CN106086191B - 用于海南鲤种质鉴定的sine介导的indel标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲤鱼反转录转座子标记，包括鲤鱼反转录转座子序列的预测，鉴定；筛选并开发了以SINE元件介导的INDEL标记。本发明可应用于海南鲤的种质鉴定。

Description

用于海南鲤种质鉴定的SINE介导的INDEL标记
技术领域
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及评估海南鲤的种质鉴定的以SINE元件介导的INDEL标记。
背景技术
鲤鱼(Cyprinus Carpio)是我国最主要的淡水养殖品种之一，在我国培育有近千年的历史，通过多年的人工培育，已培育成多个品系，但是对不同品系的鲤鱼如何进行有效的种质区分，对于保护和鉴定鲤鱼种质资源是非常必要的。第四纪冰期冷暖交替后，我国形成了许多地理隔离的种群。海南岛是在第四纪时期，由于地壳断裂才与大陆分离形成了独立的半岛，半岛上的内陆湖泊河流与大陆板块的河流形成了地理隔离，独立进化。关于海南鲤鱼的种群研究，并未找到合适的分子标记，能够显示出岛内的鲤鱼地理种群是否独立进化成亚种。
SINE是一种段散在重复序列，是近年来新开发的短分子标记，因在基因组中广泛分布，鉴定效率高等优点而被广泛使用。SINE能用作种质鉴定研究的标记，是因为它们不可逆的插入到基因的新位置，并且这个过程是随机独立发生的。因为目前还没有固定的SINE座位丢失掉(被剪除)的报道，并且两个基因组中两个SINE精确的插入到基因组的同一个座位或者从同一座位被移除掉的可能性极小，因此，两个不同物种基因组中共有同一个SINE座位可以作为一种单向的标记，它可以用来定义一个支系或者单系类群。根据共同离征，共有或者起源性状来构建系统发育关系。目前，SINE技术仅在植物中常见，但在鱼类中研究很少。目前能够用于快速检测鲤鱼种质特异性的引物较少，常用的微卫星和AFLP存在着特异性标记少，而SNP标记则存在检测麻烦等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：开发鲤鱼SINE标记，提供种质特异性引物，建立鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的开发体系，为鲤鱼的遗传背景分析提供更多新的分子标记，提高种质资源鉴定的效率。
本发明所要解决技术问题的技术方案：通过454高通量测序仪对鲤鱼所获得的序列，进行长片段拼接，利用生物信息学的方法鉴定SINE序列，筛选出以SINE元件介导的INDEL引物，并对鲤鱼的INDEL位点进行遗传多态性检测，开发出1个海南种质特异的以SINE元件介导的INDEL标记，SL1,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的SL1的引物序列为：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA
利用该引物扩增鲤鱼海南地里种群和我国其他水系，发现该标记在鲤鱼的海南地理种群为INDEL标记，而在其他水系的基因组中具有扩增稳定，标记特异性显著等优点，该标记能够对鲤鱼的海南地理种群的种质特异性进行有效评估，因此将该引物开发成试剂盒，用于检测鲤鱼的海南地理种群的的种质鉴定研究。
本申请涉及如下技术方案：
1.从鲤鱼基因组序列，挖掘鲤鱼反转录转座子SINE序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所述。
SEQ ID NO:1
AACGACGACACATGGACATCAAGGAACCATCTGCCTTTAAAGCACCATAATGTTTGGTTTATGCTTGACAGCTCACACAAACATGAGAGTGTGGATGAGCAGATGCACTTCTAAGCCGCAAGCTTTCAGAAGAACTAAAGCACGACGTTGTAAAAGCACTGTTGGATCTTCTGTTATTTGGTTGATCAGTTGTTTCTGTTATTAAACATCTTGCACTGTTATTATGTCTTGTTCCTGTGGCTCAGTGGTAGAGCATTGCATTAGCAGCGCAAAAGGTCATGGGTTCAATTCCCAGGGAACACACATACTGGTAAAAAAAAATGTGTAGCCTGAATGCACTGTAAGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCTGCTAAATGCATAAATGTAAATGTTATTAAAATTCGGTCTAATAATGGTTGCTAAATGTGAATTCAGGCATCACAACCTTAAAATGCACATTATTCATTTTGAGATAAGCTAAAGATTACATTTTAAAGTCTTACTAAATAATAAGTGTATTAAAGATTCTACATTTGGAAAAATCTAAATATGAAAATATAGGAAACAAGCACACAGTTACATATATCCAATACTGACCGACTGAAC
2.根据鲤鱼的SINE序列，开发反转录转座子SINE标记的引物SL1，其引物序列为：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
