CN106282173B - 克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法。该方法包括：1)根据转基因生物中已知外源基因设计6条引物，按照在所述外源基因上的位置自5’到3’依次记为F1、R2、R3、AD、F2和F3；2)设计随机引物AP，所述AP为在AD的3’端添加如下结构的9‑11个随机核苷酸：自5’到3’为3个除N以外的简并核苷酸、2‑4个N、4个特定核苷酸(在受体生物的基因组序列中出现频率大于1/256的4个连续核苷酸或其反向互补序列)；3)以所述转基因生物基因组为模板，采用F1/AP进行PCR扩增，Exo I酶切扩增产物；以酶切产物为模板采用F2/R2进行PCR扩增；以扩增产物为模板，采用F3/R3进行PCR扩增获得所述侧翼序列。本发明为转基因植物的检测和安全评价提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法。
背景技术
分子生物学和基因工程技术的发展是20世纪生命科学中最伟大的事件。在农业领域中转基因作物(以下简称GMC)的研究和开发成为现代农业生物技术的代表，是迄今所有农业技术中发展最快的一种技术。全世界GMC的推广面积已经从1996年的170万公顷猛增至2013年的1.71亿公顷，增长了100多倍，种植GMC国家的数量亦从1996年的6个增加到2013年的28个。值得指出的是，在2010年，GMC 15年(1996-2010)累积种植面积首次超过10亿公顷，这一数字大体相当于美国(9.37亿公顷)或中国(9.56亿公顷)国土总面积的10％以上，这表明转基因作物保持着强有力的发展态势。
随着转基因技术的快速发展和转基因作物的广泛种植，如何高效扩增目标基因侧翼序列成为当前研究者广泛关注的课题，原因主要有两点：一是目标基因在植物基因组中的插入位点对基因的正常表达和稳定遗传有着重要影响，在目前的转基因植物安全评价过程中，要求提供目标基因在转化体基因组中插入位点的侧翼序列；二是转化事件特异性检测是目前转基因植物检测中常用的检测方法，转化事件特异性检测方法建立的前提是获得目标基因插入位点的侧翼序列。
目前，克隆目标基因侧翼序列的方法主要包括反向PCR、连接介导PCR、Tail-PCR、随机片段破碎基因组步移技术和环状接头PCR等方法。反向PCR、连接介导PCR和Tail-PCR建立于上世纪90年代，利用上述三种方法获得了不同转基因植物中目标基因的侧翼序列，如Mirjam等利用反向PCR的方法获得了转基因烟草中外源基因插入位点的侧翼序列(MirjamPD,Ben MM,Dekker et al.A quick method to estimate the T-DNA copy number intransgenic plants at an early stage after transformation using inversePCR.Plant Molecular Biology,1991,17:151-153)，李梅兰等通过Tail-PCR的方法获得了转基因蓝猪耳T-DNA的侧翼序列(李梅兰,侯雷平,李洪清,王小菁.应用Tail-PCR扩增转基因蓝猪耳T-DNA侧翼序列.应用与环境生物学报,2009,15(6):871-874)，张坤等利用连接介导PCR获得了马铃薯抗晚疫病基因两端的侧翼序列(张坤，徐建飞，段绍光，庞万福，卞春松，刘杰，金黎平.接头连接介导的PCR扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究.中国蔬菜,2013,16:29-34)。但上述三种方法的有其自身的缺点，限制了其应用。反向PCR和连接介导PCR依赖于限制性内切酶对植物基因组的酶切，对于基因组比较大、高级结构复杂或无参考基因组的植物来说，利用反向PCR和连接介导PCR扩增目标基因侧翼序列的成功率低。Tail-PCR由于使用随机引物，经常会造成非特异性扩增，而且重复率低。为了克服上述缺点，研究者们建立了随机片段破碎基因组步移技术和环状接头PCR技术。随机片段破碎基因组步移技术采用物理机械法对植物基因组进行随机破碎，片段化的基因组经3’端加A修饰并与5’定向接头连接后，通过PCR扩增即可获得已知片段的侧翼序列，利用此方法获得了转基因玉米LY038中目标基因的侧翼序列(商颖.随机片段破碎基因组歩移技术.农业生物技术学报,2013,21(12):1433)。环状接头PCR是通过将普通连接介导PCR方法与人造载体PCR相结合，设计出一种茎环状的引物，通过在已知序列及接头上设计引物与巢式引物，最终得到需要的未知序列。如程国灵等利用环状接头PCR的方法获得了四种转基因植物LY038、DAS-59122-7、3272和MON89788的侧翼序列(Trinh Q,Shi H,Xu W,Hao J,Luo Y,Huang K.Loop-linker PCR:An advanced PCR technique for genome walking.IUBMB life,2012,64(10):841-845)。但上述两种方法的应用范围还有待进一步研究。
