CN102337284A - 一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途。本发明所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。本发明还提供了低成本快速制备DNA分子量标准的方法，用该方法生产的DNA Marker具有条带锐利，亮度均一或可随意控制，批次间重复性好等特点。

Description

一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域，涉及一种基因工程中得以广泛使用的DNA分子量标准(DNA Marker)的生产方法。具体地，本发明涉及一种用于低成本快速生产高质量DNA Marker的质粒及其构建方法，同时涉及利用该质粒生产DNA Marker的方法与应用。 

背景技术

基因工程又称重组DNA技术，是指在体外在分子水平上对DNA进行切割、连接、修饰等一系列操作的过程，是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，诞生于20世纪70年代的一门崭新的生物科学技术。尽管该技术是一门年轻的技术，但其在生命科学、生物医学领域甚至是物理学、高分子科学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。 

在对DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的分离、纯化、切割、修饰、连接、扩增、序列测定等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA的电泳。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在支持介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备、检测、浓度测定、目的DNA片段的纯化，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。 

在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的长度)呈线性关系。因此，可以用一组分子量(长度)已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样 品的分子量的DNA片段混合物就称为DNA分子量标准，简称DNA Marker。 

DNA Marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现DNAMarker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前各实验室中DNA Marker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNA Marker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNAMarker产品。 

DNA Marker的制备上，目前主要有两种方法：PCR法和酶切法。 

PCR法实现简单，通过PCR(聚合酶链式反应)技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了DNA Marker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNAMarker。为了改善重复性和降低成本，目前的主流方法已经由获得单一的DNA片度PCR向多重PCR(多对引物针对同一模板或一对引物针对多个面板的情况)技术发展。但其仍然存在成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差等缺点。 

酶切法又分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列DNA片段组合。用该方法生产的最经典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌体基因组DNA经过内切酶Hind III消化后，产生125bp至23130bp大小的8条条带。用这种方法生产DNA Marker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显然易见的：1、条带距离不均匀，由于来自天然的基因组，DNA分子上的酶切位点的位置也是天然的，是不可控的，因此DNAMarker中有的两个条带之间相聚很远，不能清晰地指示该区域内的未知DNA分子量情况，有的两个条带之间距离很近，难以清晰地分开；2、基于同样的原因，条 带的分子量未能是整数；3、条带亮度严重不均一，这也是最严重的问题，由于对应片段在基因组中的拷贝数不可控，分子量大的条带的亮度与分子量较小的条带的亮度相差很远，以Lambda DNA/Hind III Marker为例，最大的条带23130bp与最小的条带125bp在亮度上要相差上百倍，电泳过程中往往导致大条带未实现良好分离而小条带已经严重扩散导致亮度很低甚至不可见。 

为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA Marker。通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，一旦质粒构建好，后续生产成本极低。 

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性、温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法适用于以单位长度递增的DNA Marker(比如100bp DNA Ladder，条带为100bp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。 

完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA Marker质量较好，但其缺点是前期载体构建复杂，而且目前所报道的利用完全酶切的方法产生的DNA Marker均未完美地解决不同大小的DNA片段在质粒中的拷贝数的问题，从而未能解决酶切后所得到的各条DNA分子之间亮度的均一性问题。 

综上所述，在目前DNA Marker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式虽然简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性，从而难以实现大规 模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流，但目前仍然存在前期载体分子构建复杂，制备不同种类的Marker灵活性欠佳，后期制备过程中条带亮度不能完全均一的瓶颈。 

本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，各条带的量完全一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一性，尤其是小条带的亮度问题。同时，本发明利用同尾酶的特点和巧妙的设计思路极大地简化此类DNA分子的构建过程，大大提高了DNA Marker制备的效率。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种低成本DNA Marker生产和制备的方法。利用这种方法制备DNA Marker具有成本低、速度快，产物条带均一、锐利，条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示。本发明同时也提供了用于制备该DNA Marker的质粒及其构建方法。 

