CN108315438B - 用于龟纹瓢虫多样性分析的ssr引物及应用 - Google Patents
用于龟纹瓢虫多样性分析的ssr引物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一套用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物，所述SSR引物选自以下19对引物pro444、pro524、pro3422、pro4078、pro3621、pro3595、pro6393、pro8136‑3、pro8823、pro1546、pro1582、pro5238、pro1517、pro1600、pro523、pro322‑2、pro3848、pro5087和pro8461中的至少一个。本发明还提供所述SSR引物在龟纹瓢虫遗传多样性、遗传结构及谱系地理格局分析中的应用。本发明提供的SSR引物具有特异性强、扩增结果稳定、各位点间不存在连锁不平衡现象、多态性高等特征，这些分子标记可应用于龟纹瓢虫种群遗传、系统进化、基因定位、分子鉴定等相关领域。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物及应用。
背景技术
微卫星DNA(SSR)，即简单序列重复，在整个基因组中分布广泛。同一类型的微卫星序列由于重复次数或重复程度的差异，从而在每个座位上产生多态性。由于微卫星序列的两端具有高的保守性，使特异性引物的设计变得非常方便。该分子标记由于具有高的多态信息含量，呈共显性遗传，可用于种群历史的重现等特性，使其广泛在种群遗传多样性、遗传结构及谱系地理格局研究中应用。
龟纹瓢虫Propylea japonica(Thunberg)属于半翅目瓢虫科(Coleoptera：Coccinellidae)，是一种在我国分布较广的捕食性天敌昆虫，因其具有较强的耐饥饿、抗高温和干旱的能力，同时对田间害虫，例如棉蚜、桃蚜、叶螨等昆虫种类具有较好的防控作用，目前已经成为农业生产中非常具有应用前景的天敌种类之一。现阶段通过对龟纹瓢虫进行田间保护和释放以实现“以虫治虫”的防治方法已经在生物防治过程中发挥了较重要的作用。
关于该种类前期生物学方面的研究主要集中于生物学特性、生态学特性、生物防治、人工饲料饲养等方面，分子方面近年来集中于转录组、功能基因的表达及验证、杀虫剂抗性基因筛选等方面；而关于遗传多样性分析、种群遗传结构研究、相关引物筛选等方面的研究相对较少，因此本发明致力于筛选出扩增效果好、特异性强、扩增特征稳定、多态性好的微卫星引物，为上述遗传研究提供一定的方法基础，从而为尽快的了解和认识龟纹瓢虫种质资源现状，明确有效种群大小，以及龟纹瓢虫的有效保护和合理利用提供重要的分子生物学基础。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物及应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物，所述SSR引物选自pro444、pro524、pro3422、pro4078、pro3621、pro3595、pro6393、pro8136-3、pro8823、pro1546、pro1582、pro5238、pro1517、pro1600、pro523、pro322-2、pro3848、pro5087和pro8461中的至少一个；各SSR引物的信息如表1所示：
表1
本发明还提供用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物组合，所述SSR引物组合包括表1中所述的19对SSR引物。
本发明还提供含有表1所述SSR引物或其引物组合的检测试剂或试剂盒。
本发明还提供所述SSR引物单独或组合使用在龟纹瓢虫遗传多样性分析中的应用。包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，利用表1所述SSR引物进行PCR反应；
3)分析PCR扩增产物。
优选地，PCR扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板1-2μL，无菌水补足至25μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，51-58℃退火1min(每对SSR引物的退火温度分别见表1)，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
前述的应用，在进行PCR扩增前，还包括用不同的荧光基团对各SSR引物的正向引物5′端进行荧光标记的步骤。所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX中的至少一种。
本发明还提供所述19对SSR引物组合在构建龟纹瓢虫SSR指纹图谱中的应用。
本发明还提供所述SSR引物单独或组合使用在龟纹瓢虫种群遗传结构分析及谱系地理格局分析中的用途，具体步骤如下：
(a)样品基因组DNA的提取；
(b)表1中19对引物的筛选与合成，先采用大量常规的龟纹瓢虫微卫星引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳的初步筛选，鉴定出扩增效果稳定的引物；对于扩增效果好且稳定的引物，通过在正向引物5’端进行荧光标记的修饰，获得带有荧光标记的引物组；
(c)以步骤(a)中的DNA样品为模板，利用步骤(b)中合成的19对带有荧光标记的引物对PCR分子标记进行检测；
(d)对PCR产物中的带有荧光标记的DNA片段进行等位基因分型及多态性检测；
(e)对种群遗传结构进行分析。
种群遗传结构分析中，分析方法优选用PopGene软件对基因分型结果进行种群遗传多样性分析，相关参数的计算等，例如等位基因数、观测杂合度、期望杂合度等的计算。
在本发明的一个具体实施方式中，利用所述19对SSR引物分析了来自于我国河南、河北、山东省不同地区的龟纹瓢虫5个种群，包括：山东聊城市阳谷县、山东德州市夏津县、河南周口市鹿邑、河北石家庄市赵县和河北黄骅市。分析结果表明，所述SSR引物能够很好地区分这5个地理种群。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物具有特异性强、扩增结果稳定、各位点间不存在连锁不平衡现象、多态性高等特征，这些分子标记可应用于种群遗传、系统进化、基因定位、分子鉴定等相关领域的研究中。
附图说明
图1为本发明实施例3中引物pro523、pro5238、pro3848、pro3595和pro322-2的特异性检测结果。
图2为本发明实施例3中引物pro6393、pro8136-3、pro8461、pro8823、pro1546、pro1582和pro444的特异性检测结果。
图3为本发明实施例3中中引物pro524、pro4078、pro5087、pro1517、pro3422、pro3621和pro1600的特异性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 19对核心SSR引物的获得
根据已测得的龟纹瓢虫基因组初步组装数据，利用MicroSAtellite软件工具鉴定出大量SSRs重复序列，从中筛选出多态性性较好，特异性强的微卫星引物共19对。引物序列见SEQ ID NO:1-38。
实施例2应用SSR引物对龟纹瓢虫5个地理种群遗传结构的分析方法
(1)基因组DNA的提取
2017年6月在河南、河北、山东三省的农作物生长地区采集龟纹瓢虫。而后带回室内，每个种群选取相应标本用于DNA的提取。5个种群包括：山东聊城市阳谷县(LC，20头)、山东德州市夏津县(DZ，20头)、河南周口市鹿邑(ZK，20头)、河北石家庄市赵县(SJZ，20头)和河北黄骅市(HH，16头)。本实施例共成功提取96头标本的DNA样品，并应用于后续遗传结构的分析。
(2)微卫星引物在龟纹瓢虫群体中的扩增
利用19对微卫星引物对步骤(1)中的DNA样品进行扩增。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，51-58℃退火1min(每对SSR引物的退火温度分别见表1)，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增体系包括：25μL的PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板1-2μL，无菌水补足至25μL。
利用ABI3700测序仪测序，对扩增出带有荧光标记的DNA片段进行多态性的检测。应用GeneMarker软件读取等位基因片段的长度，判定某些位点的基因分型情况。采用PopGene软件对基因分型结果进行种群遗传多样性分析，相关参数的计算等，例如等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon多样性指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、平均杂合度Ave、种群内近交系数Fis等的计算。采用Arlequin软件计算在各个位点和各种群的近交系数。近交系数作为描述个体等位基因间血统关系的数量指标，能够客观的反映群体内个体间的相关性。近郊系数常用于推断种群内个体间的亲缘关系，为种群遗传多样性及杂合度评估提供参考。当Fis<0时，表明观测杂合度高于期望杂合度，表现为杂合度过剩；Fis>0则表明杂合度缺失。Genepop软件用于对各种群在各位点上的哈迪-温伯格平衡P值进行无偏估测，当P<0.05时，该种群即为偏离哈迪-温伯格平衡。
5个龟纹瓢虫种群19个微卫星位点的多态性检测结果见表2。
表2 5个龟纹瓢虫种群19个微卫星位点的多态性检测
注：Na：等位基因数；Ne：有效等位基因数；I：Shannon多样性指数；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；Ave：平均杂合度；Fis：种群内近交系数
表2结果显示，19对龟纹瓢虫的微卫星引物扩增共获得194个等位基因，等位基因数在3-31之间，平均等位基因数为12，其中pro5238获得31个等位基因数，等位基因数最多；pro524获得3个等位基因数，等位基因数最少。有效等位基因数在0.16-11.23之间，平均值为3.55。Shannon多样性指数在0.28-2.89之间，其中pro5238位点达到最大值2.89，最小值为pro5087位点。观测杂合度Ho值在0.00-1.00之间，平均为0.46。期望杂合度He值在0.48-1.72之间，平均为0.69。平均杂合度值Ave位于0.45-0.88之间，平均值为0.64，最大值0.88来自pro5238。种群内近交系数Fis在-0.69-1.00之间，其中位点pro524种群内的近交程度最高其近交系数达到1.00。总体而言，5个种群在各位点都显示出足够的多态性，有很好的应用价值。
利用Genepop软件中的马尔科夫链法计算19个微卫星位点在各种群内的哈迪-温伯格平衡，同时采用显著水平检验各位点是否符合哈迪-温伯格平衡，检测结果见表3。从表3能够看出：5个种群中在位点pro3621、pro3595、pro8823、pro5238、pro3848、pro8461上均显示极显著的偏离哈迪-温伯格平衡。5个种群在位点pro524、pro6393、pro1582、pro1600上显示显著或极显著的偏离哈迪-温伯格平衡；5个种群在位点pro444、pro1546上均符合哈迪-温伯格平衡；在其余位点上部分种群显示偏离哈迪-温伯格平衡，部分种群显示符合哈迪-温伯格平衡。
表3龟纹瓢虫19个微卫星位点在各种群上的哈迪-温伯格平衡P值
注：种群代码，LC：山东聊城市阳谷县；DZ：山东德州市夏津县；ZK：河南周口市鹿邑；SJZ：河北石家庄市赵县；HH：河北黄骅市；*指显著偏离哈迪-温伯格平衡；**指极显著偏离哈迪-温伯格平衡
实施例3利用SSR引物检测龟纹瓢虫的特异性
1、样本来源：
本实施例中使用两种瓢虫，其中龟纹瓢虫来自山东聊城市阳谷县(LC，1头)、山东德州市夏津县(DZ，1头)和河南周口市鹿邑(ZK，1头)；异色瓢虫来自河南郑州(ZZ，6头)，这些标本保存于中国农业科学院棉花研究所郑州科研中心。
2、DNA提取：同实施例2所述。
3、PRC扩增：PCR反应体系和PCR扩增程序同实施例2所述。
4、结果分析：
取PCR扩增产物3μL，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为150V，25～30分钟后在紫外光下检测结果，如果出现引物的特征条带，则证明所检测样本为龟纹瓢虫。电泳检测结果如图1-3所示，泳道1-3为龟纹瓢虫样本，均能扩增出每对引物的特征条带；泳道4-9为异色瓢虫，异色瓢虫则均未出现条带。上述结果表明引物SEQ ID NO:1-38的特异性较强。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物及应用
<130> KHP181111376.9
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggttacgcca agatgtcaaa 20
Claims (8)
1.用于龟纹瓢虫多样性分析的SSR引物组合，其特征在于，所述SSR引物组合包括18对SSR引物，分别为pro444、pro524、pro3422、pro4078、pro3621、pro3595、pro6393、pro8136-3、pro8823、pro1546、pro1582、pro5238、pro1517、pro1600、pro523、pro322-2、pro5087和pro8461；各SSR引物的信息如下：
2.含有权利要求1所述SSR引物组合的检测试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述SSR引物组合在龟纹瓢虫遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取的DNA为模板，利用所述SSR引物组合进行PCR反应；
3)分析PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR扩增体系为：2×Taq PCRMaster Mix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板1-2μL，无菌水补足至25μL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，51-58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
7.根据权利要求5-6任一项所述的应用，其特征在于，进行PCR扩增前，还包括用不同的荧光基团对各SSR引物的正向引物5′端进行荧光标记的步骤。
8.权利要求1所述SSR引物组合在构建龟纹瓢虫SSR指纹图谱中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810252208.0A CN108315438B (zh) | 2018-03-26 | 2018-03-26 | 用于龟纹瓢虫多样性分析的ssr引物及应用 |
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| CN103667446A (zh) * | 2013-10-17 | 2014-03-26 | 中山大学 | 龟纹瓢虫的特异性分子标记dna序列、鉴别引物、鉴定方法及鉴定试剂盒 |
| CN105803103A (zh) * | 2016-05-23 | 2016-07-27 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉蚜微卫星标记组合及其引物和应用 |
-
2018
- 2018-03-26 CN CN201810252208.0A patent/CN108315438B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN103451185A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-18 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 龟纹瓢虫特异性coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANNE LOISEAU等."Isolation and characterization of microsatellites in the harlequin ladybird, Harmonia axyridis (Coleoptera, Coccinellidae), and cross‐species amplification within the family Coccinellidae".《MOLECULAR ECOLOGY RESOURCES》.2009,第934-937页. * |
| Xinhua Fu等."Long-read sequence assembly of the firefly Pyrocoelia pectoralis genome".《GigaScience》.2017,第1-7页. * |
| 徐青叶等."临安大明山异色瓢虫及龟纹瓢虫鞘翅色斑多样性分析".《杭州师范大学学报》.2014,(第2期),第159-163页. * |
Also Published As
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|---|---|
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