步骤3)获得的分型结果进行遗传多样性分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中，

所述的PCR扩增的反应体系为25μL，包括：不含Mg²⁺的10×PCRbuffer2.5L、25mM MgCl₂2.0L、10mM dNTP0.5L、高保真PCR酶1U、10M正向引物0.5L、10M反向引物0.5L、DNA模板12.5ng，无菌双蒸水补足至25L；

所述PCR扩增的程序为：

95℃预变性5分钟；

95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；

72℃再延伸6分钟。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，利用GenAIex软件进行遗传多样性分析，所述遗传多样性分析的指标包括每个位点的等位基因数、有效等位基因数、香农信息指数、观测杂合度、期望杂合度、固定指数中的至少一种。

10.权利要求1所述的SSR标记、权利要求2所述的扩增引物、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的评估方法在棕点石斑鱼养殖群体、放流群体、自然群体遗传多样性分析中的应用。