本发明根据准备生产的DNA Marker的条带组成设计载体，使得可以用单一的酶释放组成DNA Marker中的各片段，对载体中各片段拷贝数的设计使得酶切后得到的各条带的量一致或可根据设计变化，从而实现所生产的DNA Marker的条带间亮度的一致性或可根据设计变化。然后，将构建好的质粒扩增后，用完全酶切的方法制备DNA Marker。由于该载体片段较多，按常规方法构建复杂，工作量大，本发明利用同尾酶的特点对组成片段进行拼装，大大简化了载体构建的流程。 

本发明首先提供了一种用于DNA Marker制备的质粒，所述质粒符合下列要求： 

含有组成目标DNAMarker的各大小不同的DNAMarker片段(为DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。 

目标DNA Marker的片段大小可以根据需求设计，可以是任意数量任意长度片段的组合。 

所述单酶切位点可以是II型限制性内切酶酶切位点。较佳的，所述单酶切位点是任意片段内不存在多余的识别位点而且不与载体构建过程中的酶相冲突的II型限制性内切酶酶切位点。更佳地，应该选择酶切效果好而且成本较低的酶切位点如Hind III，EcoR I，BamH I，Pst I等的酶切位点。 

进一步的，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部。由于单一的酶释放即能得到组成目标DNA Marker的各片段，因此，质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离都应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小，即每两个相邻的所述单酶切位点之间的碱基数均与目标DNAMarker中某一DNA片段的碱基数相等。 

满足上述设计要求的质粒能用单一的酶释放得到组成目标DNA Marker的各片段。 

进一步的，组成DNA Marker的各片段在该质粒中的拷贝数与该片段的长度有关，要达到同样信号强度，长度越小的片段在质粒中的拷贝数越高。 

进一步的，某DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数与该DNA Marker片段长度的乘积，比上另一DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数与该另一DNAMarker片段长度的乘积获得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段与所述另一DNA Marker片段的信号强度比值。 

即：(Na×Ca)∶(Nb×Cb)＝Sa∶Sb

其中，Na表示DNA Marker片段a的碱基数，Nb表示DNA Marker片段b的碱基数，Na≠Nb；Ca表示DNA Marker片段a在质粒中的拷贝数，Cb表示DNA Marker片段b在质粒中的拷贝数；Sa表示DNA Marker片段a的信号强度；Sb表示DNAMarker片段b的信号强度。 

例如，质粒中，100bp大小的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数是200bp大小的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数的2倍，那么最终获得的DNAMarker中，100bp大小的DNA Marker片段与200bp大小的DNA Marker片段的信号强弱比例即为1∶1；再比如，质粒中，100bp大小的DNA Marker片段在所述 质粒中的拷贝数与200bp大小的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数相等，那么最终获得的DNA Marker中，100bp大小的DNA Marker片段与200bp大小的DNA Marker片段的信号强弱比例即为1∶2，其余以此类推。 

可以通过调整各大小不同的DNA Marker片段的拷贝数来使得DNA Marker中，各大小不同的DNA Marker片段的信号强弱比例符合预期。 

较佳的，拷贝数与片段长度的关系为各条带拷贝数与片段长度的乘积一致(为了便于观察在DNA Marker中需要特意加强亮度的条带除外)，保持这种关系使得组成DNA Marker的各条带在质粒酶切后，各片段的量相等，从而在凝胶上亮度一致。以目前广泛使用的含有6条带(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)的DNA Marker为例，如图1所示，则该质粒中，2000bp片段的拷贝数为1个，1000bp片段的拷贝数为2个，500bp片段的拷贝数为4个，250bp片段拷贝数为8个，100bp片段拷贝数为20个，750bp的片段为了加强显示，拷贝数为4个，该条带的亮度将是其他条带的1.5倍。则整个质粒分子的结构如图2所示，完整质粒大小为13000bp，当然，在构建质粒载体时，条带之间的顺序并不重要。 

