CN110819720B - 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法 - Google Patents

一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110819720B
CN110819720B CN201910892376.0A CN201910892376A CN110819720B CN 110819720 B CN110819720 B CN 110819720B CN 201910892376 A CN201910892376 A CN 201910892376A CN 110819720 B CN110819720 B CN 110819720B
Authority
CN
China
Prior art keywords
population
lateolabrax japonicus
indel
primer
molecular marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910892376.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110819720A (zh
Inventor
徐鹏
吕红皂
陈葆华
濮菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen University
Original Assignee
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University filed Critical Xiamen University
Priority to CN201910892376.0A priority Critical patent/CN110819720B/zh
Publication of CN110819720A publication Critical patent/CN110819720A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110819720B publication Critical patent/CN110819720B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，涉及利用分子标记种质鉴定领域。基于南北方不同种群花鲈高通量重测序数据，结合Samtools、GATK等基因分型软件分析得到全基因组InDel位点分型信息，从中挑选南北方群体具有完全不同的等位基因的两个InDel位点，根据InDel位点设计筛选两对PCR引物，通过PCR引物目的条带差异可快速准确判断待鉴定花鲈属于哪一个群体，其核苷酸序列为SEQ ID No:1‑6所示。整个鉴定过程仅需0.5～1个工作日。对南北方花鲈群体进行种质鉴定可有效进行种质资源评估，减少苗种混杂的盲目性，为花鲈在遗传育种、分子和生物信息学方面研究等奠定基础。

Description

一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法
技术领域
本发明属于利用分子标记种质鉴定领域，具体是涉及一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法。
背景技术
花鲈(Lateolabraxmaculatus)隶属于鲈形目(Perciformes)花鲈科(Lateolabracidae)花鲈属(Lateolabrax)，是一种典型的广温性近岸海洋鱼类。近十年来，我国花鲈养殖产业发展迅速，在我国以广东、福建和山东三省养殖产量最高。作为我国主要本土海水鱼类之一，中国花鲈群体在黄渤海、东海、南海等区域均有分布，分布范围广，地理纬度跨度大，分布范围内海洋环境差异显著，不同地理种群的遗传结构和性状均存在鲜明差异。高纬度地区的黄渤海花鲈种群的生长速度显著高于低纬度的南海北部、东海南部地区的花鲈种群，种质资源和遗传资源极其丰富。其中北部湾-南海北部和渤海-黄海北部两个南北方种群的花鲈地理位置相隔较远，是两个极端分化的种群，两个种群之间由一系列中间种群相连。种群遗传学分析显示，两个种群存在显著的遗传分化差异。因此，开发两个极端分化种群的分子鉴定标记，有助于花鲈种质资源的快速鉴别。
由于南北方花鲈群体花鲈种质资源检定还很匮乏，仅仅从外形特征很难辨别，而目前南北方花鲈群体利用分子生物学的分子标记进行种质鉴定的方法还没有得到开发。
种质资源鉴定方法有很多，如形态特征鉴定法、孢粉超微结构鉴定法、同工酶分析法、分子标记技术等。分子标记技术以其快速准确、多态性高、直接以DNA形式表现、不受外界环境及组织类别和发育时期的影响等优越性成为目前最受青睐的鉴定方法。随着测序技术和生物信息学的发展，全基因组重测序使我们能够在全基因组尺度更加准确的找到两个不同种群的InDel标记。InDel标记作为近年新兴的一种分子生物技术，为锚定标记，无重复序列，稳定性强，准确性高，适用性广。
发明内容
本发明的目的是为了更好保护南北方花鲈群体优良生长性状和快速进行种质资源鉴定，提供利用两对InDel引物对南北方花鲈群体进行种质鉴定的一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法。
所述快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法采用InDel分子标记或两对PCR引物。所述InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；具有所述InDel分子标记缺失片段的纯合基因型对应的是南方(北部湾-南海北部)花鲈群体，没有缺失片段的纯合基因型对应的是北方(渤海-黄海北部)花鲈群体。所述两对PCR引物，其核苷酸序列为SEQ ID No:3至SEQ ID No:6所示。