综上所述，虽然已有多种克隆目标基因侧翼序列的方法，但它们各有千秋，需要继续探索建立克隆侧翼序列的新方法，为转基因植物的检测和安全评价提供技术支撑。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不同于现有技术的克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法。
本发明所提供的克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法，包括：
(1)根据转基因生物中已知的外源基因片段序列设计6条引物，分别记为F1、F2、F3、AD、R2、R3；所述6条引物位于所述转基因生物的基因组双链DNA分子的同一条链(记为A链)上，另一条链记为B链；所述6条引物在所述A链上的位置自5’端到3’端依次为所述F1、所述R2、所述R3、所述AD、所述F2和所述F3。
所述F1、所述F2、所述R2和所述F3的长度均为25-30bp；所述AD的长度为12-18bp。
所述6条引物均位于所述已知的外源基因片段上，且自所述外源基因片段的5’端到3’端依次为所述F1、所述R2、所述R3、所述AD、所述F2和所述F3。
(2)根据受体生物的基因组序列特点设计若干条(如3-8条，直至扩增到侧翼序列)随机引物，记为AP(如设计3条随机引物，可分别记为AP1、AP2和AP3)，所述AP中的每一条都为在所述AD的3’端添加9-11个随机核苷酸(记为N9-11)(如10个随机核苷酸)后获得的引物。
所述受体生物与所述转基因生物相对应，是转入所述外源基因前的所述转基因生物对应的未转基因个体。
所述9-11个随机核苷酸的结构自5’端到3’端依次为：3个除N以外的简并核苷酸、2-4个N、4个特定核苷酸；所述4个特定核苷酸为在所述受体生物的基因组序列中出现频率大于1/256的4个连续核苷酸或所述4个连续核苷酸的反向互补序列。其中，N为A或T或C或G。
其中，所述“在所述受体生物的基因组序列中出现频率大于1/256的4个连续核苷酸”为在所述受体生物的基因组序列中出现频率相对比较高的4个连续核苷酸(是根据所述受体生物基因组序列中4bp重复序列的多现性而设计的)。
(3)以所述转基因生物的基因组DNA作为模板，采用所述AP中的任一条和所述F1进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR产物。
其中，所述转基因生物的基因组DNA的提取方法包含但不局限于目前常用的基因组DNA提取方法，如CTAB法、试剂盒法等，保证最终DNA浓度为100ng/μl，OD260/280大于0.8。
在该轮PCR扩增中，所述AP中的所述N9-11与所述A链结合，沿着所述AP的3’端方向延伸，直到所述A链上F1的5’末端对应的位置；所述AP中的所述AD与所述B链退火结合；所述F1与所述B链结合，沿着所述F1的3’端方向延伸，当遇到与所述B链结合的所述AD时，与所述AD的5’末端相连，这样就会产生一个锅柄状结构，锅柄处为F1-AD间的双链结构，外部序列为包含已知序列和侧翼序列的B链序列(参见图1)。
(4)用核酸外切酶I(Exo I)酶切所述第一轮PCR产物，得到酶切产物。
第一轮PCR结束后，利用核酸外切酶I(Exo I)的3’-5’单链外切酶活性，将所述第一轮PCR产物中的单链引物寡核苷酸降解，避免以后的非特异性扩增的产生。
(5)以所述酶切产物为模板，采用所述F2和所述R2进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR产物。
在该轮PCR扩增中，开始的变性步骤会使锅柄处双链DNA产物解链，形成一个5’端带有F1-AD已知序列，以及3’端带有“F1-F3已知序列的反向互补序列”的单链线性DNA分子。然后，首先是所述F2与所述单链线性DNA分子的3’端结合，沿着所述F2的3’端方向延伸，直到所述单链线性DNA分子的5’末端对应的位置，得到F2扩增产物(双链DNA分子)；接着是以所述F2扩增产物为模板，以所述F2和所述R2分别作为上下游引物进行常规PCR扩增，最终获得第二轮PCR产物(参见图1)。
(6)以所述第二轮PCR产物为模板，采用所述F3和所述R3进行第三轮PCR扩增，得到第三轮PCR产物(常规PCR扩增)。
所述第三轮PCR产物中，所述AD所在链上位于所述AD的3’端外向3’端方向延伸的序列即为所述转基因生物中外源基因整合位点处的侧翼序列的反向互补序列。
在所述方法的步骤(1)中，所述F1和所述AD间的基因序列的GC含量在40-70％之间，退火温度在80-85℃。
在所述方法的步骤(1)中，所述F1、所述R2、所述R3、所述F2和所述F3的GC含量均≤60％，退火温度在55-65℃之间。
