CN107287296A - 凡纳滨对虾功能基因est‑ssr标记及其特异性引物和检测方法 - Google Patents

凡纳滨对虾功能基因est‑ssr标记及其特异性引物和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾功能基因EST‑SSR标记及其特异性引物和检测方法。本发明的EST‑SSR标记编号分别为Lv‑F008、Lv‑F010、Lv‑F014、Lv‑F016、Lv‑F028、Lv‑F032、Lv‑F047和Lv‑F056。本发明获得的8个EST‑SSR标记的等位基因数分别为4、3、5、6、5、7、3和10个，观测杂合度、期望杂合度和PIC值均大于0.5，说明这8个EST‑SSR标记均具有高度多态性，可用于凡纳滨对虾种质资源的遗传结构和遗传多样性分析、分子指纹图谱构建和分子标记辅助育种。

Description

凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测 方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法。
背景技术：
微卫星(microsatellite)，又称简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)或短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)，为共显性标记，具有多态性丰富、重复性好、遗传稳定和可检测杂合子等优点，弥补了扩增片段长度多态性(amplified fragmentlength polymorphism,AFLP)和随机扩增多态性(random amplified polymorphic DNA,RAPD)等技术的不足，是目前在水产养殖动物种群遗传结构研究和遗传育种领域应用较广泛的分子标记技术。随着功能基因组学的发展，表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记，除具有传统SSR标记的优点外，因其反映的是转录区的差异，其多态性可能与基因功能直接相关。因此，与传统的SSR标记相比，EST-SSR标记在分子标记辅助选择育种领域具有更高的应用价值。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，是全世界产量最大的养殖对虾。在我国，凡纳滨对虾养殖区域遍布于全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区，是我国水产养殖的支柱性产业。迄今为止，凡纳滨对虾EST-SSR标记的开发较少，与功能基因相关联的EST-SSR标记的开发则更少，仅在凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因中筛选到5个EST-SSR标记。本发明基于转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列，利用渗透压调节相关功能基因之外的其他功能基因的EST序列进行EST-SSR标记的开发，从而为凡纳滨对虾遗传多样性研究、遗传图谱构建和进化分析奠定基础，同时为凡纳滨对虾分子标记辅助育种提供有价值的分子标记。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法。为凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种提供有价值的分子标记。
本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记，所述的EST-SSR标记编号分别为Lv-F008、Lv-F010、Lv-F014、Lv-F016、Lv-F028、Lv-F032、Lv-F047和Lv-F056；
所述的Lv-F008的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的Lv-F010的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的Lv-F014的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的Lv-F016的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的Lv-F028的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的Lv-F032的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的Lv-F047的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的Lv-F056的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的特异性引物，所述的EST-SSR标记的特异性引物如下所示：
针对位点Lv-F008：
Lv-F008-F：5’-TCAGCCCTTATAGATTTAAAAGAAAA-3’(如SEQ ID NO.9所示)；
Lv-F008-R：5’-TTAATATAAAATCCCGGCCAAAC-3’(如SEQ ID NO.10所示)；
针对位点Lv-F010：
Lv-F010-F：5’-TTTAAATATGGCTTCCTCCTTGG-3’(如SEQ ID NO.11所示)；
Lv-F010-R：5’-ACAGCTACGGCTCGTTACCTAGA-3’(如SEQ ID NO.12所示)；
针对位点Lv-F014：
Lv-F014-F：5’-GGGAGAGAATCTAGCTTGTGATG-3’(如SEQ ID NO.13所示)；
Lv-F014-R：5’-CTTGTTGCTTGATTCCACTTTTT-3’(如SEQ ID NO.14所示)；
针对位点Lv-F016：
Lv-F016-F：5’-TATGAAAAGGTTAGAGCGAGTGG-3’(如SEQ ID NO.15所示)；
Lv-F016-R：5’-CCAAACACGTTTATCCACACATA-3’(如SEQ ID NO.16所示)；
针对位点Lv-F028：
Lv-F028-F：5’-ACCAAGGACTTCTTCGGTGAG-3’(如SEQ ID NO.17所示)；
Lv-F028-R：5’-ATACCCGAATGGAAAAAGAAGAA-3’(如SEQ ID NO.18所示)；
针对位点Lv-F032：
Lv-F032-F：5’-ATGGAGGTCAGGTTTTTCTTCTT-3’(如SEQ ID NO.19所示)；
Lv-F032-R：5’-AATCCCTCTGGCCTTATAGGAAT-3’(如SEQ ID NO.20所示)；
针对位点Lv-F047：
Lv-F047-F：5’-AATTGTAGGGAATTGGATAGGGA-3’(如SEQ ID NO.21所示)；
Lv-F047-R：5’-CAGAATTAGGAGTGATAATACCCCA-3’(如SEQ ID NO.22所示)；
针对位点Lv-F056：
Lv-F056-F：5’-GTGTGTATTCCATGTTGCGTATG-3’(如SEQ ID NO.23所示)；
Lv-F056-R：5’-CGATGAAAAACCATTGATTTAGG-3’(如SEQ ID NO.24所示)。
所述的特异性引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
所述的荧光基团优选为FAM、HEX或TAMRA。