所述用于鉴定南北方花鲈种群的InDel分子标记可由以下方法获得：从南方、北方分别采集花鲈，剪去肌肉组织，使用酚氯仿法提取DNA，随后使用IlluminaHiseq 2000平台进行高通量从重测序，每个体测序深度10～12X；利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因组，使用GATK、picard、samtools等软件进行基因分型，查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点；随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的的Fst(Fixation Index，固定指数)值，选取两个Fst＝1的插入缺失位点。
所述两对PCR引物根据InDel位点设计筛选，通过PCR引物目的条带差异可快速准确判断待鉴定的花鲈群体，一对引物为A51，另一对引物为B46，它们的正反向引物序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。
所述快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA；
2)利用南北方花鲈基因组InDel差异，合成特定引物；
3)以待鉴定的中国花鲈种质基因组DNA为模版，利用所合成的特定引物进行PCR扩增；
4)使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证；
5)根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体。
在步骤1)中，所述提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA的具体步骤可为：
从南北方花鲈种群采样地分别采集野生花鲈各至少20尾，剪去肌肉组织，使用酚氯仿法提取DNA。
在步骤2)中，所述利用南北方花鲈基因组InDel差异，合成特定引物的具体方法可为：
根据南北方花鲈基因组的InDel差异，北方花鲈群体存在InDel位点，而南方花鲈群体缺失此InDel位点，因此在北方花鲈基因组染色体上的两个InDel位点的两端分别设计引物，其中北方花鲈群体的基因组DNA扩增产物的片段长度会比南方花鲈群体多出InDel位点的碱基数，使用引物设计软件Primer5分别生成两对引物，一对引物为A51，另一对引物为B46，它们的正反向引物序列分别如SEQ ID NO:3-6所示；
A51引物核酸碱基序列：
上游引物F:GGACACCCTCAAAACTCT
下游引物R:CTTTGTCAGGTCATACGG
B46引物核酸碱基序列：
上游引物F:GTTCAATGGGTCTTCACG
下游引物R:GTTCAATGGGTCTTCACG
将合成的引物用双蒸水稀释为10μM，-20℃保存备用。
在步骤3)中，所述以待鉴定的中国花鲈种质基因组DNA为模版，利用所合成的特定引物进行PCR扩增的具体步骤可为：以待测中国花鲈的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-6所示的特定引物进行PCR扩增，进行PCR扩增反应；反应体系为25μL PCR反应体系：ddH2O17.8μL,10×Buffer 2μL,10mmolL-1dNTP 2μL,0.2μL Taq酶，10μmolL-1F、R引物各1μL，模版DNA 1μL；PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模版DNA充分变性，然后进入下列温度循环；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
在步骤4)中，所述使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证的具体方法可为：制作2％的琼脂糖凝胶，使用50bp的DNA ladder marker，130V电压进行电泳，检测PCR是否成功扩增。
在步骤5)中，所述根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体的具体方法可为：根据凝胶成像中的DNA片段模式，分析判断出待鉴别的花鲈所属哪一群体，若引物A51的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp，则判断该条花鲈属于北方种群花鲈；若引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp，则判断该条花鲈属于南方种群花鲈；若扩增的目的条带不是以上两种情况，则判定待测花鲈为具有杂合基因型的南北中间群体花鲈。
本发明利用加GoldView核酸染料的2％琼脂糖凝胶电泳检测南北方各若干样本的花鲈(以不少于各20尾为宜)PCR扩增产物(上样量为5μL)，结合目的条带对电泳结果进行判定，北方花鲈种群目的条带一致(约168bp和185bp条带)，南方花鲈种群目的条带一致(约117bp和139bp)。该实验结果证明，用于鉴定南北方花鲈种群的两对InDel分子标记引物的准确和高效性。
本发明还提供所述InDel分子标记，或SEQ ID NO:3-6所示引物在花鲈分子标记辅助育种中的应用。
利用本发明的中国花鲈分子标记检测引物，根据PCR扩增产物电泳图即可判断南北方花鲈种群，可直接用于后续的中国花鲈种质资源鉴定。
与现有技术相比，本发明具有下列突出的优点及有益效果：
(1)本发明首次利用全基因组重测序技术定位了南北方花鲈种群InDel差异位点，并基于差异位点开发南北方花鲈种群鉴定的InDel分子标记。
(2)利用本发明分子标记检测引物扩增得到的PCR产物，用2％琼脂糖胶即可检测条带多态性，无需额外的限制性内切酶酶切或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作。所述InDel分子标记为共显性标记，具有扩增稳定、准确率高、检测方便、快速等优点。