在所述方法的步骤(1)中，所述AD的退火温度在35-45℃。
成对引物间(F1和AP，F2和R2，F3和R3)和引物自身不能形成过多的引物二聚体和发卡结构。
其中，所述F1、所述R2、所述R3、所述AD、所述F2和所述F3彼此之间没有严格要求，所述F2和所述F3最好不要有交叉。
在所述方法的步骤(3)中，进行所述第一轮PCR扩增的反应条件可为：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，F1引物的退火温度-5℃1分钟，72℃2分钟)；94℃30秒，25℃3分钟，72℃1-3分钟；8个循环(每个循环如下：94℃30秒，F1引物退火温度-5℃40秒，72℃1-2分钟，94℃30秒，引物退火温度-5℃40秒，72℃1-2分钟，94℃30秒，45℃40秒，72℃2分钟)。
在所述得到的步骤(4)中，所述“利用核酸外切酶Exo I的3’-5’单链外切酶活性，将所述第一轮PCR产物中的单链引物寡核苷酸降解”的具体反应条件为：37℃反应1.5-2小时，80℃反应20-30分钟。
在所述方法的步骤(5)中，进行所述第二轮PCR扩增的反应条件可为：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，引物退火温度℃(指引物对中退火温度较低的引物对应的退火温度)1分钟，72℃2分钟)；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，引物退火温度-5℃(指引物对中退火温度较低的引物对应的退火温度-5℃)1分钟，72℃2分钟)。
在所述得到的步骤(5)中，进行所述第三轮PCR扩增的反应条件可为：94℃4分钟；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，引物退火温度-5℃(指引物对中退火温度较低的引物对应的退火温度-5℃)1分钟，72℃2分钟)
在所述方法中，所述生物可为基因组序列已知的植物、动物或微生物。在本发明中，所述生物为植物，具体为水稻或棉花。
在本发明的第一个实施例中，所述生物具体为水稻，所述AP中所述4个特定核苷酸自5’端到3’端为GTTA、TCAG或CTAG，相应的，所述AP中的所述9-11个核苷酸自5’端到3’端为VBBNNNGTTA、DVHNNNTCAG或DVBNNNCTAG。在本发明的第二个实施例中，所述生物具体为棉花，所述AP中所述4个特定核苷酸自5’端到3’端为CCTG、TGGA或CAGT，相应的，所述AP中的所述9-11个核苷酸自5’端到3’端为DBHNNNCCTG、VDDNNNTGGA或BDVNNNCAGT。
其中，N为A或G或C或T；V为A或G或C；B为G或C或T；D为A或G或T；H为A或C或T。
本发明与现有侧翼序列克隆方法相比，具有如下优点：一是随机引物的设计有效结合了嵌套PCR和兼并PCR引物的设计的特点，同时考虑生物(如植物)基因组DNA中4bp重复序列的多现性，避免了传统随机引物扩增的非特异性。二是利用了核酸外切酶I(Exo I)的3’-5’单链外切酶活性，从含双链末端产物的反应混合液中降解单链引物寡核苷酸，保证特异片段的高效扩增。本发明有望为转基因植物安全评价和特异性检测过程中所需外源基因侧翼序列的克隆提供新途径。
保藏说明
分类命名：陆地棉
拉丁名：(Gossypium hirsutum)
参椐的生物材料：BG2-7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年3月19日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10412
附图说明
图1为本发明侧翼序列克隆原理图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pMD19-T载体为北京六合通经贸有限公司产品，产品目录号为D102A。
2×EasyTaq PCR SuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品，产品目录号为AS111-01。
核酸外切酶I(Exonuclease I，Exo I)是单链特异性3'-5'核酸外切酶，从ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-单核苷酸，不分解双链DNA和RNA。
实施例1、转基因水稻En-12中外源基因侧翼序列的克隆
一、转基因水稻En-12的获得
转基因水稻En-12：参见“靳茜博士论文：利用基因拆分技术限控转基因飘流的研究，中国农业科学院，2012”一文。
二、引物设计
根据水稻转化时所用植物表达载体中的已知序列设计如下引物：
上游引物F1：5’-gattcccaatacgaggtcgcca-3’；
AD：5’-tgtatggagcagcaga-3’；