所述质粒应当与其他常用质粒载体一样，包括一些必须的元件，如复制子、抗性基因和筛选标记。为便于设计，所述元件可以位于质粒中碱基数最多的DNA Marker片段中。 

如实施例具体列举的，所述制备DNA Marker的质粒的DNA序列为SEQ ID NO：1。 

本发明还进一步公开了符合上述设计要求的用于DNA Marker制备的质粒的制备方法。 

从图2可以看出，以该质粒为例，质粒共有39个条带，如果按照常规的克隆，需要做38次克隆，工作量非常大，这也是为什么目前该方法未能在商业上广泛使用的原因之一。本发明利用同尾酶的特点完成质粒的构建，极大地简化了构建过程。同尾酶是一类来源各异，识别序列不同，但切割DNA产生相同的，可以相互连接的粘性末端的限制性内切酶，常见的同尾酶对有BamH I/Bgl II/Bcl I，Spe  I/Xba I/Nhe I，Nco I/Pci I，Sal I/Xho I等。同尾酶的特点如图3所示，以BamH I和Bal II为例，这两个酶分别识别“GGATCC”和“AGATCT”的DNA序列，酶切后留下相同的5’突出“GATC”的粘性末端，这两个粘性末端匹配连接后，形成“GGATCT”的序列，该序列将不被BamH I或Bgl II中的任意一个切割。利用这个特点进行载体构建，使得完成整个载体仅需要用到BamH I或Bgl II这两个酶，极大地简化了内切酶的选择和使用。具体构建流程如图4所示，首先在受体质粒上引入一个BamH I和一个后期DNA Marker制备过程中用到的酶切位点(此处以Hind III为例)，在提供片段的供体载体上，片段的两端分别引入BamH I和Bgl II位点，在其内部引入一个Hind III位点，所有片段中BamH I位点与Hind III之间的距离一致，从而保证每两个Hind III位点之间的距离等于预设好的片段大小。构建时，用BamH I单酶切受体质粒并进行去磷酸化处理以减少自连率，用BamH I和Bgl II双酶切供体质粒释放片段，该片段与供体质粒相连后，将形成一个带有该片段的质粒，由于BamH I与Bgl II相连后两个酶切位点消失，所以该质粒仍然只带有一个BamH I位点。以同样的方式，可以接受另一个片段，直到所有片段按照预定的方式进入载体。 

由于本载体中涉及到的片段众多，如果逐个添加，仅以20个100bp的片段为例则需要19个克隆步骤才能完成整个载体。同样地，本发明采用同尾酶的方法，如图5所示，将这些片段按几何级数的方式连接，则仅需要5个克隆步骤即可完成20个片段的连接。采用同样的方式，构建8个串联的250bp片段，4个串联的500bp片段，4个串联的750bp片段和2个串联的1000bp片段。 

本发明质粒的制备方法具体包括如下的步骤： 

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点； 

(2)确定用于质粒构建的同尾酶对，确定用于完全酶切法制备DNA Marker的所 述单酶切位点对应的酶； 

(3)选择高拷贝数质粒作为骨架载体并在其中引入一个所述同尾酶对中任意一个同尾酶的酶切位点和一个所述单酶切位点，构建完成的骨架载体中，所述同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一。 

(4)制备组成目标DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，并分别连接到中间载体中获得各DNA Marker前体片段的中间载体，这些前体片段两端为所述同尾酶对的酶切位点，中间包含一个所述单酶切位点，各DNA Marker前体片段中所述单酶切位点离片段某一端的距离一致，且各DNA Marker前体片段中该端的同尾酶酶切位点相同，在构建完成的中间载体中，所述同尾酶对中任一同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一。 

(5)将中间载体中的各DNA Marker前体片段依次连接起来，构建到步骤3制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。 

步骤1中目标质粒的设计还可进一步满足之前所述的各种要求。 

步骤2中，所述同尾酶对应的酶切位点应不同于所述单酶切位点。 

进一步的，步骤3构建的骨架载体中，引入的同尾酶酶切位点应当至少包括步骤4制备的所有DNA Marker前体片段中，与所述单酶切位点距离一致的一端所含的同尾酶酶切位点，且在骨架载体与步骤4制备的所有DNA Marker前体片段中，该同尾酶酶切位点与所述单酶切位点的距离一致。 

