WO2017217444A1 - 二本鎖ｄｎａ末端の加工方法 - Google Patents

二本鎖ｄｎａ末端の加工方法 Download PDF

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WO2017217444A1
WO2017217444A1 PCT/JP2017/021913 JP2017021913W WO2017217444A1 WO 2017217444 A1 WO2017217444 A1 WO 2017217444A1 JP 2017021913 W JP2017021913 W JP 2017021913W WO 2017217444 A1 WO2017217444 A1 WO 2017217444A1
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dna
double
base
amino acid
acid sequence
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PCT/JP2017/021913
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English (en)
French (fr)
Inventor
嘉行 大坪
裕二 永田
雅孝 津田
Original Assignee
国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a DNA fragment whose end has been processed.
  • Non-patent Document 1 a method of allowing Taq polymerase or the like, which is a DNA replication enzyme, to act.
  • Taq polymerase a product obtained by adding one adenine (A) to the 3 ′ end of the blunted double-stranded DNA end is ligated to an adapter DNA in which thymine (T) is projected at the 3 ′ end.
  • T thymine
  • the DNA ligated to the adapter DNA is subjected to base sequence determination by a sequencer provided by Illumina Corporation or Pacific Biosciences Inc., etc., either through PCR amplification or without PCR amplification.
  • DNA polymerase to project one base at the end of DNA and using it for ligation reaction and the like is widely used as a DNA processing technique for TA-cloning and the like.
  • Terminal deoxynucleotidyl transferase is also used as an enzyme that adds a base to the 3 'end of the smoothed double-stranded DNA.
  • TdT catalyzes a reaction of polymerizing deoxynucleotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) at the 3 ′ end of single-stranded or double-stranded DNA. In this case, a large number of 30 to 60 bases are added. And this number cannot be controlled.
  • the overhanging ends of DNA can also be created by restriction enzyme treatment, but each restriction enzyme cleaves only a specific recognition sequence, so there are great restrictions.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for adding a base to double-stranded DNA.
  • Another object of the present invention is to add a base complementary to such a base to the 3 ′ end of one or both strands in a double-stranded DNA in which a base is added to the 3 ′ end of one or both strands. It is to provide a novel method for ligating double-stranded adapter DNA.
  • Another object of the present invention is to provide a novel kit for preparing a double-stranded DNA in which a base is added to the 3 'end of one or both strands.
  • the reverse transcriptase of Moloney murine leukemia virus is a known DNA polymerase known to synthesize complementary DNA strands from single-stranded RNA.
  • Reverse transcriptase MMLV
  • A adenine
  • C cytosine
  • G guanine
  • T thymine
  • Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (ii) one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein that is deleted and / or inserted and has an effect of adding a base to double-stranded DNA (iii) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Or (iv) using a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1) having an identity of 40% or more and having a base addition action on double-stranded DNA, A DNA comprising the addition of any of the following bases (1) to (6) to the 3 ′ end of one or both strands of the double-stranded DNA is prepared. The law is provided.
  • a Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, at the 3 ′ end of one or both strands, (ii) represented by SEQ ID NO: 1 A protein in which one or two or more amino acids are substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence to be added, and has an action of adding a base to double-stranded DNA, (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 90% A protein comprising an amino acid sequence having the above identity, or (iv) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1) and having an amino acid sequence having 40% or more identity, and The above-mentioned (7) to (12) are added to the double-stranded DNA to which any one of the following (7) to (12) is added using a protein having a base addition action.
  • a DNA in which the double-stranded adapter DNA is linked is prepared.
  • a method is provided.
  • Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (ii) A protein having one or more amino acid substitutions, deletions and / or insertions in the amino acid sequence represented and having the effect of adding a base to double-stranded DNA, (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 90 A protein comprising an amino acid sequence having at least% identity, or (iv) comprising an amino acid sequence having at least 40% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1), to a double-stranded DNA
  • the above-mentioned (13) to (1) are added to the double-stranded DNA to which any one of the following (13) to (18) is added using the protein having the base addition action of A DNA to which double-stranded DNA is bound, which comprises ligating a double-stranded adapter DNA having
  • a kit for preparing a double-stranded DNA comprising (i) a Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (ii) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 (Iii) an amino acid having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid is substituted, deleted and / or inserted, and
  • about 1 to 4 adenine and thymine can be added to double-stranded DNA, and about 1 to 20 can be easily added to cytosine and guanine.
