CN110117590A - 一种用于基因组步移的步移引物及其应用的pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法，其中步移引物包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx‑P、NSPx‑S、NSPx‑T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。本发明涉及的PCR方法能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列，具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。
Description
技术领域
本发明涉及PCR步移技术领域，具体涉及一种用于基因组步移的步移引物 及其应用的PCR方法。
背景技术
基因组步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术，使用 这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以 下几方面的应用：
1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控 基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行 研究；
2.查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所 导致的外源基因的插入位点等；
4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
对于基因组测序已经完成的少数物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等) 来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大 多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧 的DNA序列，只能采用染色体步移技术。
以PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异 性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接 头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。
发明内容
为解决上述问题，本申请提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的 PCR方法，能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列。该方法具 有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。
根据第一方面，一种实施例中提供一种用于基因组步移的步移引物，包括用 于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套步 移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、 NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全 相同，5’端的13个碱基序列完全不同。
进一步地，在NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值 为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。
进一步地，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、 NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示。
根据第二方面，本实施例还提供一种使用上述的用于基因组步移的步移引物 的PCR方法，包括以下步骤：
第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待 测DNA模板进行PCR反应；
第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为 扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP2位于SP1的5’端至 3’端的内侧；
第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3为 扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP3位于SP2的5’端至 3’端的内侧。
进一步地，在NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值 为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。
进一步地，第一轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的 各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
基因组DNA，微生物10-100ng或动植物100-1000ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
进一步地，第一轮PCR反应的扩增程序为：进行5个温度为65℃的PCR反 应后，以25℃为退火温度进行1个PCR反应，再进行30个温度为65℃的PCR 反应。
进一步地，第二轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的 各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
1μL第一轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
进一步地，第二轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个 循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃ 的高退火温度进行30个循环的PCR反应。
进一步地，第三轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的 各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
1μL第二轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
进一步地，第三轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个 循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃ 的高退火温度进行30个循环的PCR反应。
依据上述实施例的步移引物及其应用的方法，由于利用同一套步移引物3’ 端部分重叠的特点，保证了后一轮PCR的步移引物只能在较低温度下与前一轮 PCR产物中的步移引物位点结合。由于每轮PCR仅使用一个25℃/50℃退火温 度的PCR反应，因此随机引物只有一次机会随机退火至基因组某个位点或者前 一个随机引物位点，并合成了一系列新的单链DNA。在新合成的单链中，目的 单链的3’区域由于存在特异性引物的完美退火位点，在随后的一个65℃的PCR 反应中转变为双链，该双链的一端为POP引物位点、另一端为特异性引物位点， 从而在随后的65℃的PCR反应中得到指数扩增；非目的单链由于缺乏任一引物 的结合位点，不能复制为双链，从而在随后的严谨性循环中不能扩增。因此， POP-PCR富集目的条带，同时抑制非目的片段扩增。
附图说明
图1为本发明的一实施例中的PCR反应的方法流程图；
图2为本发明的一实施例中的第一轮PCR反应的方法示意图；
图3为本发明的一实施例中的第二/三轮PCR反应的方法示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
说明书中方法描述的各步骤也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方 式进行顺序调换或调整。
本发明的总体构思是：设计三套步移引物，同一套步移引物3’端部分重叠， 根据该特点进行非特异性PCR反应，将已知序列拼接到未知序列片段上。再通 过巢式PCR反应，对拼接上已知序列的产物进一步扩增和测序，以得出未知核 酸片段序列。
本实施例提供一种用于基因组步移的步移引物，包括用于基因组步移PCR 反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套步移引物包括分别用 于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3， 同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。 NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、 NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示。
对于任一特定的DNA步移实验，需要根据已知序列设计3条方向一致的 特异性引物，即SP1、SP2和SP3，分别与每套步移引物配对参与PCR反应， 具体为SP1与NSPx-P配对、SP2与NSPx-S配对、SP3与NSPx-T配对进行PCR 反应。
特异性引物和步移引物的设计原则为：引物长度的范围是23-28nt，优选长 度为25nt。其G－C含量为45-55％，Tm值为60-72℃。Tm值计算公式为： Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。其他要求和普通PCR反应用引物相同。
本实施例还提供一种使用上述的用于基因组步移的步移引物的PCR方法， 请参见图1至图3，其中实线为已知基因序列，虚线为未知基因序列，带有不同 头部的黑色实心箭头为NSPx，x＝1、2、3，带不同尾部的空心箭头为SPx，x＝1、 2、3，灰色实心箭头为引物互补序列。该方法包括以下步骤：
S1、第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1 对待测DNA模板进行PCR反应。该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具 体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
基因组DNA，微生物10-100ng或动植物100-1000ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
按上述组分配置反应液后，放入PCR仪进行第一轮PCR反应。具体过程为：
S11、首先进行5个65℃的PCR反应，此时仅SP1引物与模板上的特异性 退火位点结合启动聚合反应，新增得到5条目的条带，达到提高特异性单链浓 度的目的；
S12、然后进行1个25℃的PCR反应，在此低温条件下，在DNA模板上 可能存在某个位点，NSPx-P引物与之结合并往SP1方向扩增，从而得到一条新 的单链，其3’端均存在SP1的特异性结合位点，而5’端是NSPx-P；
S13、在随后的一65℃的PCR反应中，只有SP1可以有效在新生单链的特 异性位点退火，并引发指向NSPx-P的扩增，此时得到一条双链，其一为SP1 位点，另一端为NSPx-P位点；
S14、在其余的29个65℃的PCR反应中，只有该双链得到指数扩增。
在仅有的一个25℃的PCR反应中，NSPx-P、SP1可能引发一系列非目的 条带，但在随后的65℃的PCR反应中，这些单链不能转变为双链，因为其不 含任一引物的完美退火位点。因而非特异性产物不能扩增。
S2、第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物 NSP2为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP2位于SP1 的5’端至3’端的内侧。
该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
1μL第一轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
第二轮PCR反应的扩增程序为：
S21、取第一轮PCR反应产物1μL为模板，加入引物SP2和NSP2，与第一 次PCR反应的引物在同一组，进行5个65℃的PCR反应。此时因退火温度高， NSP2无法结合上去进行扩增，模板仅在SP2引物的作用下进行单一链的特异性 的扩增,因SP2是在SP1内侧，所以只有特异性扩增产物才能得到扩增；
S22、然后进行1个50℃的PCR反应，大量的NSP2结合到前5个PCR反 应产生的单链上，由于SP2与SP1存在12个碱基的重叠区域，故大部分的SP2 能结合到模板上的目标位置上，非特异性结合大大减少。在这一循环中扩增出 大量3’端有SP2的特异性结合位点，而5’端以NSP2开头的DNA链；