步骤4中，所述DNA Marker前体片段中，所述同尾酶对的酶切位点之间的碱基数与其对应的DNA Marker片段相同，两者的不同在于：如图6所示，若以前体片段中与所述单酶切位点距离一致的一端所在的同尾酶酶切位点到所述单酶切位点的序列为A，所述单酶切位点到前体片段中另一同尾酶酶切位点的序列为B，那么所述DNA Marker前体片段中，所述同尾酶对的酶切位点之间的序列就为A-B，而与其对应的DNA Marker片段的序列就为B-A。 

步骤4中，制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段的方法可采用各种现有的制备DNA片段的方法，包括但不限于用PCR或酶切的方法、化 学合成等。 

进一步的，步骤5可分别以步骤4获得的各DNA Marker前体片段的中间载体为起点，反复利用同尾酶酶切及拼接的方式获得含有各DNA Marker前体片段串联重复片段的中间载体，直至各DNA Marker前体片段的中间载体中，DNA Marker前体片段的拷贝数达到设计要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式，将含有符合设计DNA Marker前体片段拷贝数要求的各中间载体中的DNA Marker前体片段拼接入步骤3制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。 

所述同尾酶对是指，两个识别不同DNA序列但酶切后产生相同DNA末端的限制性内切酶。适用于本发明中的同尾酶对可以是，但不局限于BamH I/Bgl II/BclI中的任意两个，Spe I/Xba I/Nhe I中的任意两个，Nco I/Pci I，Sal I/Xho I等。 

所述高拷贝数质粒是指，可以存在于细菌体内的，其复制与细菌基因组DNA的复制不关联的，在单个细菌体内可以达到300个拷贝数以上的质粒。适用于本发明的质粒可以是，但不局限于pUC系列，pBluescript系列，pGEM系列，pTZ系列等。 

所述中间载体可选自：pUC18，pUC19，pUC57，pBR322，pUCm-T，pSG-TS，pMD18-T，pMD19-T等多种克隆载体。 

本发明还提供了一种DNA Marker的制备方法，包括下列步骤： 

A.构建前述用于制备DNA Marker的质粒或者直接采用构建好的用于制备DNAMarker的质粒； 

B.将步骤A所述质粒转入合适的宿主菌后扩增质粒； 

C.分离质粒并采用所述单酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切质粒获得DNA Marker。 

所述的宿主菌可以是大肠杆菌。 

所述完全酶切法制备DNA Marker是指，用一个或多个限制性内切酶对质粒DNA过量消化，使得质粒上的每一个该酶的识别位点均被切开，释放相应大小的片段。 

所述用于完全酶切法制备DNA Marker的所述单酶切位点对应的酶是指，用于切割质粒后产生如设计所示的各DNA条带的酶。适用于本发明中的该酶可以是质粒中除了片段相连处之外的序列中不含有的任意II型限制性内切酶，更佳地，宜选用成本较低的酶，如Hind III，BamH I，EcoR I，Pst I等。 

当采用实施例列举的序列为SEQ ID NO：1的质粒制备DNA Marker时，可将其转入大肠杆菌复制，并采用Hind III完全酶切质粒获得DNA Marker。 

采用本发明的方法用制备DNA Marker具有如下优点： 

1、所制备的Marker条带锐利，尤其是条带间亮度均一性极佳。 

2、前期载体构建好后，后期Marker生产成本很低，生产量可大可小，缩放非常方便。 

3、稳定性高，生产过程简单，批次间重复性极好。 

4、解决了前期载体构建流程复杂的问题，本发明的方法可以方便地拓展用于不同种类DNA Marker的制备。 

附图说明

图1是DNA Marker组成片段大小与拷贝数的关系示意图 

图2是用于制备DNA Marker的质粒DNA及其中的片段大小与拷贝数关系示意图 

图3是同尾酶酶切位点的特点示意图 

图4是同尾酶在本发明中的应用原理示意图 

图5是相同长度的片段几何倍数克隆原理示意图 

图6DNA Marker前体片段及其对应的DNA Marker片段示意图 

a：DNA Marker前体片段示意图 

b：对应的DNA Marker片段示意图 

图7是不同长度的片段几何倍数克隆原理示意图 

图8是实施例中所述DNA Marker琼脂糖凝胶电泳效果图 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1 

