CN104498488B - 一种评估鲤鱼种群遗传多样性的remap标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲤鱼反转录转座子标记，包括鲤鱼反转录转座子序列的预测，鉴定；筛选鲤鱼多态性REMAP标记，以及对鲤鱼反转录转座子位点进行遗传多态性检测，开发了鲤鱼一个多态性丰富的反转录转座子REMAP标记。本发明可应用于鲤鱼种群的种群遗传结构和遗传变异水平等研究以及鲤鱼地理种群的种质鉴定。

Description

一种评估鲤鱼种群遗传多样性的REMAP标记
技术领域
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及评估在鲤鱼地理种群遗传多样性和种质鉴定的REMAP多态性标记。
背景技术
鲤鱼(Cyprinus Carpio)是我国最主要的淡水养殖品种之一，根据FAO2010报道，鲤鱼的总产量占全世界鱼肉产量的10％。由于鲤鱼广泛分布于我国各大水系，加之人工选择育种的原因，鲤鱼的一些优良品种经历瓶颈效应后，遗传多样性急剧下降，因此保护和鉴定鲤鱼种质资源是非常必要的。
REMAP技术是近年来新开发的多态性分子标记，因在基因组中广泛分布，多态性高，鉴定效率高等优点而被广泛使用。目前，REMAP技术仅在植物中常见，但在鱼类中研究很少。REMAP是由Kalendar等(1999)首次提出和建立，其原理是根据逆转座子的LTR保守序列和微卫星重复序列设计两个引物，从而扩增出逆转座子与最邻近的微卫星间的片段，REMAP检测的是基因组内逆转座子与相邻微卫星DNA之间的长度多态性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：开发鲤鱼REMAP标记，提供多态性引物，建立鲤鱼REMAP技术的开发体系，为鲤鱼的遗传背景分析提供更多新的分子标记，提高种质资源鉴定的效率。
本发明所要解决技术问题的技术方案：通过454高通量测序仪对鲤鱼所获得的序列，进行长片段拼接，利用生物信息学的方法鉴定长片段反转录转座子序列，筛选出含有长末端重复序列的反转录转座子(LTR)多态性引物，并对鲤鱼的LTR位点进行遗传多态性检测，开发出1个多态性丰富的LTR REMAP标记，CL1,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
鲤鱼LTR的REMAP标记的CL1的引物序列为：
CL1-F:GCTACTTTATTAGACCAGA
CL1-R:TGTGTGTGTGTGCG。
利用该引物扩增不同地理种群的鲤，发现该标记在鲤鱼多个地理种群的基因组中具有拷贝数高，多态性丰富，扩增稳定等优点，能够对鲤鱼种群的遗传多样性进行有效评估，因此将该引物开发成试剂盒，用于检测鲤鱼种群的遗传多样性和种质鉴定研究。
本申请以鲤中具有代表性的松荷鲤，荷包红鲤，镜鲤，兴国红鲤，黑龙江鲤，黄河鲤和建鲤7个地理种群为例进行说明。涉及如下技术方案：
1.鲤鱼反转录转座子REMAP标记，其特征在于：所述的REMAP标记CL1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
2.权利要求1所述的鲤鱼反转录转座子REMAP标记的引物，其特征在于：其为CL1-F:GCTACTTTATTAGACCAGA；CL1-R:TGTGTGTGTGTGCG。3.一种试剂盒，其包含权利要求2所述的引物。
4、权利要求1所述的标记或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在区分鲤不同地理种群的种质特异性方面的用途。
5、如权利要求4所述的用途，不同地理种群的种质分别为：松荷鲤，荷包红鲤，镜鲤，兴国红鲤，锦鲤，黄河鲤和建鲤。
6、一种鉴定鲤不同地理种群的种质特异性的方法，其特征在于，通过权利要求2所述引物扩增7个地理群体的DNA样本，在每个群体中产生了9-14个清晰可辨的多态性位点，鉴定结果为：松荷鲤在1200bp，475bp和455bp出现特异等位基因，荷包红鲤在495bp和475bp出现特异等位基因；镜鲤是基因组纯度较高的地理种群，800bp，830bp，470bp，330bp，310bp和300bp等位基因在镜鲤种群中出现缺失；兴国红鲤在540bp出现特异等位基因；黑龙江鲤在310bp，330bp和340bp出现特异等位基因；黄河鲤在1200bp出现特异位点且380-500bp区间由于等位基因缺失，所形成特异区域；建鲤在505和495bp出现特异等位基因。
附图说明
