CN102181430A - 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法 - Google Patents

制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102181430A
CN102181430A CN2011100476442A CN201110047644A CN102181430A CN 102181430 A CN102181430 A CN 102181430A CN 2011100476442 A CN2011100476442 A CN 2011100476442A CN 201110047644 A CN201110047644 A CN 201110047644A CN 102181430 A CN102181430 A CN 102181430A
Authority
CN
China
Prior art keywords
restriction enzyme
primer
sequence
recognition sequence
pcr amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011100476442A
Other languages
English (en)
Inventor
谢云飞
解博红
徐光翠
李小英
闫清华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinxiang Medical University
Original Assignee
Xinxiang Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinxiang Medical University filed Critical Xinxiang Medical University
Priority to CN2011100476442A priority Critical patent/CN102181430A/zh
Publication of CN102181430A publication Critical patent/CN102181430A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本发明中，根据骨架载体上预期插入的多克隆位点设计两对引物，以含有目的基因的DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物，将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到目的DNA片段(两端带有相应限制性内切酶的粘性末端，中间为目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架载体的预期多克隆位点。与传统PCR产物克隆方法相比，本发明所提供的克隆方法简单易行，成本低，效率高，通用性好，可以广泛应用于PCR产物的快速定向克隆。

Description

制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法
技术领域
本发明涉及一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。
背景技术
自PCR技术问世以来，适应PCR产物测序、改造和表达等需要，先后出现了多种克隆方法，包括在引物中引入完整酶切位点克隆法[Scharf S.J.，Horn G.T.& ErlichH.A.(1986)Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplifiedgenomic sequences.Science，233，1076-1078.]、无需连接反应的克隆方法[Aslanidis C.& de Jong P.J.(1990)Ligation-independent cloning of PCRproducts(LIC-PCR).Nucleic Acids Res.，18(20)：6069-6074.]、T载体克隆法[Marchuk D.，Drumm M.，Saulino A.& Collins F.S.(1991)Construction ofT-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts.Nucleic Acids Res.19(5)：1154.]、平末端连接法[Liu Z.G.& SchwartzL.M.(1992)An efficient method for blunt-end ligation of PCR products.Biotechniques.12(1)：28，30.]、Hetero-stagger克隆技术[Liu Z.(1996)Hetero-stagger cloning：efficient and rapid cloning of PCR products.NucleicAcids Res.24(12)：2458-2459.]、autosticky PCR技术[Gál J.，Schnell R.，SzekeresS.& Kálmán M.(1999)Directional cloning of native PCR products with preformedsticky ends(autosticky PCR).Mol Gen Genet.260(6)：569-573.]、无酶克隆法[Tillett D.& Neilan B.A.(1999)Enzyme-free cloning：a rapid method to clonePCR products independent of vector restriction enzyme sites.Nucleic Acids Res.27(19)：e26.]、嵌合引物克隆法[Chen G.J.，Qiu N.& Page M.P.(2002)Universalrestriction site-free cloning method using chimeric primers.Biotechniques.32(3)：516，518-520.]、3GC克隆技术[Zheng D.，Liu X.& Zhou Y.(2008)3GC cloning：PCR products cloning mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase.AnalBiochem.378(1)：108-110.]等。这些方法各具特色，但也均存在各种局限性。
以第一种克隆方法为例，该方法最早被用于PCR产物的克隆，目前仍然是最流行的一种克隆技术。该方法存在两个明显缺陷：首先，多种II型限制性DNA内切酶对位于DNA末端的识别位点切割效率很低，需要在引物的5’端添加较长的保护碱基才能有效切割PCR产物，但添加过长的保护碱基可能会影响PCR扩增效果；其次，插入片段内含的限制酶位点会影响克隆位点的选择，一些较长的PCR产物可能会含有较多种限制酶位点，不能方便地连接到载体中，实验人员为克隆不同的PCR产物往往需要准备多种不同的内切酶，增加了克隆的难度和费用。