(3)应用本发明的分子标记可以快速鉴定南北方花鲈种群，是一种方便高效的种质鉴定方法，可以有效地进行种质资源评估，减少苗种混杂的盲目性，为花鲈在遗传育种、分子和生物信息学方面研究等奠定基础。
(4)本发明鉴定成本低、操作简单、结果快速可靠、实用性强，在基因组中分布均匀。
附图说明
图1为南方(铁山港、防城港、海康港)和北方(天津、烟台、文登)花鲈种群采样地理分布图。(YT：烟台；WD：文登；TJ：天津；FCG：防城港；HK：海康；TSG：铁山港)
图2为本发明实施例中使用引物A51对烟台站点花鲈种群和防城港站点花鲈种群验证的电泳图。
图3为本发明实施例中使用引物A51对文登站点花鲈种群和海康站点花鲈种群验证的电泳图。
图4为本发明实施例中使用引物A51对天津站点花鲈种群和铁山港站点花鲈种群验证的电泳图。
图5为本发明实施例中使用引物B46对烟台站点花鲈种群和防城港站点花鲈种群验证的电泳图。
图6为本发明实施例中使用引物B46对文登站点花鲈种群和海康站点花鲈种群验证的电泳图。
图7为本发明实施例中使用引物B46对天津站点花鲈种群和铁山港站点花鲈种群验证的电泳图。
在图2～7中，各标记为，M：50bp DNA Marker；Y：烟台；W：文登；T：天津；F：防城港；H：海康；S：铁山港。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
一种快速鉴定南北方花鲈群体InDel分子标记方法实施例，所述两个InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
从南方(北部湾-南海北部)采集野生花鲈33尾(铁山港、防城港、海康港各11尾)，北方(渤海湾及黄海北部)采集花鲈33尾(天津、烟台、文登各11尾)。剪去肌肉组织，使用酚氯仿法提取DNA。随后使用IlluminaHiseq 2000平台进行高通量从重测序，每个体测序深度10～12X。利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因组，使用GATK、picard、samtools等软件进行基因分型，查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点。随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的的Fst(Fixation Index，固定指数)值，选取了两个Fst＝1的插入缺失位点，分别位于花鲈6号和21号染色体上。
具有所述InDel分子标记缺失片段的纯合基因型对应的是南方(北部湾-南海北部)花鲈群体，没有缺失插入片段的纯合基因型对应的是北方(渤海-黄海北部)花鲈群体，杂合基因型对应的为南北中间群体花鲈。
根据两个InDel位点设计筛选两对PCR引物，通过PCR引物目的条带差异也可快速准确判断待鉴定的花鲈群体，其核苷酸序列为SEQ ID No:3至SEQ ID No:6所示。
所述分子标记，所述引物可在南北方花鲈群体鉴定中的应用。
所述应用，包括以下步骤：
1)待鉴定中国花鲈种质基因组DNA提取；
(1)采集南方(北部湾-南海北部)野生花鲈33尾(铁山港、防城港、海康港各11尾)，北方(渤海-黄海北部)采集花鲈33尾(天津、烟台、文登各11尾)。
(2)将剪取的2mm正方形大小的花鲈鳍条剪碎放入1.5mL无菌离心管中，加入500μL裂解缓冲液(TE)于离心管中(10mM Tris—HCL,pH8.0,10mMEDTA pH8.0)，加入10％的SDS50μL，在加入20μL的蛋白酶K(20mg/mL)，混匀55℃水浴3～6h(期间将管子颠倒混匀几次)。
(3)裂解后，加入600μL的酚︰氯仿︰异戊醇，其体积比为25︰24︰1，混匀15min后，12000r/min，离心15min。
(4)吸上清，约500μL，转入新的1.5mL离心管，加入500μL氯仿︰异戊醇，其体积比为24︰1，混匀15min后，12000r/min，离心10min。
(5)吸上清，约350μL，转入新的1.5mL离心管中，1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置2h。
(6)12000r/min，离心15min，弃上清。
(7)加入75％乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。
(8)加入50μL ddH20和0.5μL的RNA酶溶解，即为DNA。
2)利用南北方花鲈基因组InDel差异，合成特定引物；
根据两个InDel位点设计筛选两对PCR引物，特异性引物A51、B46详细信息如表1。
表1特异性引物信息
Figure BDA0002209167780000061
3)以待鉴定的中国花鲈种质基因组DNA为模版，利用特定的引物进行PCR扩增；
①25μL PCR反应体系：ddH2O 17.8μL,10×Buffer 2μL,10mmolL-1dNTP 2μL,0.2μLTaq酶，10umolL-1F、R引物各1μL，模版DNA 1μL。
②PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模版DNA充分变性，然后进入下列温度循环；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
4)使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证；
制作2％的琼脂糖凝胶，使用50bp的DNA ladder marker，130V电压进行电泳，检测PCR是否成功扩增。
5)根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体。