3.利用该引物扩增黑龙江鲤、长江鲤、海南鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤五种鲤，共130个DNA样本，该引物除了在海南鲤群体，没有阳性扩增外，在其他群体的603bp上均产生阳性扩增。
4.避开变异位点，重新设计引物，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样性。
附图说明
图1：5个地理种群的SL1-SINE介导的INDEL标记的遗传多样性电泳图。
左1：DL2000 Marker；左2-3：黑龙江鲤；4-5：长江鲤；6-7：海南鲤；8-9：月亮湖鲤；10-11：俄罗斯鲤。
图2:SL1-SINE序列在5个鲤鱼地理种群中所产生的6个单倍型序列。
具体实施方式
1鲤鱼SINE序列的获得
利用454高通量测序仪对鲤鱼基因组进行测序，获得0.01X覆盖，测序深度为1。
鲤鱼SINE序列的鉴定流程：
1从鲤鱼基因组中的片段序列中，鉴定转座子分类
利用Repeat masker软件的RepeatModeler(http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler.html)，进行denovo的重复序列鉴定，通过与斑马鱼基因组比对，挖掘鲤鱼基因组内的SINE元件。在基因组内部得到所有SINE序列，通过分类整理成不同的亚家族类别,针对不同亚家族内部拷贝序列进行分析,找寻SINE拷贝多，序列之间极度相似的分支群。对于候选的分支群,两端各延长600bp。
2基因组提取
利用QIAGEN基因组试剂盒提取黑龙江鲤(HLJ)、长江鲤(CJ)、海南鲤(HN)、月亮湖鲤(YLH)、俄罗斯鲤(RUS)的基因组DNA。除俄罗斯鲤仅收集到10份样品外，其余每个地理种群各采样30尾，共130个样品。
3多态性引物设计
SINE引物从SIEN保守区域设计P1：
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
4 REMAP分子标记PCR反应技术体系的建立
利用得到的引物进行PCR扩增。扩增反应体系为25uL：基因组DNA40ng,2.5mmol/LMgCl2 1.5uL,dNTps2.0 uL，10XBuffer2.5 uL，TaqDNA聚合酶1.5U，10umol/L SL1-F引物1.0uL，10umol/L SL1-R引物1.0uL，加ddH2O至25uL。反应程序：4℃预变性4min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用3％Q琼脂糖凝胶分离。
5 INDEL引物检测
该引物在黑龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤和俄罗斯鲤鲤鱼基因组中只有唯一扩增清楚的扩增产物，扩增片段为603bp，但在海南鲤无扩增产物，图1。
6 INDEL位点确认及其序列遗传多样性分析
改变引物位置，重新设计引物T1，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样性。
T1-F:AACGACGACACATGGACATCAA；
T1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
该序列在50个个体成功扩增出并进行测序，为603bp，经多重序列比对分析表明，共有68个变异位点，其中含有简约信息位点55个，变异率为11.03％。平均碱基含量分别为：T 29.4％，C 17.4％，A 34.3％，G 19.0％。在5个群体中，共发现6个单倍型(表1，SEQ2)，黑龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤共享4个，海南鲤有2个特有单倍型。所有样本间平均序列分歧距离Da为0.1282。5个地理种群的遗传多样性和遗传距离见表2和表3。
表1单倍型在5个地理种群中的分布
表2 5个地理种群鲤鱼的遗传距离
表3 SINE序列的遗传参数.N:群体数量；n:单倍型数量；π:核酸多态性；h^单倍型多样性。
本发明开发出了一段特异序列能够鉴定海南鲤的种质特异性，且该发明将该特异序列转化为这个特异等位基因，降低了检测难度，减少了检测成本，为鲤鱼的种质鉴定的工厂化奠定了研究基础。

Claims (4)

1.鲤鱼反转录转座子SINE标记，其特征在于：所述的SINE标记CS1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所述。
2.权利要求1所述的鲤鱼反转录转座子SINE标记的引物，其特征在于：其为
SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC
SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
3.一种试剂盒，其包含权利要求2所述的引物。
4.权利要求1所述的标记或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在区分海南鲤的种质特异性方面的用途。
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