使用较广的另一种克隆方法-T载体克隆法，同样存在两大不足：其一，此方法只能用于保真度最低的DNA聚合酶-Taq酶扩增产物的克隆，高保真DNA聚合酶(如Pfu、Vent酶等)扩增产物的末端为平末端，不能直接克隆到T载体中；其二，目前商用的各种T载体一般只能作为克隆载体，而不能作为表达载体，对于需要表达的基因，必须进行二次克隆，费时费力，而且在二次克隆时，同样需要考虑表达载体上是否有合适的克隆位点。
后来发明的其它各种克隆方法，虽然能够不同程度地解决以上两种方法固有的问题，但自身或多或少存在效率低、成本高、周期长、技术复杂等不同的缺点，没有一种能够像前两种方法那样得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备可用于定向克隆的两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。
本发明提供的制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链DNA片段的方法(孪生PCR)，包括如下步骤：
(1)制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成；所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；
(2)用所述引物对甲PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物甲；用所述引物对乙PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物乙；
(3)将所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段。
步骤(3)中，所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙最好等摩尔混合。
所述限制性内切酶甲的切割位点可位于所述限制性内切酶甲的识别序列内；所述限制性内切酶乙的切割位点可位于所述限制性内切酶乙的识别序列内。
步骤(1)中，所述限制性内切酶识别序列均指的是5′→3′单链。步骤(3)中，所述限制性内切酶识别序列均指的是双链。
以上任一所述方法均可用于构建重组载体。
本发明还保护一种制备重组载体的方法，包括如下步骤：
(1)用所述限制性内切酶甲和所述限制性内切酶乙酶切出发质粒，回收载体骨架；所述出发质粒中含有所述限制性内切酶甲的识别序列和所述限制性内切酶乙的识别序列；
(2)将用以上任一所述方法制备的5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段与步骤(1)得到的载体骨架连接，得到重组载体。
本发明还保护引物对甲和引物对乙组成的引物组合物；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列。
本发明中，根据骨架载体上预期插入的多克隆位点设计两对引物，以含有目的基因的DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物，将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到目的DNA片段(两端带有相应限制性内切酶的粘性末端，中间为目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架载体的预期多克隆位点。与传统PCR产物克隆方法相比，本发明所提供的克隆方法(孪生PCR克隆法)不需使用限制酶处理PCR产物，即可得到含有任意限制酶粘性末端的DNA片段，出发载体的多克隆位点全部可以使用，无需考虑目的基因中是否含有与载体多克隆位点相同的酶切位点，因而可轻松实现目的基因的定向克隆。本发明所提供的克隆方法简单易行，成本低，效率高，通用性好，可以广泛应用于PCR产物的快速定向克隆。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。泳道1：DNA分子量标准；泳道2：PCR扩增产物甲；泳道3：PCR扩增产物乙。
图2为用PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙得到混合DNA片段(DNA片段I、DNA片段II、DNA片段III和DNA片段IV)的示意图。
图3为质粒pFLAG-CMV2多克隆位点示意图。
图4为10个阳性克隆中质粒的酶切鉴定。
图5为重组质粒pFLAG-CMV2-PCGF1的部分测序结果。A中的EcoR I为上游克隆位点，B中的EcoR I为PCGF1内含的EcoR I位点。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA片段的浓度。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有引物合成及测序工作均由英潍捷基(上海)贸易有限公司北京办事处完成。Deep Vent DNA聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自New England Biolabs公司。Taq DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司。人白细胞cDNA文库购自美国Clontech公司，产品目录号为638821。质粒pFLAG-CMV2为Sigma公司产品，产品目录号为E7398(其多克隆位点示意图见图3)。大肠杆菌DH5α为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为CB101-03。实施例中用于培养大肠杆菌的培养基均为LB培养。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、应用孪生PCR定向克隆
一、引物设计
根据多梳环指1(polycomb group ring finger 1，PCGF1)基因(PCGF1基因)的mRNA序列(GenBank NM_032673；相应的DNA见序列表的序列1，编码序列为序列表的序列1自5′末端第27至806位核苷酸)设计两对引物，FL/RS引物对(由上游长引物FL和下游短引物RS组成)和FS/RL引物对(由上游短引物FS和下游长引物RL组成)。FL/RS引物对和FS/RL引物对的靶序列(与PCGF1基因相应的序列)相同。
上游长引物FL：5′-AATTCTAAGATGGC GTCTCCTCAGG-3′(下划线部分为限制性内切酶EcoRI识别序列中切割位点下游的全部序列，斜体字母
Figure BDA0000048236350000041
为
Figure BDA0000048236350000042
基因的起始密码子)；
