CN114921563A - 一种斜带石斑鱼增养殖ssr标记及其检测引物和应用 - Google Patents

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CN114921563A CN202210487782.0A CN202210487782A CN114921563A CN 114921563 A CN114921563 A CN 114921563A CN 202210487782 A CN202210487782 A CN 202210487782A CN 114921563 A CN114921563 A CN 114921563A
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Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼增养殖SSR标记及其检测引物和应用。SSR标记包括ECDSSR‑01、ECDSSR‑02、ECDSSR‑03、ECDSSR‑04、ECDSSR‑05、ECDSSR‑06、ECDSSR‑07和ECDSSR‑08。本发明基于基因组数据开发的SSR标记及引物，该开发的SSR标记比现有技术开发的标记多态性更高，对9个个体进行遗传多样性分析即获得12个以上的等位基因，远高于现有技术对20个个体4～12个等位基因的水平，在对遗传多样性较低的群体(如增殖放流群体)进行评估时具有优势。本发明开发的SSR分子标记可用于斜带石斑鱼遗传多样性分析等领域，为今后斜带石斑鱼种质资源调查、放流效果评估提供理论基础。

Description

一种斜带石斑鱼增养殖SSR标记及其检测引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于斜带石斑鱼基因组获得的高效评估斜带石斑鱼种群遗传多样性的SSR标记、引物、方法及其在斜带石斑鱼增养殖中的应用。
背景技术
斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)，俗名“青斑”，隶属鲈形目(Perciformes)、、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)。斜带石斑鱼属暖水性岛礁海水鱼，主要分布西至红海，南至南非，东至帕劳群岛和斐济群岛，北至琉球群岛(日本)，在我国广东、广西、海南、福建、台湾皆有分布。常栖息于大陆沿岸和大岛屿，但在河口、离岸100米深的水域中也有发现。斜带石斑鱼是我国南方重要的养殖鱼类，由于其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽，市场价格高且稳定，受到消费者和养殖者的青睐。
然而，由于近年来采捕过度、水域污染等人为因素影响，斜带石斑鱼的野生种群资源量和遗传多样性下降，需要通过人工增养殖的方法对其种质资源进行保护和合理开发。同时，在斜带石斑鱼的自然资源评估、人工养殖和增殖放流过程中，需要对其遗传多样性进行评估。
在遗传分子标记中，现今使用较频繁的是序列分子标记、简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)三种标记，每种分子标记都有各自的优缺点。SSR(Simple SequenceRepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。微卫星在染色体上呈随机分布，以多拷贝方式均匀分布在真核生物的基因组中，其多态性是由重复次数不同及重复程度的不完全造成。对于已知的一条微卫星DNA序列，由于其重复序列区具有相当高的突变率(每世代102-106次的突变)，从而产生了高水平的等位基因多态性，而位于重复区两端的侧翼区序列则相对保守。因此，利用侧翼区序列就可以设计出特异引物对该位点进行扩增，从而用于相关的多态性研究。
SSR分子标记的开发方法包括：基因组酶切杂交法、随机扩增杂交法、锚定PCR扩增法、富集文库分离法、基于AFLP的SSR快速分离法和基于转录组测序的EST-SSR法。目前使用最广泛的是高通量、操作简便的EST-SSR法。然而，由于EST-SSR法所获得的SSR标签位于转录区域，是基因组上SSR密度较低的区域，且可能与性状关联发生正选择，并不能完全准确反映中性的种群基因流动情况。
过去，斜带石斑鱼SSR标记的等位基因数目为4～12个，在对遗传多样性较低的群体(如人工养殖群体、增殖放流群体)进行评估时，使用效率比较受限制。随着全基因组测序技术的发展，可以通过直接对基因组中SSR序列进行筛选分析，获得预期等位基因数最高的SSR标记。因此，我们希望在斜带石斑鱼基因组中挖掘高效的SSR标记并开发引物和检测方法，为高效评估斜带石斑鱼遗传多样性奠定基础，提供增养殖效益。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高效评估斜带石斑鱼种群遗传多样性的SSR标记，该标记多态性强、杂合度高。
本发明的SSR标记，标记编号为：ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07、ECDSSR-08，具体如下：
所述的ECDSSR-01的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的ECDSSR-02的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的ECDSSR-03的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的ECDSSR-04的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的ECDSSR-05的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的ECDSSR-06的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的ECDSSR-07的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的ECDSSR-08的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的在于提供一种高效评估斜带石斑鱼种群遗传多样性的SSR标记检测引物，该引物扩增稳定、重复性好；
针对ECDSSR-01位点：
ECDSSR-01-F：5’-GTCCTCTGCTTTGGGCTGAA-3’；
ECDSSR-01-R：5’-GAGTCACTGCACACTGACGA-3’；
针对ECDSSR-02位点：
ECDSSR-02-F：5’-CCTGTTGGCTGACTTTGAGC-3’；
ECDSSR-02-R：5’-CTGGAAGGCCTGTTCAGTCA-3’；
针对ECDSSR-03位点：
ECDSSR-03-F：5’-TACTGCAGCACCACAGACTG-3’；
ECDSSR-03-R：5’-TGAACAGGCTGGTCTGCTTT-3’；
针对ECDSSR-04位点：
ECDSSR-04-F：5’-ACGCCATGCATGTCCATGTA-3’；
ECDSSR-04-R：5’-AGAGCCGCTTGTTCAAGAGG-3’；
针对ECDSSR-05位点：
ECDSSR-05-F：5’-AGGGTCTGCCTCTCCATCAT-3’；
ECDSSR-05-R：5’-AGACAGGGATCACTGCAAGC-3’；
针对ECDSSR-06位点：
ECDSSR-06-F：5’-GGGACAGGTGAGCAGATCAG-3’；
ECDSSR-06-R：5’-CCCATGAGGTGTCACTAGTGG-3’；
针对ECDSSR-07位点：
ECDSSR-07-F：5’-ATCCTTTATGCCAGGGCTGC-3’；
ECDSSR-07-R：5’-GCTCTTTGTCTGCCAACAGC-3’；
针对ECDSSR-08位点：
ECDSSR-08-F：5’-GCTGTGGCTCCTCAGTCATT-3’；
ECDSSR-08-R：5’-ATTTCCCACTCAGCGTGTGT-3’。
优选，所述检测引物的正向引物的5'端标记有荧光基团，如FAM荧光基团。
本发明的第三个目的在于提供检测上述的SSR标记的试剂在制备斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的产品中的应用。
本发明的第四个目的在于提供上述的SSR标记或上述的检测引物在制备用于斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种用于斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的试剂盒，该试剂盒包含上述的检测引物。
本发明的第六个目的在于提供一种高效评估斜带石斑鱼群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：
(1)收集斜带石斑鱼群体样本，提取斜带石斑鱼个体DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用所述的检测引物进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)扩增的PCR产物进行分型；
(4)对步骤(3)获得的分型结果进行遗传多样性分析。
优选的，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg2+的10×PCRbuffer 2.5μL、25mM MgCl22.0μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
优选的，步骤(3)所述的分型，8对多态性SSR标记引物的正向引物5'端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL进行基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。
优选的，步骤(4)所述的遗传多样性分析，利用GenAIex软件进行遗传多样性分析，包括每个位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)等反映群体遗传多样性的常用指标，固定指数(F)用以衡量观测杂合度偏离Hardy-weinberg平衡的程度，中使用MEGA6.0以UPGMA方法进行聚类树构建。
本发明的最后一个目的在于提供上述SSR标记、检测引物、试剂盒或评估方法在斜带石斑鱼养殖种群遗传多样性分析、地理群体鉴定或增殖放流效果评估等增养殖方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明基于基因组数据开发的SSR标记及引物，该开发的SSR标记比现有技术开发的标记多态性更高，对9个个体进行遗传多样性分析即获得12个以上的等位基因，远高于现有技术对20个个体4～12个等位基因的水平，在对遗传多样性较低的群体(如增殖放流群体)进行评估时具有优势。本发明开发的SSR分子标记可用于斜带石斑鱼遗传多样性分析等领域，为今后斜带石斑鱼种质资源调查、放流效果评估提供理论基础。
附图说明：
图1通过SSR分析珠海斗门、万山群岛、阳江海陵岛30尾斜带石斑鱼的遗传关系图，ZH：珠海斗门、WS：万山群岛、YJ：阳江海陵岛
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由武汉天一辉远有限公司完成。
在Genbank下载斜带石斑鱼基因组，递交号为PRJEB28248，总长为1023.56Mb，GC含量41.3％，scaffoldN50长度2.44Mb，contig N50长度2.33Mb。使用misa软件对SSR序列进行预测，选取3～4个重复单元的SSR，根据二代测序数据计算出预期杂合度最高的SSR位点。
获得斜带石斑鱼基因组中多态性极高的SSR位点8个，标记编号为：ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07、ECDSSR-08。
所述的ECDSSR-01的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的ECDSSR-02的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的ECDSSR-03的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的ECDSSR-04的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的ECDSSR-05的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的ECDSSR-06的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的ECDSSR-07的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的ECDSSR-08的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
利用primer3软件，对筛选后的SSR设计PCR扩增产物长度为200～300bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组Blast比对，挑选出特异性引物，在非SSR区域理论上没有序列扩增出，并且在SSR区域可以扩增出来。对SSR扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度(58～60℃)、GC值控制在50％～60％之间。通过PCR扩增，毛细管电泳检测扩增产物大小，筛选得到上述的8对特异性扩增、高多态性的SSR标记引物，所述的检测引物包括：
针对ECDSSR-01位点：
ECDSSR-01-F：5’-GTCCTCTGCTTTGGGCTGAA-3’；
ECDSSR-01-R：5’-GAGTCACTGCACACTGACGA-3’；
针对ECDSSR-02位点：
ECDSSR-02-F：5’-CCTGTTGGCTGACTTTGAGC-3’；
ECDSSR-02-R：5’-CTGGAAGGCCTGTTCAGTCA-3’；
针对ECDSSR-03位点：
ECDSSR-03-F：5’-TACTGCAGCACCACAGACTG-3’；
ECDSSR-03-R：5’-TGAACAGGCTGGTCTGCTTT-3’；
针对ECDSSR-04位点：
ECDSSR-04-F：5’-ACGCCATGCATGTCCATGTA-3’；
ECDSSR-04-R：5’-AGAGCCGCTTGTTCAAGAGG-3’；
针对ECDSSR-05位点：
ECDSSR-05-F：5’-AGGGTCTGCCTCTCCATCAT-3’；
ECDSSR-05-R：5’-AGACAGGGATCACTGCAAGC-3’；
针对ECDSSR-06位点：
ECDSSR-06-F：5’-GGGACAGGTGAGCAGATCAG-3’；
ECDSSR-06-R：5’-CCCATGAGGTGTCACTAGTGG-3’；
针对ECDSSR-07位点：
ECDSSR-07-F：5’-ATCCTTTATGCCAGGGCTGC-3’；
ECDSSR-07-R：5’-GCTCTTTGTCTGCCAACAGC-3’；
针对ECDSSR-08位点：
ECDSSR-08-F：5’-GCTGTGGCTCCTCAGTCATT-3’；
ECDSSR-08-R：5’-ATTTCCCACTCAGCGTGTGT-3’。
所述检测引物的正向引物的5'端标记有荧光基团，如FAM荧光基团。
一种高效评估斜带石斑鱼群体遗传多样性的方法，包括以下步骤
(1)收集斜带石斑鱼群体样本，取样部位为背鳍或尾鳍，取样过程对鱼不造成明显损伤，提取斜带石斑鱼个体DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的针对ECDSSR-01位点的引物对ECDSSR-01-F/R、针对ECDSSR-02位点的引物对ECDSSR-02-F/R、针对ECDSSR-03位点的引物对ECDSSR-03-F/R、针对ECDSSR-04位点的引物对ECDSSR-04-F/R、针对ECDSSR-05位点的引物对ECDSSR-05-F/R、针对ECDSSR-06位点的引物对ECDSSR-06-F/R、针对ECDSSR-07位点的引物对ECDSSR-07-F/R、针对ECDSSR-08位点的引物对ECDSSR-08-F/R进行PCR扩增；
所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg2+的10×PCRbuffer 2.5μL、25mMMgCl22.0μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
所述的PCR扩增，其反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
(3)对步骤(2)扩增的PCR产物进行毛细管电泳分型，是利用ABI 3730XL进行基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。
(4)对步骤(3)获得的分型结果进行遗传多样性分析，具体是利用GenAIex软件进行遗传多样性分析，包括每个位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)等反映群体遗传多样性的常用指标，固定指数(F)用以衡量观测杂合度偏离Hardy-weinberg平衡的程度，中使用MEGA6.0以UPGMA方法进行聚类树构建。
实施例1：
采集来自广东省珠海斗门、万山群岛、阳江海陵岛斜带石斑鱼样本合计9尾。使用上述针对ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07、ECDSSR-08的位点的8对检测引物分别对9个体进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型，通过软件进行统计分析，结果如表1所示。
每个SSR标记的等位基因数(Na)在12～13个之间，平均每个SSR标记有12.375个等位基因，有效等位基因在6.75～10.8之间，平均值为8.944；香农信息指数在2.289～2.476之间，平均值为2.364；观测杂合度在0.667～1.000之间，平均值为0.861；期望杂合度在0.852～0.907之间，平均值为0.886，观测杂合度与期望杂合度接近，说明不存在杂合度缺失；固定指数在-0.141～0.26之间，平均值为0.027。
表1. 8个SSR在9尾不同来源斜带石斑鱼个体中的遗传多样性参数
Figure BDA0003629906030000101
N：样品个数、Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：香农信息指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、F：固定指数
实施例2：
采集来自海南东方的3个斜带石斑鱼养殖群体，每个群体10尾，使用上述针对ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07、ECDSSR-08位点的8对检测引物分别对3个群体合计30个个体进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型，通过软件进行统计分析，结果如表2所示。
海南东方的3个斜带石斑鱼养殖群体的平均等位基因数分别为5.25、4.25、5.25，平均有效等位基因数分别为3.711、3.537、4.204，平均香农信息指数分别为1.425、1.311、1.506，平均观察杂合度分别为0.688、0.763、0.763，平均期望杂合度分别为0.725、0.704、0.757，评估固定指数分别为0.051、-0.079、-0.003。
表2.海南东方3个斜带石斑鱼养殖群体的遗传多样性参数
Figure BDA0003629906030000111
N：样品个数、Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：香农信息指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、F：固定指数、Pop：群体、Mean：平均值、SE：标准误
实施例3：
采集来自广东省珠海斗门、万山群岛、阳江海陵岛斜带石斑鱼样本各10尾，合计30尾，使用上述针对ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07、ECDSSR-08位点的8对检测引物分别进行PCR扩增分析和毛细管电泳分型，使用GeneMarker4.0进行峰图判读并建立等位基因矩阵，使用GenALEx进行遗传距离计算，并使用MEGA6.0以UPGMA方法进行聚类树构建。
如图1所示：通过SSR分析获得采集自不同海域石斑鱼的遗传关系符合地理分布。珠海斗门斜带石斑鱼群体与万山群岛斜带石斑鱼群体遗传距离较近，且有混杂，阳江海陵岛群体与其他两个去群体遗传距离较远，且显著分离。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种斜带石斑鱼增养殖SSR标记及其检测引物和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 1
gagtcactgc acactgacga gttcaaaaca ctcgagtcaa cttcctgtgt gtaattacag 60
tgtcgtgatt aaaatgtgag tctgtgttca tccatgttgt tggagtttta cctgctccag 120
cttcatcaga gaagggtcag agggtcagag gtcaggggtc agaggtctgg agctggaggg 180
agttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttca 240
gctccaacca caggcatgtt aattagcagt gaggcatttc agcccaaagc agaggac 297
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 2
ctggaaggcc tgttcagtca tccatccatg acaaaacaga tcacaggtat aacattacaa 60
cagtaagaga gaaagagaca gaaaacaaac attaagtcaa cccatggtaa aacaaaacaa 120
aaaaaaagga aaaagacatt caaattgtat tttctctatc tatctatcta tctatctatc 180
tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctgag 240
ttcagactgc tattgttctg tgactctcct gtcatctaca gctcaaagtc agccaacagg 300
<210> 3
<211> 297
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 3
tgaacaggct ggtctgcttt atgagtactt ttactttaaa tacttaatta tattgtggtg 60
acattacttt aatttcagta aaatcttctt cttcttcttc tcttcttttc ttcttcttct 120
tcttcttctc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt 180
cttcttcttt tcttcttctt cttcttcttc ttcttctctt ctttcttctt ctcttttctt 240
cttcttcttt cttcttgctt cttcctgctc ttcttaccag tctgtggtgc tgcagta 297
<210> 4
<211> 269
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 4
agagccgctt gttcaagagg gtagtgattg tagaaagaag aaagtattat gatgctgctc 60
aatacaacca gtttaaattt aataataata ataataataa taataataat aataataata 120
ataataataa taataataat attatatgga attgccctat ggcttcactg agacctctta 180
ccattcctgt acaatccacc taaaacacct attcagggca tacctgaagt aaattgacag 240
ctgttcttgt acatggacat gcatggcgt 269
<210> 5
<211> 212
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 5
agacagggat cactgcaagc atgcacgaac attagaaaat gggagataga tagatagata 60
gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatcaaac 120
ccgccttact gtctcagcag ggatgtgccc ccctttgtgc ctccgcggag gccttggccg 180
aacccgtgtc acatgatgga gaggcagacc ct 212
<210> 6
<211> 275
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 6
cccatgaggt gtcactagtg gctttctgta agtgacctag aagtgcaaaa gcattgaaga 60
agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga 120
agaagaagaa gaagacgaca ctgatggaaa catttgggct aagtacacac taaacaaaat 180
acagttgtta ttgctgaagt cactttaagg tatgtgtgca caaacacaca cattctgtct 240
ttaaataaaa ggagactgat ctgctcacct gtccc 275
<210> 7
<211> 262
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 7
gctctttgtc tgccaacagc aatgtgcttc ctgttaggaa tcagtgcact ggacagaatc 60
agtcccaaat gtctctgtgg tggtgatgta aacactgcat ggcctctaac atatgccatt 120
acattatcct tatgatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat 180