  • adapter DNA having an arbitrary sequence can be ligated to double-stranded DNA with high efficiency using such an addition reaction.
  • A 70 bp blunt end DNA fragment labeled with FAM
  • B Adenine added to DNA fragment of (A)
  • C Cytosine added to DNA fragment of (A)
  • D of (A) A guanine addition reaction to a DNA fragment, and a thymine addition to (E) and (A) DNA fragment.
  • the graph which shows the fragment
  • the product of (C) is blunt-ended with KOD DNA polymerase.
  • the graph which shows the fragment
  • Lane 3 reaction product obtained by adding an adapter sequence to a DNA fragment using a guide adapter oligonucleotide (GAO) after the guanine addition reaction.
  • Lane 4 100 bp marker.
  • A 70 bp blunt end DNA fragment labeled with FAM,
  • B guanine-added to (A) DNA fragment, and
  • Lane 1 300 bp PCR product prepared using KOD DNA polymerase.
  • Lane 2 Reaction product obtained by performing guanine addition reaction at the 3 ′ end of this DNA fragment.
  • Lane 3 Product obtained by performing a ligation reaction with T mix1-4 which is an equal mixture of four types of double-stranded adapter DNAs T1 to T4 after the adenine addition reaction.
  • Lane 4 Product obtained by performing a ligation reaction with G mix1-4 , which is an equal mixture of four types of double-stranded adapter DNAs G1 to G4 after the cytosine addition reaction.
  • Lane 5 product of ligation reaction with C mix1-4 , which is an equal mixture of four types of double-stranded adapter DNAs C1 to C4 after guanine addition reaction.
  • Lane 6 products were A Mix1-4 and ligation reaction is an equal mixture of double stranded adapters four after thymine addition reaction DNA A1 ⁇ A4.
  • Bilateral lane 100 bp marker.
  • A 70 bp blunt-ended DNA fragment labeled with FAM
  • the graph which shows the fragment
  • the vertical axis represents signal intensity, and the horizontal axis represents time.
  • A Unreacted size control
  • B When there is no additive,
  • C Add dAMP,
  • D Add dCMP,
  • E Add dGMP,
  • F Add dTMP.
  • G When G is added to the blunt end of double-stranded DNA,
  • C when deoxycytidine monophosphate is added
  • the vertical axis represents signal intensity, and the horizontal axis represents time.
  • (A) cytosine, (B) guanine, (C) C thymine is added to the DNA fragment.
  • the concentration of the additive in the reaction solution is shown in parentheses.
  • the vertical axis represents signal intensity
  • the horizontal axis represents time.
  • complementary does not necessarily need to be completely complementary, and one or both of complementary nucleic acid sequences are substituted, added and / or deleted with a plurality of bases. Means that it may be included.
  • a base is added to a DNA strand means that its constituent element is obtained by adding deoxynucleoside monophosphate to a DNA strand, particularly using deoxynucleoside triphosphate as a material. Means that a base is added.
  • “1 to N” means any one of 1 to N integers.
  • “1 to 10” means 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the present invention uses Moloney murine leukemia virus (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV) reverse transcriptase or a mutant protein thereof, and the following (1) at the 3 ′ end of one or both strands of double-stranded DNA:
  • a method for producing DNA, comprising adding any of the bases of (6) to (6) is provided.
  • Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase is a known DNA polymerase known to synthesize complementary DNA strands from single-stranded RNA. Conventionally, it was thought that MMLV reverse transcriptase had no action of adding a base to the 3 ′ end of DNA to form a protruding portion (overhang).
  • a natural Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (accession number NP 95591, SEQ ID NO: 1), as well as mutant proteins thereof can be used.
  • mutant protein refers to (Ii) a protein in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and have a base addition action on double-stranded DNA; (Iii) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) an amino acid sequence having 40% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a protein having an action of adding a base to double-stranded DNA.
  • the number of amino acid substitutions, deletions and / or insertions in (ii) is preferably 1 to 200, more preferably 1 to 100, more preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, more The number is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5.
  • the number of bases added to the double-stranded DNA of (ii) is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1, 2, 3, or 4.
  • a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used to increase the activity of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, for example, to increase the effect of adding bases to the double-stranded DNA of the mutant protein. Or deletion for the purpose of reducing, improving certain properties of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, or other purposes.
  • the mutant protein of (iii) has 90% or more identity, preferably 92% or more identity, more preferably 95% or more identity, and more preferably 96% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is a protein consisting of an amino acid sequence having identity, more preferably 98% or more identity, more preferably 99% or more identity.