根据凝胶成像中的DNA片段模式，分析判断出待鉴别的花鲈所属哪一群体。如果引物A51的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp，则判断该条花鲈属于北方种群花鲈；如果引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp，则判断该条花鲈属于南方种群花鲈。
以下给出具体实施例。
实施例1花鲈基因组DNA提取
如图1，提取从北部湾-南海北部采集到的33尾野生花鲈(铁山港、防城港、海康港各11尾)，渤海-黄海北部采集到的33尾野生花鲈(天津、烟台、文登各11尾)的DNA。将剪取的2mm正方形大小的花鲈鳍条剪碎放入1.5mL无菌离心管中，加入500μL裂解缓冲液(TE)于离心管中(10mM Tris—HCL,pH8.0,10mMEDTA pH8.0)，加入10％的SDS 50μL，在加入20μL的蛋白酶K(20mg/mL)，混匀55℃水浴3～6h(期间将管子颠倒混匀几次)。裂解后，加入600μL的酚︰氯仿︰异戊醇，其体积比为25︰24︰1，混匀15min后，12000r/min，离心15min。吸上清，约500μL，转入新的1.5mL离心管，加入500μL氯仿︰异戊醇，其体积比为24︰1，混匀15min后，12000r/min，离心10min。吸上清，约350μL，转入新的1.5mL离心管中，1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置2h。12000r/min，离心15min，弃上清。加入75％乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。加入50μL ddH20和0.5μL的RNA酶溶解，即为DNA。
实施例2南北方花鲈种群InDel标记引物的设计
本发明所描述的InDel分子标记是从北部湾-南海北部采集野生花鲈33尾(铁山港、防城港、海康港各11尾)，渤海湾及黄海北部采集花鲈33尾(天津、烟台、文登各11尾)高通量重测序数据信息，使用GATK、picard、samtools等软件进行基因分型，查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点。随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的的Fst(Fixation Index，固定指数)值，获得了两个Fst＝1的InDel位点，分别位于花鲈6号和21号染色体上。使用Primer软件分别在两个InDel位点附近设计引物，通过引物筛选得到了A51和B46两对引物。根据本发明提供的两对引物，通过花鲈DNA的提取和普通PCR反应即可鉴定南北方花鲈种群。
实施例3InDel引物的PCR扩增
利用SEQ ID NO:3-6所示的A51和B46两对引物，分别进行PCR扩增反应，具体的反应体系为25μL PCR反应体系：ddH2O 17.8μL,10×Buffer 2μL,10mmolL-1dNTP 2μL,0.2μLTaq酶，10umolL-1F、R引物各1μL，模版DNA 1μL；PCR热循环程序:94℃预变性5min，使模版DNA充分变性，然后进入下列温度循环；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，重复35个热循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
实施例4琼脂糖凝胶电泳检测
制作2％的琼脂糖凝胶，使用50bp的DNA ladder marker，130V电压进行电泳(上样量为5μL)。扩增产物：如果引物A51的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp，则判断该条花鲈属于北方种群花鲈；如果引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp，则判断该条花鲈属于南方种群花鲈。
使用本发明的两对InDel标记引物对北部湾-南海北部采集到的33尾野生花鲈(铁山港、防城港、海康港各11尾)，渤海湾及黄海北部采集到的33尾花鲈(天津、烟台、文登各11尾)进行群体验证，PCR电泳结果如图2～7。结果显示，天津、烟台、文登站点花鲈种群PCR扩增后，引物A51的目的片段均为168bp且引物B46的目的片段均为185bp，均为北方花鲈种群；铁山港、防城港、海康港站点花鲈种群PCR扩增后，引物A51的目的片段均为117bp且引物B46的目的片段均为139bp，均为南方花鲈种群。通过以上的鉴定也进一步验证的本发明的InDel分子标记的准确和高效性。
本发明公开两对用于快速鉴定南北方花鲈群体的PCR引物。本发明基于南北方不同种群花鲈高通量重测序数据，结合Samtools、GATK等基因分型软件分析得到了全基因组InDel位点分型信息。从中挑选了南北方群体具有完全不同的等位基因的两个InDel位点。根据InDel位点设计筛选了两对PCR引物，通过PCR引物目的条带差异可快速准确判断待鉴定花鲈属于哪一个群体，其核苷酸序列为SEQ ID No:1至SEQ ID No:6所示。本发明通过简单的实验操作和分析即可对北方(渤海-黄海北部)花鲈群体和南方(北部湾-南海北部)花鲈群体进行种质鉴定，整个过程仅需0.5～1个工作日即可。对南北方花鲈群体进行种质鉴定可以有效的进行种质资源评估，减少苗种混杂的盲目性，为花鲈在遗传育种、分子和生物信息学方面研究等奠定基础。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 1
caatttaaaa tggcagtggc agcataagtg ttgtataaac acattttatt a 51
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 2
acatgtccac atccgtgcac atattttaat ctcactcatg tactct 46
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 3