下游短引物RS：5′-TACCTCCTCTTCTCTTTCAC-3′(下划线部分为限制性内切酶Bgl II识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列，斜体字母
Figure BDA0000048236350000043
对应
Figure BDA0000048236350000044
基因的终止密码子TAG的一部分)。
上游短引物FS：5′-CTAAGATGGCGTCTCCTCAGG-3′(下划线部分为限制性内切酶EcoRI识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列，斜体字母为
Figure BDA0000048236350000046
基因的起始密码子)；
下游长引物RL：5′-GATCTACCTCCTC TTCTCTTTCAC-3′(下划线部分为限制性内切酶Bgl II识别序列中切割位点下游的全部序列，斜体字母
Figure BDA0000048236350000047
对应
Figure BDA0000048236350000048
基因的终止密码子TAG)。
限制性内切酶EcoRI的识别序列为5′-GˇAATTC-3′(ˇ标注切割位点)。
限制性内切酶Bgl II的识别序列为5′-AˇGATCT-3′(ˇ标注切割位点)。
二、制备带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段
以人白细胞cDNA文库为模板，用FL/RS引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。以人白细胞cDNA文库为模板，用FS/RL引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。
PCR反应体系由模板、10×缓冲液、dNTPs、上游引物、下游引物、Deep Vent DNA聚合酶和去离子水组成；dNTPs的浓度为125μmol/L，上游引物的浓度为200nmol/L，下游引物的浓度为200nmol/L，每40μL反应体系中含有50ng模板、1单位Deep VentDNA聚合酶和4μL 10×缓冲液。
PCR反应程序：
94℃    5分钟
Figure BDA0000048236350000051
72℃    3分钟
PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙的1％琼脂糖凝胶电泳图见图1。
分别回收PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙，测序。测序结果表明：PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙均为788bp；PCR扩增产物甲的5′端比PCR扩增产物乙的5′端多4个核苷酸，3′端则比PCR扩增产物乙少4个核苷酸，其余序列完全相同。
将PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙等摩尔混合，94℃变性4分钟，然后65℃退火2分钟，得到DNA片段混合物。PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙变性后得到四种DNA单链，DNA单链随机组合，产生四种理论上等比例的DNA片段(DNA片段I、DNA片段II、DNA片段III和DNA片段IV)，见图2(直线省略区域为序列表的序列1所示的PCGF1基因)。DNA片段III和DNA片段IV为杂交DNA片段，DNA片段III具有5′粘性末端，DNA片段IV具有3′粘性末端。DNA片段III的5′端具有EcoR I粘性末端，3′端则具有BglII粘性末端。
如果分别采用FL/RL引物对(由上游长引物FL和下游长引物RL组成)和FS/RS引物对(由上游短引物FS和下游短引物RS组成)对序列表的序列1所示的PCGF1基因进行PCR扩增，两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，则可得到一端具有5′突出端，另一端具有3′突出端的杂交分子，从而适应不同限制性内切酶的需要。
三、构建重组质粒
1、用限制性内切酶EcoR I和Bgl II双酶切质粒pFLAG-CMV2，回收载体骨架。
2、将步骤二得到的DNA片段混合物与步骤1的载体骨架混合(DNA片段和载体骨架的摩尔比为4∶1)，加入T4 DNA连接酶，16℃连接过夜(DNA片段混合物中的四种DNA片段，只有DNA片段III具有和载体骨架互补的粘性末端从而能够与载体骨架定向连接，其它三种均不能与载体骨架定向连接)。
3、将步骤2的连接产物通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选抗性克隆。
4、挑取十个抗性克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoR I酶切鉴定(质粒pFLAG-CMV2和DNA片段III中各含有一个EcoR I位点，含有DNA片段III的重组子可以切出383bp的片段)，结果见图4。结果表明所挑的十个克隆全部为重组子。
5、将酶切鉴定为阳性的质粒进行测序鉴定。测序结果见图5。测序结果表明，得到的阳性质粒均为重组质粒pFLAG-CMV2-PCGF1(在质粒pFLAG-CMV2的EcoR I和BglII酶切位点之间插入了序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒)。
实施例2、孪生PCR克隆效率的检测
一、采用孪生PCR制备重组质粒
1、以实施例1制备的重组质粒pFLAG-CMV2-PCGF1为模板，分别用FL/RS引物对和FS/RL引物对进行PCR扩增(PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1的步骤二)，得到两种PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的两种PCR扩增产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别切胶回收788bp的DNA片段。
3、将步骤2的回收的两种DNA片段混合(两种DNA片段均为262ng)，94℃变性4分钟，然后65℃退火2分钟，得到DNA混合物。
4、用限制性内切酶EcoR I和BglII双酶切质粒pFLAG-CMV2，回收载体骨架。
5、取DNA混合物(DNA总量为52.4ng，理论上DNA片段I、DNA片段II、DNA片段III和DNA片段IV各13.1ng)与载体骨架(DNA总量为77.2ng)进行连接(DNA片段与载体骨架的摩尔比为4∶1，其中每种DNA片段与载体骨架的摩尔比均为1∶1)。
6、将步骤5的连接产物通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，统计形成的克隆数。
7、随机挑选20个克隆，利用菌落PCR筛选重组子(采用FL/RS引物对，目的片段长788bp)，计算重组子所占的比例。