  • the mutant protein of (iv) has 40% or more identity, preferably 50% or more identity, more preferably 60% or more identity, more preferably 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Identity, more preferably greater than 80% identity, more preferably greater than 85% identity, more preferably greater than 90% identity, more preferably greater than 92% identity, more preferably greater than 95%. Addition of a base to double-stranded DNA, comprising an amino acid sequence having identity, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more It is protein which has.
  • the number of bases added to the 3 'end of the double-stranded DNA can be changed depending on the reaction time, DNA concentration, etc., and the number of added bases can be confirmed by fragment analysis using a capillary sequencer.
  • the number of bases to be added is 1 to 4 for adenine and thymine, and 1 to 20 for cytosine and guanine, but preferably 2 to 4 for adenine and thymine. Is more preferred and 2 is even more preferred.
  • the number of cytosine and guanine is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and even more preferably 2 to 4.
  • the addition reaction may produce a mixture of double-stranded DNA with multiple bases added (for example, double-stranded DNA with one guanine added and double-stranded DNA with two guanines added. And double-stranded DNA to which three guanines are added simultaneously), and double-stranded DNA to which two bases are added at the 3 ′ end are the other number of bases (one, three, or The case where double-stranded DNA added at 4) coexists is also included in the scope of the present invention.
  • a base is added to the 3 'end of both strands of the double-stranded DNA, but a base may be added to the 3' end of either strand of the double-stranded DNA.
  • the number of bases (1) to (6) is as follows. (1) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (2) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive cytosines (C) (3) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive guanines (G) (4) 1, 2, 3, or 4 thymines (T) (5) 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive bases, 2 of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) Combination of more than species (6) Modified base of any one of (1) to (5)
  • bases are easily added to DNA in the order of adenine (A), guanine (G), thymine (T), and cytosine (C), but guanine (G) and cytosine (C) are preferable in terms of specificity. And guanine (G) is more preferred.
  • the base added to the 3 'end may be added directly to the 3' end of one or both strands of the double-stranded DNA, or may be added indirectly.
  • one adenine is added to the 3 ′ end of one or both strands of double-stranded DNA having a blunt end with Taq polymerase, and then one or both of the double-stranded DNAs to which such adenine is added or Any one of the above bases (1) to (6) may be added to the 3 ′ ends of both strands using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof. Such a case is also included in the scope of the present invention.
  • the base added to the 3 'end may be any of the modified bases (1) to (5) above.
  • the modified base is not particularly limited as long as it is a base that can be added to the 3 ′ end of one or both strands of double-stranded DNA, but adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) O-alkylated (eg, O-methylated), O-alkoxyalkylated (eg, O-methoxymethylated), O-azidomethylated, O-oximed, O-allylated, and fluorinated , Amination, thiolation, those labeled with a fluorescent dye, and the like.
  • O-methylated bases have been found to have an uptake activity by MMLV reverse transcriptase (Metzker et al. Vol22, No.20 4259-4267).
  • Double-stranded DNA may be DNA obtained from natural sources (eg, cells, tissues, or organs of various organisms) or synthesized according to standard DNA synthesis methods well known to those skilled in the art. It may be what was done. Examples of organisms include prokaryotes, eukaryotes, plants, animals, and the like.
  • the double-stranded DNA is preferably a double-stranded DNA having a blunt end before the addition of a base. Double-stranded DNA may be further chemically or enzymatically modified.
  • Examples of the chemical modification include side chain methylation, biotinylation, dephosphorylation, phosphorylation, fluorescent labeling (fluorescein, rhodamine, Texas red and derivatives thereof), dideoxylation, phosphorothioation and the like.
  • Examples of the enzymatic modification include methylation, biotinylation, dephosphorylation, phosphorylation, fluorescent labeling (fluorescein, rhodamine, Texas red and derivatives thereof), and enzyme labeling (alkaline phosphatase etc.).
  • Mn 2+ promotes the addition of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) and promotes the addition reaction of each base.
  • A adenine
  • C cytosine
  • G guanine
  • T thymine
  • Mn 2+ is provided in the form of a manganese salt such as MnCl, and the concentration in the reaction solution is preferably 0.1 to 100 mM, more preferably 0.5 to 10 mM.
  • the method for producing the DNA of the present invention comprises adding a base to the 3 ′ end of one or both strands of double-stranded DNA in the presence of the Mn 2+ and a compound that promotes the addition of the base. Can be promoted by
  • dATP deoxynucleoside triphosphate
  • dCTP deoxynucleoside triphosphate
  • dGTP dGTP
  • dTTP material for adding a base to double-stranded DNA
  • the compound that promotes the addition of a base is preferably a compound that pairs with the base, and more preferably a base, nucleoside, or nucleotide that pairs with the base.
  • a preferred promoting compound is a nucleotide having a guanine, guanosine or deoxyguanosine, guanosine or deoxyguanosine (monophosphate, diphosphate or triphosphate) These cyclized products or derivatives thereof having an action of promoting the addition of a base.
  • Preferred examples include guanosine, guanosine monophosphate, guanosine diphosphate, guanosine triphosphate, deoxyguanosine, deoxyguanosine monophosphate, deoxyguanosine diphosphate, deoxyguanosine triphosphate, cyclic guanosine monophosphate.
  • Guanine. More preferably the facilitating compound is guanosine, guanosine monophosphate, guanosine diphosphate, guanosine triphosphate, deoxyguanosine, deoxyguanosine monophosphate, guanine, even more preferably guanosine monophosphate, guanosine diphosphate. Or deoxyguanosine.
  • Deoxyguanosine and deoxyguanosine monophosphate are particularly suitable for adding 1 to 4 C atoms.
  • guanosine monophosphate and guanosine diphosphate are suitable.
  • these guanine, nucleoside or nucleotide containing guanine, or a derivative thereof promotes the addition reaction of C by transient Watson-click pairing with dCTP as a material of the added base. I think that.
  • the concentration of guanine, a nucleoside or nucleotide containing guanine, or a promoting compound that is a derivative thereof in the reaction solution may vary depending on the compound, but is preferably 0.1 to 100 mM.
  • the concentration of guanosine in the reaction solution is preferably about 20-40%, more preferably about 40% of the saturated concentration of guanosine.
  • the concentration of guanosine monophosphate is preferably 0.1 to 100 mM, most preferably about 2 mM to 20 mM, and most preferably about 10 mM.
  • the concentration of guanosine diphosphate is preferably 0.1-100 mM, preferably about 2 mM to about 10 mM, and most preferably about 5 mM.
  • the concentration of guanosine triphosphate is preferably about 2 mM.
  • the concentration of deoxyguanosine is preferably about 30 to about 50%, more preferably about 40% of the saturated concentration of deoxyguanosine.
  • the concentration of deoxyguanosine monophosphate is preferably about 5 mM to about 30 mM, most preferably about 10 mM.
  • the concentration of guanine is preferably about 2 mM.
  • preferred promoting compounds are adenine, adenosine or deoxyadenosine, adenosine or deoxyadenosine-containing nucleotides (monophosphate, diphosphate, or triphosphate) These cyclized products or derivatives thereof having an action of promoting the addition of a base.
  • Preferred examples include adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, deoxyadenosine, deoxyadenosine monophosphate, deoxyadenosine diphosphate, deoxyadenosine triphosphate, cyclic adenosine monophosphate. And adenine. More preferably the promoting compound is adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, deoxyadenosine, deoxyadenosine monophosphate, adenine, and even more preferably adenosine and deoxyadenosine.
  • these adenine, adenine-containing nucleoside or nucleotide, or a derivative thereof promotes the T addition reaction by transient Watson-click pairing with dTTP, which is the material of the added base. I think that.
  • the concentration of the adenine, a nucleoside or nucleotide containing adenine, or a promoting compound that is a derivative thereof in the reaction solution may vary depending on the compound, but is preferably 0.1 to 100 mM.
  • the concentration of adenosine is preferably about 20-40%, most preferably about 40% of the saturating concentration of adenosine.
  • the concentration of deoxyadenosine is preferably about 30 to about 40%, most preferably about 40% of the saturated concentration of deoxyadenosine.
  • the concentration of adenosine diphosphate is preferably 1 mM to 10 mM, most preferably about 5 mM.
  • the concentration of adenosine monophosphate is preferably 0.1-100 mM, preferably about 2 mM to about 20 mM, and most preferably about 10 mM.
  • the concentration of deoxyadenosine monophosphate is preferably about 5 mM to about 20 mM, and most preferably about 10 mM.
  • the concentration of adenine is preferably 10 mM.
  • the concentration of adenosine triphosphate is preferably 2 mM.