ggacaccctc aaaactct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 4
ctttgtcagg tcatacgg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 5
gttcaatggg tcttcacg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 6
gttcaatggg tcttcacg 18

Claims (8)

1.用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记，其特征在于所述InDel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记，其特征在于所述InDel分子标记由以下方法获得：从南方、北方分别采集花鲈，剪去肌肉组织，使用酚氯仿法提取DNA，随后使用IlluminaHiseq 2000平台进行高通量从重测序，每个体测序深度10～12X；利用BWA将测序数据比对至花鲈参考基因组，使用GATK、picard、samtools软件进行基因分型，查找全基因组内的插入缺失位点及SNP位点；随后使用plink计算插入缺失位点在两个群体内的Fst值，选取两个Fst=1的插入缺失位点。
3.一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA；
2）利用南北方花鲈基因组InDel差异，合成特定引物，具体方法为：
根据南北方花鲈基因组的InDel差异，北方花鲈群体存在InDel位点，而南方花鲈群体缺失此InDel位点，因此在北方花鲈基因组染色体上的两个InDel位点的两端分别设计引物，其中北方花鲈群体的基因组DNA扩增产物的片段长度会比南方花鲈群体多出InDel位点的碱基数，使用引物设计软件Primer5分别生成两对引物，一对引物为A51，另一对引物为B46，它们的正反向引物序列分别如SEQ ID NO:3-6所示；
A51引物核酸碱基序列：
上游引物F:GGACACCCTCAAAACTCT
下游引物R:CTTTGTCAGGTCATACGG
B46引物核酸碱基序列：
上游引物F:GTTCAATGGGTCTTCACG
下游引物R:GTTCAATGGGTCTTCACG
将合成的引物用双蒸水稀释为10μM，-20℃保存备用；
3）以待鉴定的中国花鲈种质基因组DNA为模版，利用所合成的特定引物进行PCR扩增，具体步骤为：以待测中国花鲈的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-6所示的特定引物进行PCR扩增，进行PCR扩增反应；反应体系为25μL PCR反应体系：ddH2O 17.8μL, 10×Buffer2μL, 10 mmolL-1 dNTP 2μL, 0.2μL Taq酶，10 μmolL-1 F、R引物各1μL，模版DNA 1μL；PCR热循环程序：94℃预变性5min，使模版DNA充分变性，然后进入下列温度循环；94℃变性1min，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，重复35个热循环；72℃延伸10min，最后4℃保存；
4）使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证；
5）根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体。
4.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，其特征在于在步骤1）中，所述提取待鉴定的中国花鲈基因组DNA的具体步骤为：
从南北方花鲈种群采样地分别采集野生花鲈各至少20尾，剪去肌肉组织，使用酚氯仿法提取DNA。
5.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，其特征在于在步骤4）中，所述使用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行验证的具体方法为：制作2%的琼脂糖凝胶，使用50bp的DNA ladder marker，130V电压进行电泳，检测PCR是否成功扩增。
6.如权利要求3所述一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法，其特征在于在步骤5）中，所述根据目的条带差异判断待鉴定的花鲈属于哪一群体的具体方法为：根据凝胶成像中的DNA片段模式，分析判断出待鉴别的花鲈所属哪一群体，若引物A51的目的片段为168bp且引物B46的目的片段为185bp，则判断该条花鲈属于北方种群花鲈；若引物A51的目的片段为117bp且引物B46的目的片段为139bp，则判断该条花鲈属于南方种群花鲈；若扩增的目的条带不是以上两种情况，则判定待测花鲈为具有杂合基因型的南北中间群体花鲈。
7.权利要求1所述的用于快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记在花鲈分子标记辅助育种中的应用。
8.用于鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记的引物在花鲈分子标记辅助育种中的应用，所述InDel分子标记的引物序列如SEQ ID NO：3-6所示。
CN201910892376.0A 2019-09-20 2019-09-20 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法 Active CN110819720B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910892376.0A CN110819720B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910892376.0A CN110819720B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110819720A CN110819720A (zh) 2020-02-21