agatagatag atagatagat agataataga aagccaactt tgccccacag gccccactct 240
gggcagccct ggcataaagg at 262
<210> 8
<211> 285
<212> DNA
<213> 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)
<400> 8
atttcccact cagcgtgtgt gtcagtgtgt gtctgtcata cttgcaatgg acagatggac 60
agcacagaca aatggataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga 120
tagatagata gatagataga tagatagata gatgaaaata ggtaccaaca ttgtctgatt 180
cactccaaat gtctacactg aacacaattc cacataagct tgagaccatt gcagggtcac 240
tgtcacggct caacgtcaaa tgtcaaatga ctgaggagcc acagc 285

Claims (10)

1.一种斜带石斑鱼的SSR标记，其特征在于，包括ECDSSR-01、ECDSSR-02、ECDSSR-03、ECDSSR-04、ECDSSR-05、ECDSSR-06、ECDSSR-07和ECDSSR-08：
所述的ECDSSR-01的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的ECDSSR-02的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的ECDSSR-03的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的ECDSSR-04的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的ECDSSR-05的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的ECDSSR-06的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的ECDSSR-07的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的ECDSSR-08的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种高效评估斜带石斑鱼种群遗传多样性的SSR标记检测引物，其特征在于，所述的检测引物包括：
针对ECDSSR-01位点：
ECDSSR-01-F：5’-GTCCTCTGCTTTGGGCTGAA-3’；
ECDSSR-01-R：5’-GAGTCACTGCACACTGACGA-3’；
针对ECDSSR-02位点：
ECDSSR-02-F：5’-CCTGTTGGCTGACTTTGAGC-3’；
ECDSSR-02-R：5’-CTGGAAGGCCTGTTCAGTCA-3’；
针对ECDSSR-03位点：
ECDSSR-03-F：5’-TACTGCAGCACCACAGACTG-3’；
ECDSSR-03-R：5’-TGAACAGGCTGGTCTGCTTT-3’；
针对ECDSSR-04位点：
ECDSSR-04-F：5’-ACGCCATGCATGTCCATGTA-3’；
ECDSSR-04-R：5’-AGAGCCGCTTGTTCAAGAGG-3’；
针对ECDSSR-05位点：
ECDSSR-05-F：5’-AGGGTCTGCCTCTCCATCAT-3’；
ECDSSR-05-R：5’-AGACAGGGATCACTGCAAGC-3’；
针对ECDSSR-06位点：
ECDSSR-06-F：5’-GGGACAGGTGAGCAGATCAG-3’；
ECDSSR-06-R：5’-CCCATGAGGTGTCACTAGTGG-3’；
针对ECDSSR-07位点：
ECDSSR-07-F：5’-ATCCTTTATGCCAGGGCTGC-3’；
ECDSSR-07-R：5’-GCTCTTTGTCTGCCAACAGC-3’；
针对ECDSSR-08位点：
ECDSSR-08-F：5’-GCTGTGGCTCCTCAGTCATT-3’；
ECDSSR-08-R：5’-ATTTCCCACTCAGCGTGTGT-3’。
3.根据权利要求2所述的检测引物，其特征在于，所述检测引物的正向引物的5'端标记有荧光基团。
4.根据权利要求3所述的检测引物，其特征在于，所述的荧光基团为FAM荧光基团。
5.检测权利要求1所述的SSR标记的试剂在制备斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的产品中的应用。
6.检测权利要求1所述的SSR标记或权利要求2所述的检测引物在制备用于斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的试剂盒中的应用。
7.一种用于斜带石斑鱼群体遗传多样性分析及种群鉴定的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求2所述的检测引物。
8.一种高效评估斜带石斑鱼群体遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集斜带石斑鱼群体样本，提取斜带石斑鱼个体DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用所述的检测引物进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)扩增的PCR产物进行分型；
(4)对步骤(3)获得的分型结果进行遗传多样性分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：
不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl22.0μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL；
其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
10.权利要求1所述的SSR标记、权利要求2所述的检测引物、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的方法在斜带石斑鱼养殖种群遗传多样性分析、地理群体鉴定或增殖放流效果评估增养殖方面的应用。
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