S23、此时再进行65℃的PCR反应，就可以合成大量5’端以SP2为开始， 3’端存在NSP2的特异性结合位点的DNA单链；
S24、最后进行29个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
S3、第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3 为扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP3位于SP2的5’ 端至3’端的内侧。
第三轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
1μL第二轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
第三轮PCR反应的扩增程序与第二轮PCR反应的扩增程序相同。
实施例一
人ALDA基因PCR步移
根据人ALDA基因的5’端设计SP1、SP2和SP3，其序列分别如SEQ ID NO. 10至SEQID NO.12。NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、 NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示。
利用试剂盒抽提待测人ALDA基因组DNA，进行以下PCR反应：
第一轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
人ALDA基因组DNA500ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：首先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个25℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，得到扩增产物。
第二轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
第一轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
第三轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
第二轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
实施例二
乳酸杆菌PCR步移
根据乳酸杆菌基因的5’端设计SP1、SP2和SP3，其序列分别如SEQ ID NO. 13至SEQID NO.15。NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、 NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示。
利用试剂盒抽提待测乳酸杆菌基因组DNA，进行以下PCR反应：
第一轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
乳酸杆菌DNA50ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：首先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个25℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，得到扩增产物。
第二轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
第一轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
第三轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
第二轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
实施例三
乳酸杆菌PCR步移
根据丙肝病毒core基因的5’端设计位于275-299的SP1、位于241-265的 SP2和位于429-453的SP3，其序列分别如SEQ ID NO.16至SEQ ID NO.18。 NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、 NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9所示。
利用试剂盒抽提待测丙肝病毒core基因组RNA，进行以下PCR反应：
第一轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
丙肝病毒core基因RNA50ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：首先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个25℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，得到扩增产物。
第二轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
第一轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
第三轮PCR反应：该轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下 浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
第二轮PCR反应产物1μL；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
具体过程为：先进行5个65℃的PCR反应，然后进行1个50℃的PCR 反应，最后进行30个65℃的PCR反应，形成大量的特异性片段。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不 用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想， 还可以做出若干简单推演、变形或替换。
序列表
<110> 蔡庆贤
<120> 一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法
<141> 2018-01-05
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcaggtcat acaagtcagt cttag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cttcagatgg tacagtcagt cttag 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctcagcgttc gtcagtcagt cttag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cttgaactgg acccgtctcc agtct 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agtcagcgtc cgtcgtctcc agtct 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catgaccgct gagcgtctcc agtct 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcaggtccaa gcaagtgcag tcaag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acgatcccaa ggtagtgcag tcaag 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tcagtcagtc agtagtgcag tcaag 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tggcatgcgt ctgtaatccc agcta 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ctgagatcgc accactgcac tctag 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gcatacatca tcccttgtct tggct 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cttcctgggt aagcgtcagc gtgtg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cagcttcgtc ggtagattga acgct 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ggtggtcagc agccagctat attcg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
aaggccttgt ggtactgcct gatag 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
catgagcacg aatcctaaac ctcaa 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
atcgttggtg gagtttactt gttgc 25
Claims (10)
1.一种用于基因组步移的步移引物，其特征在于，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。
2.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。
3.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQID NO.9所示。
4.一种使用权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待测DNA模板进行PCR反应；
第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP2位于SP1的5’端至3’端的内侧；
第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3为扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP3位于SP2的5’端至3’端的内侧。
5.根据权利要求4所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。
6.根据权利要求4所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP1；
0.2μM NSPx-P；
基因组DNA，微生物10-100ng或动植物100-1000ng；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
7.根据权利要求4或5或6所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应的扩增程序为：进行5个温度为65℃的PCR反应后，以25℃为退火温度进行1个PCR反应，再进行30个温度为65℃的PCR反应。
8.根据权利要求7所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP2；
0.2μM NSPx-S；
1μL第一轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
9.根据权利要求8所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃的高退火温度进行30个循环的PCR反应。
10.根据权利要求7所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第三轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：
1×LA PCR buffer II的Mg2+plus；
0.4mM dNTP；
0.2μM SP3；
0.2μM NSPx-T；
1μL第二轮PCR反应的DNA模板；
2.5U TaKaRa LA Taq HS；
适量ddH2O。
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| CN201810110677.9A CN110117590A (zh) | 2018-02-05 | 2018-02-05 | 一种用于基因组步移的步移引物及其应用的pcr方法 |
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