8、为了验证菌落PCR的特异性，从步骤7中随机挑选6个阳性克隆，碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶EcoR I酶切鉴定(重组质粒可切出383bp的片段)。
二、借助T载体制备重组质粒
1、以实施例1制备的重组质粒pFLAG-CMV2-PCGF1为模板，用FL/RS引物对和FS/RL引物对分别进行PCR扩增(PCR反应体系采用的聚合酶为Taq DNA聚合酶，其它组分同实施例1的步骤二；PCR反应程序同实施例1的步骤二)，得到两种PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的两种PCR扩增产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收788bp的DNA片段，等质量混合。
3、将步骤2混合后的DNA片段(DNA总量为13.1ng)与pGEM-T(pGEM-T载体试剂盒，Promega公司，按说明书推荐的最佳条件进行连接；DNA总量为50ng)4℃连接过夜。
4、将步骤3的连接产物通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含100μg/mL氨苄青霉素并在表面涂布了4μL 200mg/mL IPTG和40μL 20mg/mL X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选(选择白斑)，统计形成的白色克隆数。
5、随机挑选20个克隆，利用菌落PCR筛选重组子(采用FL/RS引物对，目的片段长788bp)，计算重组子所占的比例。
三、对照
将质粒pFLAG-CMV2(DNA总量为1ng)通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，统计形成的克隆数，三次平均实验中，平均每次产生431个克隆，表明大肠杆菌DH5α感受态细胞没有问题。随机挑选20个克隆，利用菌落PCR筛选重组子(采用FL/RS引物对，目的片段长788bp)，计算重组子所占的比例，为0％。
三、步骤一和步骤二的克隆效率比较
在两种克隆方法(步骤一的方法和步骤二的方法)中，进行酶连反应所用的外源DNA的摩尔数相同(即步骤一的5中所用的DNA片段III和步骤二的3中所用的DNA片段的摩尔数相同)，载体的摩尔数相同(即步骤一的5中所用的pFLAG-CMV2载体骨架和步骤二的3中所用的pGEM-T的摩尔数相同)。
孪生PCR克隆法(步骤一的方法)三次平均实验中，平均每次产生147个克隆。随机挑选的20个克隆中，重组子为18个，比例为90％。
T载体克隆法(步骤二的方法)三次平均实验中，平均每次产生94个克隆。随机挑选的20个克隆中，重组子为20个，比例为100％。
可见两种方法中，孪生PCR克隆法获得重组子的效率高于T载体克隆法，孪生PCR克隆法获得重组子的阳性率低于T载体克隆法(主要是因为T载体克隆法所筛选的克隆已经预先经过了蓝白斑筛选，大量非重组克隆(蓝色克隆)已经被排除在外)。
Figure IDA0000048236430000011

Claims (6)

1.一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链DNA片段的方法，包括如下步骤：
(1)制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成；所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；
(2)用所述引物对甲PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物甲；用所述引物对乙PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物乙；
(3)将所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙等摩尔混合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述限制性内切酶甲的切割位点位于所述限制性内切酶甲的识别序列内；所述限制性内切酶乙的切割位点位于所述限制性内切酶乙的识别序列内。
4.权利要求1或2或3所述方法在构建重组载体中的应用。
5.一种制备重组载体的方法，包括如下步骤：
(1)用权利要求1所述限制性内切酶甲和权利要求1所述限制性内切酶乙酶切出发质粒，回收载体骨架；所述出发质粒中含有权利要求1所述限制性内切酶甲的识别序列和权利要求1所述限制性内切酶乙的识别序列；
(2)将用权利要求1或2或3所述方法制备的5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段与步骤(1)得到的载体骨架连接，得到重组载体。
6.引物对甲和引物对乙组成的引物组合物；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列。
CN2011100476442A 2011-02-28 2011-02-28 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法 Pending CN102181430A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011100476442A CN102181430A (zh) 2011-02-28 2011-02-28 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011100476442A CN102181430A (zh) 2011-02-28 2011-02-28 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102181430A true CN102181430A (zh) 2011-09-14

Family

ID=44567718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011100476442A Pending CN102181430A (zh) 2011-02-28 2011-02-28 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102181430A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559660A (zh) * 2012-01-17 2012-07-11 生工生物工程(上海)有限公司 一种制备带有突出末端的双链dna分子的方法
CN103555763A (zh) * 2013-11-15 2014-02-05 新乡医学院 Il-2和mart-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
