CN101177697B - 一种制备核酸分子量标的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备核酸分子量标的方法，通过一次聚合酶链反应(PCR)扩增出完整marker所需的所有条带。将合成的两条单链核苷酸退火，使其形成双链后再利用带有的同尾末端序列依次连接到载体上。经过转化等常规步骤得到大肠杆菌克隆。在引物、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液存在的情况下，根据一定的循环条件进行PCR扩增。循环数量和扩增体系均可根据不同的需要调节。将得到的产物加入适量的溴酚蓝后即可制备出成品。下一次生产时只需将保种的细菌裂解后作为模板(或者直接用质粒)再次PCR扩增就可以快速、高效、大量的制备出产品，节省了人力、物力、财力。

Description

一种制备核酸分子量标的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及核酸分子量标的制备。

背景技术

目前，国内外核酸分子量标的生产是使用酶切的方法，根据所需marker的大小选择不同的核酸内切酶并对不同质粒进行切割，然后将酶切产物按照一定比例混合后加入适量loading buffer制成产品。然而，随着市场需求的增多，需要多次重复这一步骤以置备出足够的产物来满足生产、消费的需要。增加了生产成本与劳动时间。

发明内容

针对现有技术中生产核酸分子量标步骤繁琐、生产效率低的缺点。本发明的主要目的在于提供一种制作简单、覆盖范围广、成本低廉的核酸分子量标生产方法，可以更高效的完成整个制作过程，且性能满足要求。

为达到上述目的、本发明解决方案是：

一种制备核酸分子量标的方法，其步骤如下：

(1)设计并合成两条单链核苷酸作为聚合酶链反应PCR的模板，

(2)对上述核苷酸进行退火处理，

(3)采用基因工程技术将退火后的双链核苷酸连接到载体上，

(4)采用引物和DNA聚合酶对上述步骤得到的双链核苷酸进行多重PCR扩增，得到不同分子量片断的标记物，即为所需要的核酸分子量标marker。

如上所述的方法，其中步骤(1)-(4)之后还包括：

(5)将步骤(3)得到的重组载体保存或者将载体转化到宿主菌中保存；

(6)摇细菌、抽质粒并再次酶切后又可插入更多oligo、多重PCR扩增之后获得不同分子量片断的标记物，即为所需要的分子量标marker。

如上所述的方法，其中插入片断oligo序列中含有限制性内切酶识别位点；插入片断oligo序列两端为同尾序列，使其能够直接在连接到载体上的同时使原有酶切位点消失。所谓同尾序列就是能够与质粒载体上酶切后的残端互补的序列。

如上所述的方法，其中插入片断oligo中，在同尾序列的同时又加入了原先内切酶的酶切位点，使得每次酶切都只需使用同样的两个内切酶。

如上所述的方法，其中步骤(1)所用的插入片断oligo的大小根据不同marker的需要而设计；各个插入片断oligo的长度一致，或者不一致。

如上所述的方法，其中步骤(1)所用的插入片断oligo是通过常规酶切、连接技术连接到载体上的。

如上所述的方法，其中步骤(3)所用的引物，一条是固定在某一位置上的，而另一条随着插入片断oligo的插入而不断增加结合位点。

如上所述的方法，其中步骤(3)中多重PCR所需的DNA聚合酶为缺失5’-3’内切酶活性的DNA聚合酶；优选VentR exo-DNA Polymerase M0257V，NEB。

如上所述的方法，其中插入片断oligo中含有启动子序列，可以通过转录成RNA后制备RNA分子量标marker。

如上所述的方法，其中多重PCR扩增所使用的条件为PCR扩增仪上的默认条件。

进一步，上述的聚合酶链反应(PCR)的模板包含多条插入片断oligo；如果这些插入片断oligo都相同，则得到的marker的梯度是一样的；如果插入片断oligo的不相同，则可制备梯度不同的marker。

具体而言，插入片断是由两条单链寡核苷酸(序列可以灵活掌握)退火形成的双链DNA，通过酶切、连接等简单操作将该外源片断逐个连接到载体上，插入片断本身含有限制性内切酶识别位点，可以再次作为下次克隆的酶切位点，循环往复连接更多的双链片断插入片断，插入片断在长度上可以不同，但是他们的引物结合部位以及所包含的酶切位点相同。最后得到的是含有若干条插入片断的大肠杆菌克隆，易于保存和扩增。

其特征在于：巧妙的设计与质粒酶切位点互补的序列，使其能够直接在连接到载体上的同时使原有酶切位点消失，而插入片断中引入的酶切位点又可以进行下轮的基因工程。

本发明相关的聚合酶链反应(PCR)所需的引物与插入片断中的序列互补，在dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液存在的条件下，依照一定循环条件进行扩增。退火温度根据不同模板、不同引物的GC比值而定。产物浓度可以通过增大PCR体系来实现。

目前市售的任一种质粒均可用于该项发明，但是原则上还是推荐使用分子量相对小一些的质粒，因为随着外源片断的不断插入，质粒的分子量会越来越大，这是没有必要的。引物序列视质粒和插入序列的设计而定，长度控制在20bp左右。酶切位点依据不同的质粒而定，原则上，任何酶都可以用于该项发明。作为一种分子量标，在PCR后得到的各片断的比例不应悬殊过大，所以循环时的退火温度不应过高，通常采用PCR仪的默认循环条件即可。PCR所需的DNA聚合酶应该缺失5’-3’内切酶活性，因为普通Taq酶在PCR延伸过程中，会将小片断消化掉，导致只能产生一条扩增片断。