本发明的第三个目的是提供一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的针对位点Lv-F008的引物对Lv-F008-F/R、针对位点Lv-F010的引物对Lv-F010-F/R、针对位点Lv-F014的引物对Lv-F014-F/R、针对位点Lv-F016的引物对Lv-F016-F/R、针对位点Lv-F028的引物对Lv-F028-F/R、针对位点Lv-F032的引物对Lv-F032-F/R、针对位点Lv-F047的引物对Lv-F047-F/R和针对位点Lv-F056的引物对Lv-F056-F/R进行PCR扩增；
(3)、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
所述的步骤(2)中的PCR扩增，其反应体系优选为：25μL，包括：不含Mg2+的10×PCRbuffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，5U/μL高保真PCR酶0.2μL，10μM正向引物0.5μL，10μM反向引物0.5μL，25ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 18.3μL。
所述的步骤(2)中的PCR扩增，其反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，按上述的EST-SSR标记的特异性引物的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟；所述的EST-SSR标记的特异性引物的退火温度分别为：位点Lv-F008：55℃，位点Lv-F010：55℃，位点Lv-F014：55℃，位点Lv-F016：55℃，位点Lv-F028：61℃，位点Lv-F032：56℃，位点Lv-F047：55℃，位点Lv-F056：55℃。
为实现上述发明目的，本发明利用通过转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列，开发凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记，并提供多态性引物，建立凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记开发的技术体系，为凡纳滨对虾遗传关系分析及优良品种的选育提供有价值的分子标记。
本发明的技术方案：从转录组测序获得的凡纳滨对虾EST序列中通过BLAST比对筛选渗透压调节相关功能基因之外的其他功能基因的EST序列，并通过MISA软件进行微卫星位点查找，获得了56个含有微卫星的凡纳滨对虾功能基因的EST序列。采用Primer Premier5软件，针对筛选出的56个EST序列的72个SSR位点设计了72对引物，并利用这72对引物对凡纳滨对虾的基因组DNA进行PCR扩增，其中有30对引物稳定扩增出目的条带。利用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并使用GeneMapper 3.2软件判读等位基因片段的具体数值，最终确定了8个具有高度多态性的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记。
本发明获得的8个EST-SSR标记的等位基因数分别为4、3、5、6、5、7、3和10个，观测杂合度、期望杂合度和PIC值均大于0.5，说明这8个EST-SSR标记均具有高度多态性，可用于凡纳滨对虾种质资源的遗传结构和遗传多样性分析、分子指纹图谱构建和分子标记辅助育种。
附图说明：
图1是Lv-F008位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图2是Lv-F010位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图3是Lv-F014位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图4是Lv-F016位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图5是Lv-F028位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图6是Lv-F032位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图7是Lv-F047位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
图8是Lv-F056位点引物扩增24个凡纳滨对虾基因组DNA的SSR分型图，其中S1-24代表24个凡纳滨对虾样品。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。转录组测序由华大基因有限公司完成，其他测序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。
1、凡纳滨对虾转录组测序及序列比对
1.1转录组测序
分别取凡纳滨对虾肌肉、肝胰腺、鳃和肠组织，用RNAiso Plus(TaKaRa,Japan)提取总RNA，并用DNase I(TaKaRa)处理。采用NanoDropTM2000分光光度计(Thermo ScientificWaltham,MA,USA)测定RNA浓度，并用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,CA,USA)评价RNA的质量。将从4种不同组织样品中提取的RNA等量混合后，经mRNA富集、mRNA片段化、cDNA合成、末端修复、加“A”尾和测序接头连接等工序建立cDNA文库。采用IIIuminaHiSeq2000高通量测序平台对cDNA文库进行测序，采用seqClean和Lucy软件去掉接头序列及低质量序列，获得高质量的序列数据，并用Trinity法进行序列组装。
1.2 EST序列比对
通过NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对EST序列进行比对，确定每个EST序列隶属的基因名称。
2、凡纳滨对虾功能基因EST的筛选及微卫星位点查找
针对筛选出的渗透压调节相关功能基因之外的其他功能基因的EST序列，采用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行微卫星位点查找，获得56个含有微卫星的凡纳滨对虾功能基因EST序列。
3、凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记引物的设计
采用Primer Premier 5软件，针对筛选出的56个凡纳滨对虾功能基因EST序列的72个SSR位点进行SSR引物设计。引物设计的要求为：引物长度18-24bp，GC含量为40-60％，Tm值为50-62℃，上下游引物的Tm值之差不大于5，并尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配等；扩增产物长度为100-550bp。共设计和合成72对EST-SSR引物，引物序列见表1：
表1凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记引物特性表
(位点、对应基因、重复基序、引物序列、退火温度)
注：F表示正向引物，R表示反向引物
4、凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记引物的筛选及结果分析