上游引物F2：5’-atgatgcagcttgggcgcag-3’；
下游引物R2：5’-cgaggtcgccaacatcttcttct-3’；
上游引物F3：5’-gtttctccataataatgtgtgagtagttccc-3’；
下游引物R3：5’-gccgtggttggcttgtatggag-3’；
随机引物AP1：5’-tgtatggagcagcagaVBBNNNGTTA-3’；
随机引物AP2：5’-tgtatggagcagcagaDVHNNNTCAG-3’；
随机引物AP3：5’-tgtatggagcagcagaDVBNNNCTAG-3’。
上述引物中，D＝A/G/T；V＝A/C/G；B＝C/G/T；H＝A/C/T；N＝A/T/C/G。其中“/”表示“或”。
F1和AP1、F1和AP2、F1和AP3、F2和R2、F3和R3为成对引物，上述F1、R2、R3、AD、F2和F3在已知基因序列(潮霉素标记基因HYG(R)和CaMV35S polyA)上的位置顺序从5’到3’方向依次为F1、R2、R3、AD、F2和F3。
设计上述引物时需符合以下设计要求：
1)F1和AD引物间基因序列的GC含量在40-70％之间，基因序列的退火温度在80-85℃；
2)F1、F2、R2、F3、R3引物的长度在25-30bp，GC含量≤60％，退火温度在55-65℃之间；
3)AD引物长度12-18bp左右，退火温度在35-45℃之间；
4)成对引物间和引物自身不能形成过多的引物二聚体和发卡结构。
5)随机引物AP1-AP3的长度在21-29bp，结构上为在AD引物的3’端添加9-11个随机碱基。3条随机引物AP1-AP3的基本结构为5’-AD-3个除N以外的简并核苷酸-2～4个N-4个特定核苷酸-3’，其中5’-4个特定核苷酸-3’序列为在水稻基因组中出现频率大于1/256的4个连续的核苷酸序列或其反向互补序列。
三、转基因水稻En-12的基因组DNA提取
采用常规方法提取步骤一得到的转基因水稻En-12的叶片的基因组DNA，并用水稀释至终浓度为100ng/μl，OD260/280在1.8-2.0之间。
四、转基因水稻En-12的侧翼序列的克隆
本发明侧翼序列克隆原理图如图1所示。
具体操作步骤如下：
(一)第一轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤三制备的基因组DNA 2.5μl，上游引物F1(浓度为100pM)1μl，随机引物(AP1、AP2和AP3其中一种)(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，57℃1分钟，72℃2分钟)；94℃30秒，25℃3分钟，72℃3分钟；8个循环(每个循环如下：94℃30秒，57℃40秒，72℃2分钟，94℃30秒，57℃40秒，72℃2分钟，94℃30秒，45℃40秒，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第一轮PCR扩增产物。
(二)核酸外切酶I(ExoI)处理
处理体系：在6μl第一轮PCR扩增产物中依次加入0.4μl核酸外切酶I(ExoI)、2μl反应缓冲液和2.8μl ddH2O。
处理条件为：37℃反应1.5小时，80℃反应20-30分钟。
酶切结束后，得到核酸外切酶I(ExoI)的酶切产物。
(三)第二轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤(二)的酶切产物2μl，上游引物F2(浓度为100pM)1μl，下游引物R2(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，63℃1分钟，72℃2分钟)；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，58℃1分钟，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第二轮PCR扩增产物。
(四)第三轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤(三)制备的第二轮PCR扩增产物2μl，上游引物F3(浓度为100pM)1μl，下游引物R2(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，56℃1分钟，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第三轮PCR扩增产物。
(五)测序获得侧翼序列
将步骤(四)第三轮PCR扩增产物进行电泳检测，回收600bp左右的DNA条带，并进行测序，测序结果如序列表中序列1所示。DNAman软件和Blastn分析发现获得的DNA片段自5’末端起第30-413位为水稻基因组序列，第414-629位为载体上已知序列。获得的未知序列与水稻第二染色体上32139249-32139632间的序列同源性为99％，说明外源基因插入到水稻基因组的第2号染色体的32139632位置。
比对结果证明，以上实验获得了转基因水稻En-12中外源基因在水稻基因组插入位点的侧翼序列。
对比例1、Genome Walking方法克隆转基因水稻En-12中外源基因侧翼序列
1、根据获得所述转基因水稻En-12的过程中，水稻转化时所用植物表达载体中的已知序列设计如下引物F1、F2和F3。所有引物由上海生物工程有限责任公司合成。引物用水溶解至终浓度为100μM。
F1：5’-gctccaacaatgtcctgacggacaatgg-3’；
F2：5’-ggattcccaatacgaggtcgccaacatc-3’；
F3：5’-ggtttccactatcggcgagtacttct-3’；
2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因水稻En-12叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。
3、根据Genome Walking Kit试剂盒(TaKaRa，北京，Code：D316)说明书，在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F1(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，植物基因组DNA2.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分钟，5个循环；94℃30秒，25℃3分钟，72℃3分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
4、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F2(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤3的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
5、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F3(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤4的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
6、步骤5的扩增产物进行电泳检测，回收大于已知片段的DNA条带。回收的DNA条带连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆进行测序，测序结果为序列表中序列3。
7、将获得的序列3在NCBI上与公布的水稻基因组进行Blast，结果发现获得的DNA序列的1-614bp在转化水稻所用载体的T-DNA区LB一侧，第619-1260bp与水稻第2染色体上32138987-32139632间的序列同源性为99％。比对结果证明获得了转基因水稻En-12中外源基因插入到水稻基因组中。
通过与实施例1得到的侧翼序列比较(即比对序列1和序列3)，发现实施例1所得的侧翼序列与本对比例的结果相符。但是，本对比例Genome Walking方法克隆已知序列的侧翼序列时，每次PCR反应都需要进行4组，即特异引物与所有兼并引物结合来进行扩增，增加了操作的难度和成本。而且寻找合适的限制性内切酶比较困难，对基因组进行酶切和连接时对基因组DNA的质量要求也比较高。试验经常会因所用内切酶不合适而得不到结果。而实施例1只需在第一次PCR扩增时用到兼并引物，其余PCR扩增均为常规特异性引物扩增，操作起来比较简单，而且不涉及酶切，对基因组DNA要求不高。因此，实施例1的方法与常用的Genome Walking方法相比具有操作简单、成本低和效率高的优势。
实施例2、转基因棉花BG2-7中外源基因侧翼序列的克隆
一、转基因棉花BG2-7的构建及鉴定
采用农杆菌介导法，将含有G2-aroA基因(ZL 03826892.2)的植物表达载体pG2导入受体材料珂312。
本发明的发明人将该BG2-7，株系于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，参椐的生物材料(株)为BG2-7，建议的分类命名为陆地棉(Gossypium hirsutum)，其保藏编号为CGMCC No.10412。
二、引物设计
根据棉花转化时所用植物表达载体中靠近T-DNA左边界的已知序列设计如下引物：
上游引物F1：5’-aacacggcggcatcagagca-3’；
AD：5’-cgaatagcctctccac-3’；
上游引物F2：5’-taccgaggggaatttatggaacg-3’；
上游引物F3：5’-gttgcggttctgtcagttccaa-3’；
下游引物R2：5’-gcatcagagcagccgattgtc-3’；
下游引物R3：5’-ccagtcatagccgaatagcctctc-3’；
随机引物AP1：5’-cgaatagcctctccacDBHNNNCCTG-3’；
随机引物AP2：5’-cgaatagcctctccacVDDNNNTGGA-3’；
随机引物AP3：5’-cgaatagcctctccacBDVNNNCAGT-3’。
上述引物中，D＝A/G/T；V＝A/C/G；B＝C/G/T；H＝A/C/T；N＝A/T/C/G。其中“/”表示“或”。
F1和AP1、F1和AP2、F1和AP3、F2和R2、F3和R3为成对引物，上述F1、R2、R3、AD、F2和F3在已知基因序列(卡那基因和nos启动子)上的位置顺序从5’到3’方向依次为F1、R2、R3、AD、F2和F3。
设计上述引物时需符合以下设计要求：
1)F1和AD引物间基因序列的GC含量在40-70％之间，基因序列的退火温度在80-85℃；
2)F1、F2、R2、F3、R3引物的长度在25-30bp，GC含量≤60％，退火温度在55-65℃之间；
3)AD引物长度12-18bp左右，退火温度在35-45℃之间；
4)成对引物间和引物自身不能形成过多的引物二聚体和发卡结构。
5)随机引物AP1-AP3的长度在21-29bp，结构上为在AD引物的3’端添加9-11个随机碱基。3条随机引物AP1-AP3的基本结构为5’-AD-3个除N以外的简并核苷酸-2～4个N-4个特定核苷酸-3’，其中5’-4个特定核苷酸-3’序列为在棉花基因组中出现频率大于1/256的4个连续的核苷酸序列或其反向互补序列。
三、转基因棉花BG2-7的基因组DNA提取
采用常规方法提取步骤一得到的转基因棉花BG2-7的叶片的基因组DNA，并用水稀释至终浓度为100ng/μl，OD260/280在1.8-2.0之间。
四、转基因棉花BG2-7的侧翼序列的克隆
本发明侧翼序列克隆原理图如图1所示。
具体操作步骤如下：
(一)第一轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤三制备的基因组DNA 2.5μl，上游引物F1(浓度为100pM)1μl，随机引物(AP1、AP2和AP3其中一种)(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，58℃1分钟，72℃2分钟)；94℃30秒，25℃3分钟，72℃3分钟；8个循环(每个循环如下：94℃30秒，58℃40秒，72℃2分钟，94℃30秒，58℃40秒，72℃2分钟，94℃30秒，45℃40秒，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第一轮PCR扩增产物。
(二)核酸外切酶I(ExoI)处理
处理体系：在6μl第一轮PCR扩增产物中依次加入0.4μl核酸外切酶I(ExoI)、2μl反应缓冲液和2.8μl ddH2O。
处理条件为：37℃反应1.5小时，80℃反应20-30分钟。
酶切结束后，得到核酸外切酶I(ExoI)的酶切产物。
(三)第二轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤(二)的核酸外切酶I(ExoI)处理后产物2μl，上游引物F2(浓度为100pM)1μl，下游引物R2(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；5个循环(每个循环如下：94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟)；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，60℃1分钟，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第二轮PCR扩增产物。
(四)第三轮PCR扩增
PCR反应体系：步骤(三)制备的第二轮PCR扩增产物2μl，上游引物F3(浓度为100pM)1μl，下游引物R3(浓度为100pM)2μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μl，最后加水至终体积为20μl。
PCR反应程序：94℃4分钟；25个循环(每个循环如下：94℃30秒，60℃1分钟，72℃2分钟)。
PCR反应结束后，得到第三轮PCR扩增产物。
(五)测序获得侧翼序列