图1：7个地理种群的REMAP标记的遗传多样性电泳图。左1：DL2000Marker；左2-4：松荷鲤；5-7：荷包红鲤；8-10：镜鲤；11-13：兴国红鲤；14-16：黑龙江鲤；17-19：黄河鲤；20-22：建鲤。箭头所示为每个种群的特异位点。
具体实施方式
1.鲤鱼基因组序列的获得
利用454高通量测序仪对鲤鱼基因组进行测序，获得0.01X覆盖，测序深度为1。
2.鲤鱼LTR序列的鉴定流程
从鲤鱼基因组中的片段序列中，鉴定转座子分类：
利用Repeat masker软件的RepeatModeler(http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler.html)，进行denovo的重复序列鉴定；
鉴定含有反转录转座子的序列：
利用blastn确认TE中含有转运相关的蛋白：将这些序列与斑马鱼的反转录转座子的氨基酸序列进行blastx比对(http://www.repeatmasker.org/RepeatProteinMask.html#database)。将所有含有转运相关的编码蛋白，按长度进行排序；
鉴定全长反转录转座子序列：
利用软件LTR FINDER扫描候选序列，挑选具有完好的TSD、PBS、PPT，以及在编码功能域的部分不包含相位移位和编码终止子的序列。
3.基于REMAP技术，LTR多态性标记的开发：
利用REMAP技术建立鲤鱼LTR多态性分子标记的体系
3.1基因组提取
利用QIAGEN基因组试剂盒提取鲤鱼松荷鲤，荷包红鲤，镜鲤，兴国红鲤，黑龙江鲤，黄河鲤和建鲤7个地理种群的基因组DNA。每个地理种群各采样50尾，共350个样品；
3.2多态性引物设计
REMAP中的逆转座子引物从逆转座子LTR保守区域设计P1：GCTACTTTATTAGACCAG，而选择性添加的引物则为SSR引物P2：TGTGTGTGTGTGCG；
3.3REMAP分子标记PCR反应技术体系的建立
利用3.2得到的引物进行PCR扩增。扩增反应体系为25uL：基因组DNA40ng，2.5mmol/LMgCl2 1.5uL，dNTps2.0uL，10XBuffer2.5uL，TaqDNA聚合酶1.5U，10umol/L P1引物1.0uL，10umol/L P2引物1.0uL，加ddH2O至25uL。反应程序：4℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min30s，共36个循环；72℃延伸10min。PCR产物用8％聚丙烯胺凝胶分离，片段长度分析软件Gelpro根据Marker DL2000确定。
3.4多态性引物检测
利用软件Genepop3.4检测该位点的哈迪-温伯格平衡(HWE)，软件popgene3.0检测该LTR位点的等位基因数目，遗传多样性(Nei’s gene diversity(1973))和Shannon’s遗传多样性指数(Shannon’s information index)。结果表明：在鲤7个地理种群中，共获得多态性位点21个，遗传多样性为0.2774，Shannon’s遗传多样性指数为0.3372。如图1和表1所示。
该LTR序列在种间存在较强的多态性，在种内出现较强的保守性。松荷鲤在1200bp，475bp和455bp出现特异等位基因，荷包红鲤在495bp和475bp出现特异等位基因；镜鲤是基因组纯度较高的地理种群，800bp，830bp，470bp，330bp，310bp和300bp等位基因在镜鲤种群中出现缺失；兴国红鲤在540bp出现特异等位基因；黑龙江鲤在310bp，330bp和340bp出现特异等位基因；黄河鲤在1200bp出现特异位点且380-500bp区间由于等位基因缺失，所形成特异区域；建鲤在505和495bp出现特异等位基因，这些特异的等位基因为鲤鱼品种的种质鉴定提供了高效的工具。
表1 7个鲤鱼地理种群的REMAP标记的遗传多样性统计表

Claims (4)

1.鲤鱼反转录转座子REMAP标记引物对，其特征在于，所述引物对为：CL1-F:GCTACTTTATTAGACCAGA；CL1-R:TGTGTGTGTGTGCG。
2.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对。
3.权利要求1所述的REMAP标记引物对或权利要求2所述的试剂盒在区分鲤不同地理种群的种质特异性方面的用途。
4.如权利要求3所述的用途，不同地理种群的种质分别为：松荷鲤，荷包红鲤，镜鲤，兴国红鲤，锦鲤，黄河鲤和建鲤。
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