4.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取
选取来自于广东深圳、珠海、湛江、徐闻和茂名等地24个养殖场的凡纳滨对虾24尾，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
4.2引物的初步筛选
从上述提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机抽取一份做模板，分别采用表1中的72对引物对该DNA进行PCR梯度扩增，反应体系25μL，包括：10×PCR buffer(without Mg2+)2.5μL、25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL、5U/μL高保真PCR酶( HS DNAPolymerase)0.2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、25ng/μL DNA模板0.5μL、无菌水18.3μL。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火(温度从48℃到64℃)30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳检测，显示有30对引物在特定退火温度下能稳定扩增出单一条带。分别对扩增产物进行测序，结果显示该30对引物均可扩增出目的条带，位点分别为：Lv-F001-Lv-F003、LvF006-Lv-F018、Lv-F020、Lv-F025-Lv-F028、Lv-F030、Lv-F032、Lv-F034、Lv-F041、Lv-F045-Lv-F047、Lv-F056和Lv-F065。
4.3多态性引物的筛选及结果分析
对步骤4.2初步筛选出的30对引物的正向引物的5’端分别用FAM、HEX或TAMRA进行荧光标记，以步骤4.1提取的24个凡纳滨对虾基因组DNA为模板，分别用步骤4.2初步筛选出的30对引物(正反向引物序列见表1，正向引物的5’端标记有荧光基团)进行PCR扩增。反应体系同步骤4.2所述，反应程序除退火温度外均与步骤4.2中所述一致，各引物对对应的退火温度详见表1。PCR扩增产物先用2％琼脂糖电泳进行检测，后采用3730XL测序仪进行分型，并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值，确定了8个具有多态性的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记(见图1～8)，位点分别为：Lv-F008(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)、Lv-F010(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、Lv-F014(其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)、Lv-F016(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、Lv-F028(其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)、Lv-F032(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、Lv-F047(其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)和Lv-F056(其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。
采用Popgene 32软件计算期望杂合度和观察杂合度，使用PIC Calc 0.6软件计算多态性信息含量(polymorphic information content,PIC)。结果表明：上述8个多态性微卫星标记的等位基因数分别为4、3、5、6、5、7、3和10个；观测杂合度分别为0.6800、0.7500、0.6853、0.8067、0.7332、0.8191、0.7500和0.8661；期望杂合度分别为0.5417、0.6782、0.6250、0.7917、0.7500、0.7917、0.6800和0.6667；PIC值分别为0.5997、0.5899、0.6071、0.7572、0.6727、0.7731、0.5917和0.8300(表2)，均大于0.5，说明这8个EST-SSR标记均具有高度多态性，可用于凡纳滨对虾种质资源的遗传结构和遗传多样性分析、分子指纹图谱构建和分子标记辅助育种。
表2凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记特性表
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法
<160> 24
<210> 1
<211> 158
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 1
tcagccctta tagatttaaa agaaaatatt tataagttgg actcaaataa agaatttaaa 60
aaaatcaact ctggtgtgtg tgtgtgcaac attgtgtgat ttaactttct tttgatactg 120
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<210> 2
<211> 154
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 2
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tgcgtctgcg cctctgctgc ggctgtgtac tcggcggcgg cggcggcggc gtgagaggct 120
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<400> 5
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<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
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tatatatata ataacactca ttcctataag gccagaggga tt 102
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tacagttatc atcattattt tcaatatatt atttttttat tacaattatt tttactgcct 120
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gaaaaaaaga aatgaaaata tatatatata ttttttttca ttattaaaaa ttctcctaaa 120
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cttgttgctt gattccactt ttt 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 15
tatgaaaagg ttagagcgag tgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 16