一种通用小分子量DNA Marker的制备 

本实施例讲述一种通用的小分子量DNA Marker的制备，该Marker含有6个DNA条带，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，是目前在各实验室中应用最为广泛的DNA Marker，为了易于识别，我们对750bp的条带亮度进行了加强。 

如未特别注明，本实施例中所用的生化试剂以及PCR或核酸提取与纯化试剂盒等均来自生工生物工程(上海)有限公司；所有引物合成均由生工生物工程(上海)有限公司采用固相亚磷酰胺三酯法合成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法纯化；所有DNA序列测定均由生工生物工程(上海)有限公司采用双脱氧链终止法结合Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers仪器分析；所有限制性内切酶均采购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司(Fermentas China Co.，Ltd.)。 

如未特别注明，本实施例中所用的PCR反应体系为： 

反应程序：94℃ for 2min，(94℃ for 15sec，65℃ramp to 58℃for 15sec，72℃for 80sec)×10cycles，(94℃for 15sec，58℃for 15sec，72℃for 80sec)×20cycles，72℃for 2min。 

如未特别注明，本实施例中所用PCR产物或酶切产物均用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色后于紫外线下观察，DNA定量均用Bio-Tek公司微孔板微量分光光度计测定。 

如未特别注明，本实施例中所用的限制性内切酶酶切反应体系为： 

反应条件为：37℃for 3hour。 

如未特别注明，本实施例中所用的DNA连接反应体系为： 

反应条件为：16℃for 3hour。 

如未特别注明，本实施例中所用的转化菌株为大肠杆菌DH5α。 

如未特别注明，本实施例中所用的DNA去磷酸化酶为小牛碱性磷酸酶(CIP)反应体系为： 

反应条件为：37℃for 30min，75℃for 10min。反应结束后，用DNA胶回收或PCR Cleanup试剂盒的方法回收目标片段。 

1.1载体分子的设计 

根据本发明的方法，本实施例中选择克隆载体pUC18为骨架载体，带有氨苄青霉素抗性基因；选用Hind III作为完全酶切法制备DNA Marker的酶；选则BamH I/Bgl II作为同尾酶对；每个片段中的Hind III位点位于BamH I端，相隔0bp。根据本发明的方法，用于制备该DNA Marker的质粒总大小为13000bp，以Hind III为间隔，其中包含2000bp片段1个拷贝，1000bp片段2个拷贝，750bp片段4个拷贝，500bp片段4个拷贝，250bp片段8个拷贝，100bp片段20个拷贝。该质粒的完整序列如SEQ ID NO.1所示。 

1.2各目标DNA前体片段的获得 

1.2.12000bp前体片段 

合成引物p2000F(5’-cgcggatccaagcttgctcactgactcgctgcg-3’)和p2000R(5’-cgcggatccgacgaaagggcctcgtgata-3’)，以载体pUC18质粒DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得的2000bp片段用BamH I酶切后进行自身环化。转化大肠杆菌筛选正确的克隆，该质粒命名为p2000-1。该质粒的完整序 列如SEQ ID NO.2所示。 

1.2.2 1000bp前体片段 

合成引物p1000F(5’-ggatccaagcttggcaagcataagcacacaga-3’)和p1000R(5’-agatctcaccgcttcagaagttcaca-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taqDNA polymerase进行扩增，获得的1000bp片端，将该片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的载体pSG-TS中，选用该载体的原因是，该载体多克隆位点被移除，后续酶切释放片段时不会产生干扰。转化大肠杆菌并筛选正确克隆，该质粒命名为p1000-1。该片段的序列如SEQ ID NO.3所示。1.2.3750bp前体片段 