CN110819720B true CN110819720B (zh) 2021-04-27

Family

ID=69548127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910892376.0A Active CN110819720B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110819720B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265470B (zh) * 2021-05-09 2022-03-15 湖州师范学院 一种与中国花鲈抗逆性相关的snp位点及其应用
CN114774561A (zh) * 2022-05-26 2022-07-22 中国海洋大学 atp1b1b基因在海淡水养殖花鲈鉴定中的应用及应用方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104073486B (zh) * 2014-06-23 2016-06-08 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种与大口黑鲈快速生长相关的snp位点及其鉴定方法和应用
CN105695572B (zh) * 2016-02-02 2021-02-23 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种基于Indel和SSR位点技术大批量且高效开发分子标记的方法
CN106086191B (zh) * 2016-06-24 2019-12-17 中国水产科学研究院 用于海南鲤种质鉴定的sine介导的indel标记
CN106191246B (zh) * 2016-07-12 2019-12-31 集美大学 一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110819720A (zh) 2020-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109468405B (zh) 基于转录组测序开发的云锦杜鹃ssr引物对及筛选方法与应用
CN105274094B (zh) Snp标记及其应用
CN110819720B (zh) 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法
JP6193593B2 (ja) ブリ類の性識別方法
CN101818195B (zh) 猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状的遗传标记及应用
CN112126692B (zh) 用于鉴别梅花鹿屋久岛亚种的分子标记、鉴别方法及应用
CN102146460A (zh) 一种凡纳滨对虾LvE165微卫星DNA标记的检测方法
CN110343767A (zh) 凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物及其在遗传多样性分析中的应用
CN113801959B (zh) 浙江楠核基因组ssr分子标记的多态性引物及其应用
CN113684301B (zh) 鉴定杏果皮毛性状的snp标记、引物及应用
CN107475414B (zh) 一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法
CN111073983B (zh) 与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的snp标记及其应用
CN116751868B (zh) 与地方鸡产蛋性状相关的snp标记及其检测方法与应用
Lyu et al. TEAseq-based identification of 35,696 Dissociation insertional mutations facilitates functional genomic studies in maize
CN109234412A (zh) 快速检测生长速度快的翘嘴红鲌的方法及所用的分子标记
CN113373241B (zh) 一种荷马条鳅属鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用
CN103605913A (zh) 一种适用于太平洋牡蛎家系鉴定的方法
CN104073562B (zh) 一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记
CN107365873A (zh) 与谷子叶鞘色性状连锁的分子标记及其应用
KR101508689B1 (ko) 중국젓새우의 원산지 판별 마커
CN108570509B (zh) 一种脊尾白虾ec16 snp标记的检测方法
CN113322328A (zh) 一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的snp分子标记及其应用
CN111540408A (zh) 一种全基因组多态性ssr分子标记的筛选方法
CN106868186B (zh) 安吉小鲵微卫星标记及其应用
CN116103413B (zh) 与地方鸡产蛋性状相关的snp标记及其检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant