CN103276004A

CN103276004A - 一种DNA marker质粒及其制备与应用

Info

Publication number: CN103276004A
Application number: CN2013100663058A
Authority: CN
Inventors: 孔凡静; 王素莲; 王乾
Original assignee: Biological Engineering (shanghai) Ltd By Share Ltd
Current assignee: Biological Engineering (shanghai) Ltd By Share Ltd
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-03-01
Also published as: CN103276004B

Abstract

本发明公开了一种DNA marker质粒及其制备与应用。本发明的DNA marker质粒为双链闭合环状DNA分子，所述DNA marker质粒的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。本发明由于选择了高拷贝复制子pUC ori，使质粒抽提得率提高，且由于人工合成的全序列的高度可变性，使重组DNA marker质粒不含有重复序列，提高了质粒的稳定性，并且使重组DNA marker质粒以最小的长度涵盖最多酶切现象可能性。

Description

一种DNA marker质粒及其制备与应用

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域，具体涉及一种全新的通用DNA marker质粒及其制备与应用。

背景技术

DNA marker是基因工程实验中必不可少的用于指示DNA片段大小的最常用的试剂。DNA片段与标准DNA marker在同一块琼脂糖凝胶中电泳，通过DNA迁移率比较，即可估计出目标DNA片段的大小。

目前常用的DNA marker制备有两种方法，PCR扩增和酶切质粒。

PCR扩增法是最常用的。虽然工作简单，但是重复成本高，长片段扩增效率低，并且还需要在回收后根据产物的亮度合理配比以达到最佳效果。可重复性差。

酶切质粒的方法前期投入大，但是可以在前期设计的时候充分考虑各个分子量大小的浓度配比，使得酶切后的各分子量级别浓度达到最佳状态。并且产品各批次之间的基本没有差异。

常规的DNAmarker酶切质粒设计方案是，同一个基因片段重复插入到一个载体中，以积累达到特定的量，使得各分子量级别浓度达到最佳状态。但是这样构建的重组质粒有一个严重的问题，即重组质粒的稳定性存在问题。因为重组质粒中的高度重复片段影响了质粒的稳定性。重复序列的一个共同特征是长片段显著的遗传不稳定性，具体表现为这些重复序列更易发生长片段的扩增或删除(称为动力学突变)，这种不稳定性的分子机制目前还并不十分清楚。研究表明异常的DNA二级结构可能起重要作用，这些重复序列易于形成三倍体DNA、发夹或十字形结构．

与此同时，以前报道构建的DNAmarker重组质粒，都是一个质粒用一种酶切，得到特定条带。之后通过不同质粒酶切现象的组合得到一个产品。这就无形中增加了重组质粒的个数，增加了DNAmarker重组质粒的抽提个数。于降低工作成本，规范生产流程不利。

发明内容

本发明针对现有的酶切质粒获得DNA marker的弊端，设计了一种通用重组DNA marker质粒。

本发明通过下述技术方案解决了上述问题：

重组DNA marker质粒选择高拷贝复制子作为质粒的复制位点，提高了质粒抽抽提的得率。该质粒本身不含有影响稳定性的多片段重复序列，构建的质粒不超过10kb，降低了质粒抽提的难度，提高了重组质粒的稳定性。本发明在不影响重组DNA marker质粒复制子和抗性筛选标记的前提下，引入了SacI，SalI，XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI,BamHI等酶切位点，保证用任意一种设计的内切酶单酶切，均能得到不同的符合要求的酶切现象，且酶切片段大小误差不超过2%。

本发明一方面公开了一种DNA marker质粒，为双链闭合环状DNA分子，所述DNA marker质粒的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

本发明的DNA marker质粒中包括下列限制性酶切位点：SacI，SalI,XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI。

本发明的DNA marker质粒使用不同的限制性内切酶酶切，可得到不同的分子量标记，且分子量标记质粒序列不是简单的序列重复序列。

本发明第二方面公开了所述DNA marker质粒的制备方法，包括下列步骤：

A.制备母本质粒M1，所述母本质粒M1为将全长核苷酸序列为SEQ NO.1的双链DNA分子用AflII酶切后，自身环化获得；

B.合成全长序列为SEQ ID NO.2的双链DNA分子M2，用NdeI/AflII酶切后，克隆到母本质粒M1上，获得本发明的DNA marker质粒。

本发明第三方面公开了所述DNA marker质粒在DNA marker制备中的应用。

本发明第四方面公开了一种DNA marker，为将所述DNA marker质粒经选自SacI,SalI,XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI的任一种限制性内切酶单一酶切后获得，或者经选自SacI,SalI,XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI中的两种以上的限制性内切酶单一酶切后将酶切产物混配获得。

本发明的有益效果是：

1.由于选择了高拷贝复制子pUC ori，使质粒抽提得率提高。

2.由于人工合成的全序列的高度可变性，使重组DNA marker质粒不含有重复序列，提高了质粒的稳定性。

3.由于人工合成的全序列的高度可变性，使重组DNA marker质粒以最小的长度涵盖最多酶切现象可能性。

附图说明

图1：重组DNA marker质粒酶切位点分配图

图2：重组DNA marker质粒单酶切效果图

图3：重组DNA marker质粒母本载体图

图4：M1质粒在Amp+培养基中生长情况

图5：重组DNA marker质粒全长载体图

图6：重组DNA marker质粒酶切混合效果图

具体实施方式

以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例中，转化用大肠杆菌DH5a（推广后不限于lacZ基因缺陷型大肠杆菌）采用的是氯化钙转化法；所用限制性内切酶、连接酶、引物及其他试剂，消耗品等均为生工生物（sangon）产品。