合成引物p750F(5’-ggatccaagcttcgccaccatggtgagc-3’)和p750R(5’-agatcttcgcggccgctttac-3’)，以载体pEGFP-N1为模板，用taq DNApolymerase进行扩增，获得的750bp片端，将该片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的载体pSG-TS中。转化大肠杆菌并筛选正确克隆，该质粒命名为p750-1。该片段的序列如SEQ ID NO.4所示。 

1.2.4500bp前体片段 

合成引物p500F(5’-ggatccaagcttatttccccgaaaagtgcc-3’)和p500R(5’-agatctgcgaatgggacgcg-3’)，以载体pET30a为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得的500bp片端，将该片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的载体pSG-TS中。转化大肠杆菌并筛选正确克隆，该质粒命名为p500-1。该片段的序列如SEQ ID NO.5所示。 

1.2.5250bp前体片段 

合成引物p250F(5’-ggatccaagctttcgcgcgtttcggt-3’)和p250R(5’-agatctcgcctgatgcggtatttt-3’)，以载体pUC18为模板，用taq DNApolymerase进行扩增，获得的250bp片端，将该片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的载体pSG-TS中。转化大肠杆菌并筛选正确克隆，该质粒命名为p250-1。该片段的序列如SEQ ID NO.6所示。 

1.2.6100bp前体片段 

合成引物p100F(5’-ggatccaagcttcaactcaaccctgtccgatt-3’)和p100R(5’-agatctggacaggaccagcatacgat-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taqDNA polymerase进行扩增，获得的100bp片端，将该片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的载体pSG-TS中。转化大肠杆菌并筛选正确克隆，该质粒命名为p100-1。该片段的序列如SEQ ID NO.7所示。以上载体均进行DNA序列测定确定插入片段的长度。 

1.3前体片段的几何级数拼装 

用BamH I单酶切质粒p100-1，回收大片段，并将该片段进行去磷酸化处理；用BamH I和Bgl II双酶切同样的质粒p100-1，回收100bp大小的小片段；将该片段与上述载体连接，转化后挑选正确克隆，则得到一个还有2个拷贝100bp片段的载体，这两个片段上分别带有Hind III酶切位点且这两个位点之间的距离为100bp，该质粒命名为p100-2。以载体p100-2为起始载体，用同样的方法获得带有4个拷贝100bp片段的载体p100-4。以载体p100-4为起始载体，用同样的方法获得带有4个拷贝100bp片段的载体p100-8。以载体p100-8为起始载体，用同样的方法获得带有4个拷贝100bp片段的载体p100-16。用BamH I单酶切质粒p100-16，回收大片段，将其与用BamH I和Bgl II双酶切从p100-4上获得的片段连接，形成带有20个拷贝100bp片段的载体p100-20。 

以同样的方法获得带有8个拷贝250bp片段的载体p250-8；带有4个拷贝750bp片段的载体p750-4；带有4个拷贝500bp片段的载体p500-4；带有2个拷贝1000bp片段的载体p1000-2。 

1.4终载体的组装 

用BamH I单酶切质粒p2000-1，回收大片段，并将该片段进行去磷酸化处理；用BamH I和Bgl II双酶切质粒p100-20，回收大小为2000bp的片段；将该片段 连接到上述载体中，转化后挑选阳性克隆。重复同样的步骤，直至上述各种大小的重复片段均进入骨架载体中，终载体命名为pSDM2000。经测序，载体的序列为SEQ ID NO：1。 

1.5DNA Marker的制备 

将pSDM2000质粒以常规方法转化大肠杆菌，将带有pSDM2000质粒的大肠杆菌大量繁殖，用碱裂解法结合柱式DNA纯化法抽提质粒。用Hind III对质粒进行单酶切，反应体系如下： 

反应条件为：37℃for 10hours。 

反应结束后，按照1∶5的比例加入6x DNA Loading Buffer，所制备的Marker即可应用于琼脂糖凝胶电泳。如图8所示，三个泳道上样量分别为3ul，5ul和8ul，可以看到该DNA Marker条带分布均匀，亮度均一(750bp条带如设计所示有亮度增强的效果)，符合本发明的设计要求。 