将步骤(四)第三轮PCR扩增产物进行电泳检测，回收大约700bp的DNA条带。并进行测序，测序结果如序列表中序列2所示。通过DNAman软件和Phytozome软件分析，发现获得的DNA片段自5’末端起第28-282位棉花基因组序列，与棉花第11染色体上61253333-61253559间的序列同源性为98.7％，第283-743位为已知载体序列。上述结果说明外源基因在棉花的第11号染色体61253333位置中进行了插入。
比对结果证明，以上实验获得了转基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因组插入位点的侧翼序列。
对比例2、Genome Walking方法克隆转基因棉花BG2-7中外源基因侧翼序列
1、根据获得所述转基因棉花BG2-7的过程中，棉花转化时所用植物表达载体中的已知序列设计如下引物F1、F2和F3。所有引物由上海生物工程有限责任公司合成。引物用水溶解至终浓度为100μM。
F1：5’-aacacggcggcatcagagca-3’；
F2：5’-taccgaggggaatttatggaacg-3’；
F3：5’-gttgcggttctgtcagttccaa-3’；
2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCCNo.10412叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。
3、根据Genome Walking Kit试剂盒(TaKaRa，北京，Code：D316)说明书，在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F1(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，植物基因组DNA2.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分钟，5个循环；94℃30秒，25℃3分钟，72℃3分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
4、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F2(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤3的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
5、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F3(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤4的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA (5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。
6、步骤5的扩增产物进行电泳检测，回收大于已知片段的DNA条带。回收的DNA条带连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆进行测序，测序结果为序列表中序列4。
7、通过DNAman软件和Phytozome分析，发现获得的DNA序列(序列4)的1-734bp为棉花基因组序列，与棉花第11染色体上61253333-61253972间的序列同源性为94.2％，735-1138bp为已知转化载体上的DNA序列。比对结果证明获得了转基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因组插入位点的5’端侧翼序列。
通过与实施例2得到的侧翼序列比较(即比对序列2和序列4)，发现实施例1所得的侧翼序列与本对比例的结果相符，Genome Walking方法克隆已知序列的侧翼序列时，每次PCR反应都需要进行4组，即特异引物与所有兼并引物结合来进行扩增，增加了操作的难度和成本。而且寻找合适的限制性内切酶比较困难，对基因组进行酶切和连接时对基因组DNA的质量要求也比较高。试验经常会因所用内切酶不合适而得不到结果。实施例2只需在第一次PCR扩增时用到兼并引物，其余PCR扩增均为常规特异性引物扩增，操作起来比较简单，而且不涉及酶切，对基因组DNA要求不高。因此，实施例2与常用的Genome Walking方法相比具有操作简单、成本低和效率高的优势。
Claims (11)
1.一种克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法，包括：
（1）根据转基因生物中已知的外源基因片段序列设计6条引物，分别记为F1、F2、F3、AD、R2、R3；所述6条引物位于所述转基因生物的基因组双链DNA分子的同一条链上，记为A链；所述6条引物在所述A链上的位置自5’端到3’端依次为所述F1、所述R2、所述R3、所述AD、所述F2和所述F3；