  • the preferred promoting compound is a nucleotide having a cytosine, cytidine or deoxycytidine, cytidine or deoxycytidine (monophosphate, diphosphate, or triphosphate)
  • cytosine a nucleotide having a cytosine, cytidine or deoxycytidine, cytidine or deoxycytidine (monophosphate, diphosphate, or triphosphate)
  • cytosine a nucleotide having a cytosine, cytidine or deoxycytidine, cytidine or deoxycytidine (monophosphate, diphosphate, or triphosphate)
  • the facilitating compound is cytidine, cytidine monophosphate, cytidine diphosphate, cytidine triphosphate, deoxycytidine, deoxycytidine monophosphate, cytosine, and even more preferably deoxycytidine and cytidine.
  • Deoxycytidine is suitable for adding 6 or less G, and cytidine is suitable for adding 5 or less G.
  • Cytidine diphosphate is suitable when adding 5 or more Cs or adding bases one by one using a reversibly blocked modified base.
  • these cytidine, nucleoside or nucleotide containing cytidine, or a derivative thereof promotes G addition reaction by transient Watson-Crick pairing with dGTP which is the material of the added base. I think that.
  • the concentration of cytidine, a nucleoside or nucleotide containing cytidine, or a derivative thereof in the reaction solution may vary depending on the compound, but is preferably 0.1 to 1000 mM.
  • the concentration of cytidine is preferably 0.1-100 mM, more preferably about 30 mM to about 70 mM, and most preferably about 50 mM.
  • the concentration of cytidine monophosphate is preferably about 0.1 to about 100 mM, more preferably 5 mM to 30 mM, and most preferably about 30 mM.
  • the concentration of cytidine diphosphate is preferably about 1 to about 10 mM, more preferably about 2 mM.
  • the concentration of cytidine triphosphate is preferably about 1 to about 10 mM, more preferably about 2 mM.
  • the concentration of deoxycytidine is preferably about 100 mM to about 300 mM, most preferably about 200 mM.
  • the concentration of deoxycytidine monophosphate is preferably about 0.1 to about 100 mM, more preferably about 5 mM to about 30 mM, and most preferably about 15 mM.
  • the concentration of cytosine is preferably about 0.1 to about 100 mM, more preferably about 10 mM.
  • a preferred promoting compound When the base to be added to the 3 ′ end of the double-stranded DNA is adenine, a preferred promoting compound has thymine; 5-methyluridine, thymidine, uridine, or deoxyuridine 5-methyluridine, thymidine, uridine, or deoxyuridine These are nucleotides (monophosphate, diphosphate, or triphosphate), cyclized products thereof, or derivatives thereof having an action of promoting the addition of a base.
  • these thymines, nucleosides containing thymine, or nucleotides, or derivatives thereof, promote the addition reaction of A by transient Watson-Crick pairing with dATP, which is the material of the added base. I think that.
  • the concentration of thymine, a nucleoside or nucleotide containing thymine, or a promoting compound that is a derivative thereof in the reaction solution may vary depending on the compound, but is preferably 0.1 to 100 mM.
  • the present invention further provides a double strand wherein one or both strands are added with any of the following bases (7) to (12) using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof:
  • a single-stranded adapter DNA consisting of a base having a base complementary to any of the bases (7) to (12) at the 3 ′ end and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof is used as the strand DNA.
  • the number of bases (7) to (12) is as follows. (7) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (8) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive cytosines (C) (9) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive guanines (G) (10) 1, 2, 3, or 4 thymines (T) (11) 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive bases, 2 of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) Combination of two or more species (12) The modified base of any one of (7) to (11)
  • the single-stranded adapter DNA is connected to the 3 ′ end by 1 to 10 consecutive adenines (A). It has 1 to 10 cytosines (C), 1 to 10 guanines (G), 1 to 10 thymines (T) or any modified bases thereof. In another preferred embodiment, the single stranded adapter DNA has 3 or more consecutive adenine (A), 2 or more consecutive cytosine (C), 2 or more consecutive guanine (G) at the 3 ′ end. , Having two or more consecutive thymines (T) or any modified bases thereof.
  • the upper limit of the base is preferably 10 or less, more preferably 6 or less.
  • the single stranded adapter DNA is 1-6 adenine (A), 1-6 cytosine (C), 1-6 guanine (G), 1-6 at the 3 ′ end. Of thymine (T) or any modified base thereof.
  • the single stranded adapter DNA is 2-6 adenine (A), 2-6 cytosine (C), 2-6 guanine (G), 2-6 at the 3 ′ end. Having one thymine (T) or any modified base thereof.