ccaaacacgt ttatccacac ata 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 17
accaaggact tcttcggtga g 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 18
atacccgaat ggaaaaagaa gaa 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 19
atggaggtca ggtttttctt ctt 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 20
aatccctctg gccttatagg aat 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 21
aattgtaggg aattggatag gga 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 22
cagaattagg agtgataata cccca 25
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 23
gtgtgtattc catgttgcgt atg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）
<400> 24
cgatgaaaaa ccattgattt agg 23

Claims (7)

1.一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记，其特征在于，所述的EST-SSR标记编号分别为Lv-F008、Lv-F010、Lv-F014、Lv-F016、Lv-F028、Lv-F032、Lv-F047和Lv-F056；
所述的Lv-F008的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的Lv-F010的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的Lv-F014的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的Lv-F016的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的Lv-F028的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的Lv-F032的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的Lv-F047的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的Lv-F056的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种权利要求1所述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的特异性引物，其特征在于：所述的EST-SSR标记的特异性引物如下所示：
针对位点Lv-F008：
Lv-F008-F：5’-TCAGCCCTTATAGATTTAAAAGAAAA-3’；
Lv-F008-R：5’-TTAATATAAAATCCCGGCCAAAC-3’；
针对位点Lv-F010：
Lv-F010-F：5’-TTTAAATATGGCTTCCTCCTTGG-3’；
Lv-F010-R：5’-ACAGCTACGGCTCGTTACCTAGA-3’；
针对位点Lv-F014：
Lv-F014-F：5’-GGGAGAGAATCTAGCTTGTGATG-3’；
Lv-F014-R：5’-CTTGTTGCTTGATTCCACTTTTT-3’；
针对位点Lv-F016：
Lv-F016-F：5’-TATGAAAAGGTTAGAGCGAGTGG-3’；
Lv-F016-R：5’-CCAAACACGTTTATCCACACATA-3’；
针对位点Lv-F028：
Lv-F028-F：5’-ACCAAGGACTTCTTCGGTGAG-3’；
Lv-F028-R：5’-ATACCCGAATGGAAAAAGAAGAA-3’；
针对位点Lv-F032：
Lv-F032-F：5’-ATGGAGGTCAGGTTTTTCTTCTT-3’；
Lv-F032-R：5’-AATCCCTCTGGCCTTATAGGAAT-3’；
针对位点Lv-F047：
Lv-F047-F：5’-AATTGTAGGGAATTGGATAGGGA-3’；
Lv-F047-R：5’-CAGAATTAGGAGTGATAATACCCCA-3’；
针对位点Lv-F056：
Lv-F056-F：5’-GTGTGTATTCCATGTTGCGTATG-3’；
Lv-F056-R：5’-CGATGAAAAACCATTGATTTAGG-3’。
3.根据权利要求2所述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
4.根据权利要求3所述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的特异性引物，其特征在于，所述的荧光基团为FAM、HEX或TAMRA。
5.一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用权利要求3所述的针对位点Lv-F008的引物对Lv-F008-F/R、针对位点Lv-F010的引物对Lv-F010-F/R、针对位点Lv-F014的引物对Lv-F014-F/R、针对位点Lv-F016的引物对Lv-F016-F/R、针对位点Lv-F028的引物对Lv-F028-F/R、针对位点Lv-F032的引物对Lv-F032-F/R、针对位点Lv-F047的引物对Lv-F047-F/R和针对位点Lv-F056的引物对Lv-F056-F/R进行PCR扩增；
(3)、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
6.根据权利要求5所述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的PCR扩增，其反应体系为：25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，5U/μL高保真PCR酶0.2μL，10μM正向引物0.5μL，10μM反向引物0.5μL，25ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 18.3μL。
7.根据权利要求5或6所述的凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，按权利要求3所述的EST-SSR标记的特异性引物的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟；所述的EST-SSR标记的特异性引物的退火温度分别为：位点Lv-F008：55℃，位点Lv-F010：55℃，位点Lv-F014：55℃，位点Lv-F016：55℃，位点Lv-F028：61℃，位点Lv-F032：56℃，位点Lv-F047：55℃，位点Lv-F056：55℃。
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