Claims (23)

1.一种用于DNA Marker制备的质粒，所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。

2.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点为II型限制性内切酶酶切位点。

3.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点选自Hind III、EcoR I、BamH I或Pst I的酶切位点。

4.如权利要求1-3任一所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小。

5.如权利要求4所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，组成目标DNAMarker的各大小不同的片段在该质粒中的拷贝数与该片段的长度有关，要达到同样信号强度，长度越小的片段在质粒中的拷贝数越高。

6.如权利要求5所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，某DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数与该DNA Marker片段长度的乘积，比上另一DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数与该另一DNA Marker片段长度的乘积获得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段与所述另一DNAMarker片段的信号强度比值。

7.如权利要求5所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的关系为：各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的乘积一致。

8.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO：1。

9.一种用于DNA Marker制备的质粒的制备方法，包括下列步骤：

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点；

(2)确定用于质粒构建的同尾酶对，确定用于完全酶切法制备DNA Marker的所述单酶切位点对应的酶；

(3)选择高拷贝数质粒作为骨架载体并在其中引入所述同尾酶对中任意一个同尾酶的酶切位点和一个所述单酶切位点，构建完成的骨架载体中，所述同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一；

(4)制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，并分别连接到中间载体中获得各DNA Marker前体片段的中间载体，这些片段两端为所述同尾酶对的酶切位点，中间包含一个所述单酶切位点，各DNA Marker前体片段中所述单酶切位点离片段某一端的距离一致，且各DNA Marker前体片段中该端的同尾酶酶切位点相同，在构建完成的中间载体中，所述同尾酶对中任一同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一；

(5)将中间载体中的各DNA Marker前体片段依次连接起来，构建到步骤(3)制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述同尾酶对应的酶切位点应不同于所述单酶切位点。

11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)为：分别以步骤(4)获得的各DNA Marker前体片段的中间载体为起点，反复利用同尾酶酶切及拼接的方式获得含有各DNA Marker前体片段串联重复片段的中间载体，直至各DNA Marker前体片段的中间载体中，DNA Marker前体片段的拷贝数达到设计要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式，将含有符合设计DNA Marker前体片段拷贝数要求的各中间载体中的DNA Marker前体片段拼接入步骤3制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

12.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述同尾酶对选自BamH I/BglII/Bcl I中的任意两个，Spe I/Xba I/Nhe I中的任意两个，Nco I/Pci I或Sal I/Xho I。

13.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述中间载体选自：pUC18，pUC19，pUC57，pBR322，pUCm-T，pSG-TS，pMD18-T或pMD19-T。

14.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述单酶切位点为II型限制性内切酶酶切位点。

15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述单酶切位点选自HindIII、EcoR I、BamH I或Pst I的酶切位点。

16.如权利要求9-15任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小。

17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，组成目标DNA Marker的各大小不同的片段在该质粒中的拷贝数与该片段的长度有关，要达到同样信号强度，长度越小的片段在质粒中的拷贝数越高。

18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，某DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数与该DNA Marker片段长度的乘积，比上另一DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数与该另一DNAMarker片段长度的乘积获得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段与所述另一DNA Marker片段的信号强度比值。

19.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的关系为：各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的乘积一致。

20.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒的DNA序列为SEQ ID NO：1。

21.一种DNA Marker的制备方法，包括下列步骤：

A.采用权利要求9-20任一权利要求所述制备方法构建用于制备DNAMarker的质粒；或者直接采用权利要求1-8任一权利要求所述用于DNAMarker制备的质粒；

B.将步骤A所述质粒转入合适的宿主菌后扩增质粒；

C.分离质粒并采用所述单酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切质粒获得DNA Marker。

22.如权利要求21所述一种DNA Marker的制备方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。

23.如权利要求21所述一种DNA Marker的制备方法，其特征在于，步骤A所述质粒为序列为SEQ ID NO：1的质粒，步骤B所述宿主菌为大肠杆菌，步骤C所述限制性内切酶为Hind III。

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