在生产时，将质粒作为模板扩增出marker，也可以将连接了若干条插入片断的质粒转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆用甘油保存于-80℃中，当现有质粒用尽时，只需摇细菌抽质粒就可以得到新的模板，而不用像传统技术那样重新酶切。

由于采用上述方案，可以快速、大量生产出不同规格的marker，同一规格的marker只需经过几次基因工程便可以置备出可以重复扩增的模板，节省了人力，提高了效率。

附图说明

图1是实施例1中质粒载体的多克隆酶切位点图。

图2是实施例1中载体连接上一个oligo的示意图。

图3是实施例1中制备的DNA marker电泳图。

图4是实施例2中载体连接上两个不同oligo的示意图。

具体实施方式

实施例1

图1是psp72质粒的多克隆酶切位点，在此次试验中选用了Sal I和BamHI这两个酶切位点，酶切1.5h后回收得到双酶切后的载体。

合成的序列是单链寡核苷酸，是公司按照设计后的序列合成的(上海生工生物工程技术服务有限公司，Lot No：AA26474，AA26475)两条链互补，在正式进行基因工程之前应该先退火成双链。退火条件如下：

95℃×2min每40秒下降0.5℃，降至25℃后4℃保存(annealing buffer是碧云天公司产品)

正如图2所示，图中粗斜体部分是载体双酶切后的序列末端，黑色方框内是oligo序列，由于在设计时就加上了与酶切末端互补的序列(阴影部分)，所以可以直接连接到载体上，连接上之后原来的酶切位点消失。空心字部分是插入序列oligo中设计的Sal I和BamH I酶切位点，成为下一次连接的酶切位点，在此次试验中共连接了6个相同的oligo。(而其余5个oligo同样通过酶切和连接的基因工程操作引入载体中)下划线部分是SP6启动子序列，这一设计使制作RNAmarker成为可能。其余部分是随机设计的序列，可以根据不同的需要做相应调整。波浪线表示引物结合位点，可以发现引物是分别结合在质粒载体和oligo上的，随着oligo的插入，引物的结合位点也不断增多，在热循环过程中，与锚定在另一端引物实现多重扩增。

所用引物序列：

Primer+：CAGCTGAAGCTTGCATGCCT；Primer-：AGTCCTCGGCCACATTGTGA

所用DNA聚合酶是：VentR exo-DNA Polymerase(M0257V，NEB)

循环条件：

结果如图3所示，land1为市售的DNA marker(100bp)，land2和land3都是此次制备的DNA marker(50bp)。可以清楚的看到50bp、100bp、150bp、200bp、250bp以及300bp这6条带。扩增体系25ul，上样量为5ul，在实际生产过程中可以扩大PCR体系来调节浓度，增加产量。加入溴酚蓝后得到marker产品。

在生产时，将质粒作为模板扩增出marker，可以将连接了若干条插入片断的质粒转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆用甘油保存于-80℃中，当现有质粒用尽时，只需摇细菌抽质粒就可以得到新的模板，经过一次多重PCR扩增后获得大量的marker。

实施例2

图4所示采用不同长度的插入片段制作marker，可以在原有的插入片断中随机加入若干碱基，在本实施例中，是在原有基础上又加入了50个碱基(小写字母部分)，使引物之间的序列长度达到150bp，而原有的酶切位点与引物结合位点保持不变。由此可见，只需设计合成不同长度的插入序列就可以生产出多种分子量的marker，省时省力。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种制备核酸分子量标的方法，其步骤如下：

(1)设计并合成两条单链核苷酸作为聚合酶链反应PCR的模板，

(2)对上述核苷酸进行退火处理，得到双链的插入片断oligo，

(3)采用基因工程技术将退火后的插入片断逐个连接到载体上，得到连接有多个oligo的双链大分子，

(4)采用引物和DNA聚合酶对上述步骤得到的，由插入片断连接到载体上之后形成的双链大分子进行多重PCR扩增，得到不同分子量片断的标记物，即为所需要的核酸分子量标marker。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)-(4)之后还包括：

(5)将步骤(3)得到的重组载体保存或者将载体转化到宿主菌中保存；

(6)摇细菌、抽质粒并再次酶切后又可插入更多oligo、多重PCR扩增之后获得不同分子量片断的标记物，即为所需要的分子量标marker。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于插入片断oligo序列中含有限制性内切酶识别位点；插入片断oligo序列两端为同尾序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的同尾序列是能与质粒载体上酶切后的残端互补的序列；并能在连接到载体上的同时使原有酶切位点消失。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于插入片断oligo中，在同尾序列的同时又加入了原先内切酶的酶切位点，使得每次酶切都只需使用同样的两个内切酶。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)所用的插入片断oligo的大小根据不同marker的需要而设计；各个插入片断oligo的长度一致，或者不一致。

7.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所用的插入片断oligo是通过常规酶切、连接技术连接到载体上的。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)所用的引物，一条是固定在载体分子上的，而另一条随着插入片断oligo的插入而不断增加结合位点。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中多重PCR所需的DNA聚合酶为缺失5’-3’内切酶活性的DNA聚合酶。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于单链核苷酸中含有启动子序列，通过转录成RNA后制备RNA分子量标marker。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所用的载体为质粒；所用的宿主菌为大肠杆菌。

12.根据权利要求9所述的方法：步骤(3)中多重PCR所需的DNA聚合酶优选VentR exo-DNA Polymerase。

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