如未作特别注明，本实施例中所用的PCR反应体系为：

反应程序：95℃for3min，（94℃for20sec，55℃for30sec，72℃for90sec）×30cycles，72℃for5min。

如未作特别注明，本实施例中所用的PCR产物或酶切产物均用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色后于紫外线下观察。

如未作特别注明，本实施例中所用的限制性内切酶反应体系为：

反应条件为：37℃for3hour

如未作特别注明，本实施例中所用的DNA连接反应体系为：

反应条件为：22℃for1hour

如未作特别注明，本实施例中所用的转化菌株为大肠杆菌DH5a。

实施例中，设计重组DNA marker质粒方案做了如下考虑：

一．将重组DNA marker质粒酶切现象分为九组，命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I，酶切现象如下所示（详图请见图1）：

A：100bp、300bp、500bp、700bp、900bp

B：200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp

C：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp

D：500bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp

E：100bp、500bp、1000bp、1500bp、2000bp

F：100bp、500bp、900bp、1100bp、1500bp

G：500bp、1000bp、2000bp

H：100bp、3000bp、5000bp

I：100bp、8000bp

二．调整各个条带的亮度配比，确定各个条带所占比例大小，并确定重组质粒大小为8300bp（详图请见图1）。

A：1800bp(100*18)、1800bp(300*6)、1500bp(500*3)、1400bp(700*2)、1800bp(900*2)

B：1800bp(200*9)、2000bp(400*5)、1800bp(600*3)、1600bp(800*2)、1000bp(1000*1)

C：1800bp(100*18)、2000bp(250*8)、2000bp(500*4)、1500bp(750*2)、1000bp(1000*1)

D：1500bp(500*3)、2000bp(1000*2)、1200(1200*1)、1500(1500*1)、2000(2000*1)

E：300bp(100*3)、2500bp(500*5)、2000bp(1000*2)、1500(1500*1)、2000(2000*1)

F：1300bp(100*13)、1500bp(500*3)、1800(900*2)、2200bp(1100*2)、1500(1500*1)

G：2000(500*4)、2000(1000*2)、4000(2000*2)

H：300bp(100*3)、3000bp(3000*1)、5000bp(5000*1)

I：300bp(100*3)、8000bp(8000*1)

三．选择各种酶切现象酶切所需的限制性内切酶（详图请见图1）。

为确保选择的PUC ori序列不发生改变，同时保证抗性基因（Amp+）和抗性基因启动子能够起作用，我们在该Amp+基因内部做了同义突变，修改成符合要求的酶切位点。另在序列中设计两个BpiI位点，为以后修改，扩充重组DNA marker质粒之用。

酶切现象A，用SacI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入31个SacI位点；

酶切现象B，用SalI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入23个SalI位点；

酶切现象C，用XhoI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入33个XhoI位点；

酶切现象D，用XbaI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入11个XbaI位点；

酶切现象E，用EcoRI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入12个EcoRI位点；

酶切现象F，用BglII单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入21个BglII位点；

酶切现象G，用HindIII单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入21个HindIII位点；

酶切现象H，用KpnI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入5个KpnI位点；

酶切现象I，用BamHI单酶切获得，重组DNA marker质粒中引入4个BamHI位点；

实施例1：DNA marker质粒的构建

一．构建自身环化母本质粒M1（如SEQ ID NO.1，图3）

人工化学合成M1全长序列SEQ ID NO.1，之后用AflII酶切，自身环化得母本质粒M1。

该母本质粒转化大肠杆菌DH5a，在Amp+抗性培养基中生长良好（图4），证明抗性基因中序列的改变，并没有影响其功能。符合实验要求。

二．构建重组DNA marker质粒全长（如SEQ ID NO.3，图5）

人工化学合成M2全长序列SEQ ID NO.2，之后用NdeI/AflII酶切，克隆到母本质粒M1NdeI/AflII酶切位点之间。获得全长重组DNA marker质粒SEQ ID NO.3。经测序验证，结果符合预期。

实施例2重组DNA marker质粒的酶切验证与Marker产品制备

重组DNA marker质粒的酶切验证：

实施例1构建的DNA marker质粒分别采用SacI，Sal I，XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI酶切，获得酶切现象A-I。

Marker产品制备：

一．酶切现象A与B混合，得到100bp到1000bp的Marker（如图6BSM0241所示）。

二．酶切现象C、D混合，得到100bp到2000bp的Marker（如图6DL2000所示）。

三．酶切现象A、B、D、H、I混合，得到100bp到8000bp的Marker（如图6BSM0258所示）。

使用不同的酶切组合方式，可以得到任意符合要求的Marker,其中最小条带为100bp，最大条带为8000bp，基本涵盖了所有DNA Marker条带，能够满足常规分子生物学实验。

实施例3重组质粒稳定性验证

将构建完毕的重组DNAmarker质粒，重复多次转化。质粒拷贝数高，抗性筛选明显，酶切现象均正常，证明该质粒非常稳定。

Claims

1.一种DNA marker质粒，为双链闭合环状DNA分子，所述DNA marker质粒的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述DNA marker质粒的制备方法，包括下列步骤：

3.如权利要求1所述DNA marker质粒在DNA marker制备中的应用。

4.一种DNA marker，为将权利要求1所述DNA marker质粒经选自SacI,SalI,XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI的任一种限制性内切酶单一酶切后获得，或者经选自SacI,SalI,XhoI,XbaI,EcoRI,BglII,HindIII,KpnI和BamHI中的两种以上的限制性内切酶单一酶切后将酶切产物混配获得。