CN104805072A (zh) * 2015-04-20 2015-07-29 徐州医学院 一种基于pcr制备粘性未端dna组装产物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419937A (zh) * 2001-11-21 2003-05-28 武汉大学 一种免疫防龋dna疫苗及制备方法和应用
CN101358963A (zh) * 2007-08-01 2009-02-04 中国计量学院 一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法
CN101402967A (zh) * 2008-11-13 2009-04-08 山东农业大学 多基因聚合辅助载体pCR35STnos的构建方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419937A (zh) * 2001-11-21 2003-05-28 武汉大学 一种免疫防龋dna疫苗及制备方法和应用
CN101358963A (zh) * 2007-08-01 2009-02-04 中国计量学院 一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法
CN101402967A (zh) * 2008-11-13 2009-04-08 山东农业大学 多基因聚合辅助载体pCR35STnos的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN ET AL.: "Presence of an inducible HIV-1 latent reservoir during highly active antiretroviral therapy", 《PROC. NATL. ACAD. SCI. USA)》 *
CHUN ET AL.: "Presence of an inducible HIV-1 latent reservoir during highly active antiretroviral therapy", 《PROC. NATL. ACAD. SCI. USA)》, vol. 94, 30 November 1997 (1997-11-30), pages 13193 - 13197, XP002973106, DOI: doi:10.1073/pnas.94.24.13193 *
XIE BOHONG，ET AL.: "Twin PCRs: a simple and efficient method for directional cloning of PCR products", 《WORLD J MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
XIE BOHONG，ET AL.: "Twin PCRs: a simple and efficient method for directional cloning of PCR products", 《WORLD J MICROBIOL BIOTECHNOL》, 30 January 2011 (2011-01-30), pages 2223 - 2225, XP019937704, DOI: doi:10.1007/s11274-011-0670-1 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559660A (zh) * 2012-01-17 2012-07-11 生工生物工程(上海)有限公司 一种制备带有突出末端的双链dna分子的方法
CN103555763A (zh) * 2013-11-15 2014-02-05 新乡医学院 Il-2和mart-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
CN103555763B (zh) * 2013-11-15 2015-11-04 新乡医学院 Il-2和mart-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
CN104805072A (zh) * 2015-04-20 2015-07-29 徐州医学院 一种基于pcr制备粘性未端dna组装产物的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Universal TA cloning
US9862991B2 (en) Gene synthesis process, gene chip and kit
CN105400809A (zh) 一种克隆载体及其制备与应用
CN101935670B (zh) 一种多引物直接退火构建rna干扰载体的方法
CN104593354A (zh) 一种基于体外组合组装快速定向进化dna的方法
CN114524879B (zh) 一种高效的植物广靶向腺嘌呤单碱基编辑器及其构建与应用
CN102181430A (zh) 制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的dna片段的方法
CN105420225A (zh) 基于硫代修饰的碘酒裂解型基因克隆方法
CN103589743A (zh) Gibson组装载体及其制备方法和应用
CN103114102A (zh) 一种多基因载体组装方法与应用
WO2023230991A1 (zh) 新型闭合线性双链dna的体外制备技术
CN101177697B (zh) 一种制备核酸分子量标的方法
CN102876701A (zh) 一种含有NusA蛋白融合标签的快速克隆及表达质粒载体
CN102628057A (zh) 一种无背景定向克隆pcr产物的载体及制备方法和应用
CN102321660A (zh) 一种dna克隆方法
CN107974448B (zh) 一种序列复杂基因的合成方法
WO2017217444A1 (ja) 二本鎖ｄｎａ末端の加工方法
CN103205449B (zh) 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法
Moradpour et al. Evaluation of pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit to clone multiple fragments of Elaeis guineensis DNA
CN101805747B (zh) 一种重复模块基因拼接方法
JP2015525567A5 (zh)
CN102899317A (zh) 一种快速高效增加质粒上基因片段的方法
CN106434719A (zh) 基于牛痘拓扑异构酶i的零背景载体构建方法
CN108220314A (zh) Dna片断与载体快速连接转化的新方法及其应用
CN101333538B (zh) 一种前t载体及其制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110914