所述F1、所述F2、所述R2和所述F3的长度均为25-30bp；所述AD的长度为12-18bp；
（2）根据受体生物的基因组序列特点设计若干条随机引物，记为AP，所述AP中的每一条都为在所述AD的3’端添加9-11个随机核苷酸后获得的引物；
所述9-11个随机核苷酸的结构自5’端到3’端依次为：3个除N以外的简并核苷酸、2-4个N、4个特定核苷酸；所述4个特定核苷酸为在所述受体生物的基因组序列中出现频率大于1/256的4个连续核苷酸或所述4个连续核苷酸的反向互补序列；
其中，N为A或T或C或G；
（3）以所述转基因生物的基因组DNA作为模板，采用所述AP中的任一条和所述F1进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR产物；
（4）用核酸外切酶I酶切所述第一轮PCR产物，得到酶切产物；
（5）以所述酶切产物为模板，采用所述F2和所述R2进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR产物；
（6）以所述第二轮PCR产物为模板，采用所述F3和所述R3进行第三轮PCR扩增，得到第三轮PCR产物；
所述第三轮PCR产物中，所述AD所在链上位于所述AD的3’端外向3’端方向延伸的序列即为所述转基因生物中外源基因整合位点处的侧翼序列的反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述F1和所述AD间的基因序列的GC含量在40-70%之间，退火温度在80-85℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述F1、所述R2、所述R3、所述F2和所述F3的GC含量均≤60%，退火温度在55-65℃之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述AD的退火温度在35-45℃之间。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，进行所述第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 4分钟；94℃ 30秒，比所述F1的退火温度低5℃ 1分钟，72℃ 2分钟，5个循环；94℃ 30秒，25℃ 3分钟，72℃ 1-3分钟；94℃ 30秒，比所述F1的退火温度低5℃ 40秒，72℃ 1-2分钟，94℃ 30秒，比所述F1的退火温度低5℃ 40秒，72℃ 2分钟，94℃ 30秒，45℃40秒，72℃ 2分钟，8个循环。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，进行所述第二轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 4分钟；94℃ 30秒，所述F2和所述R2中退火温度相对较低的退火温度 1分钟，72℃ 2分钟，5个循环； 94℃ 30秒，比所述F2和所述R2中退火温度相对较低的退火温度低5℃ 1分钟，72℃ 2分钟，25个循环。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，进行所述第三轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 4分钟； 94℃ 30秒，比所述F3和所述R3中退火温度相对较低的退火温度低5℃ 1分钟，72℃ 2分钟，25个循环。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物为基因组序列已知的植物、动物或微生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻或棉花。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述生物为水稻，所述AP中所述4个特定核苷酸自5’端到3’端为GTTA、TCAG或CTAG；或
所述生物为棉花，所述AP中所述4个特定核苷酸自5’端到3’端为CCTG、TGGA或CAGT。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于： 所述生物为水稻，所述AP中的所述9-11个核苷酸自5’端到3’端为VBBNNNGTTA、DVHNNNTCAG或DVBNNNCTAG；或
所述生物为棉花，所述AP中的所述9-11个核苷酸自5’端到3’端为DBHNNNCCTG、VDDNNNTGGA或BDVNNNCAGT；
所述N为A或G或C或T；V为A或G或C；B为G或C或T；D为A或G或T；H为A或C或T。
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