  • the single stranded adapter DNA has 2-6 cytosine (C), 2-6 guanine (G), or any modified bases thereof at the 3 'end.
  • the oligonucleotide constituting the complementary base at the 3 'end of the single-stranded adapter DNA may be formed from deoxyribonucleotides, or may be partially or wholly formed from ribonucleotides.
  • single-stranded adapter DNA is composed of 1 to 10 consecutive adenines (A), 1 to 10 cytosines (C), 1 to 10 guanines (G), and 1 to 10 thymines at the 3 ′ end. All of the oligonucleotides constituting (T) or any modified base thereof may be deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • the case where a part of the single-stranded adapter DNA is composed of ribonucleotides is also included in the term “single-stranded adapter DNA”.
  • a double strand can be extended by synthesizing a complementary strand DNA using a single strand adapter DNA having an arbitrary short base sequence as a template (reaction (2) in FIG. 2).
  • the base of any one of (7) to (12) is protruded from the 3 ′ end of double-stranded DNA having a blunt end (reaction (1) in FIG. 2), and then the MMLV reverse transcriptase Is used to synthesize a complementary strand DNA using as a template a single-stranded adapter DNA having an arbitrary short base sequence having a base sequence complementary to the protruding base and the 3 ′ end being a deoxy end.
  • a method for producing the double-stranded DNA to which the complementary strand DNA is added by dissociating the DNA from the complementary strand DNA is also provided.
  • the single-stranded adapter whose 3 ′ end is the deoxy end and the double-stranded DNA having the above blunt end can be dissociated from double-stranded DNA having sticky ends complementary to it.
  • the lower limit of the total length of the single-stranded adapter DNA is preferably 4 bases or more, for example, 8 bases or more, 12 bases or more, 16 bases or more, or 20 bases or more.
  • the upper limit of the total length of the single-stranded adapter DNA is preferably 100 bases or less, more preferably 75 bases or less.
  • the base protruding from the 3 ′ end of the double-stranded DNA and at least a part of the base at the 3 ′ end of the single-stranded adapter DNA are complementary, preferably one base added to the double-stranded DNA 2, 3, 4, 5, or 6 guanine (G), and the single-stranded adapter DNA has 1 to 10 cytosines (C) at the 3 ′ end or double-stranded
  • the base added to the DNA is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 cytosine (C)
  • the single-stranded adapter DNA converts 1 to 10 guanines (G) into 3 'Has at the end.
  • the addition efficiency of double-stranded adapter DNA prepared using single-stranded adapter DNA as a template to double-stranded DNA is preferably 90% or more.
  • the single-stranded adapter DNA has the sequence represented by N 1 N 2 N 3 ... N n, N 1, N 2, N 3 ... N n may each be the same or different Adenine, cytosine, guanine, or thymine is shown.
  • n is an integer, preferably an integer of 1 to 100, more preferably 4 to 30. That is, the single-stranded adapter DNA contains n bases in one molecule, and each of the n bases is the same or different and is adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • the base in one molecule may be one type, two types, three types, or four types of adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • the single-stranded adapter DNA is a mixture of DNAs containing equal amounts of adenine, cytosine, guanine, and thymine with respect to N.
  • the single-stranded adapter DNA has a so-called mixed base structure, the single-stranded DNA has different sequences called molecular tags in this portion.
  • the DNA to which the adapter DNA is bound is amplified by PCR etc., if the fact that the DNA molecule originally derived from the same DNA molecule has the same sequence in this part is removed, the influence of non-uniform PCR amplification is eliminated. Data can be analyzed.
  • Single stranded adapter DNA may be DNA obtained from natural sources (eg, cells, tissues, or organs of various organisms) or processed versions thereof, or standards well known to those skilled in the art. It may be synthesized according to a typical DNA synthesis method. Examples of organisms include prokaryotes, eukaryotes, plants, animals, and the like.
  • the single-stranded adapter DNA may be further chemically modified or enzymatically modified. Chemical or enzymatic modification is as described above for double-stranded DNA. It is preferable to introduce a phosphorothioate group at the 3 'end of the single-stranded adapter DNA because degradation of the single-stranded adapter during the reaction is suppressed. In addition, it is preferable that the 3 ′ end of the single-stranded adapter DNA is deoxy-terminated because the single-stranded adapter DNAs can be prevented from annealing and causing an extension reaction by reverse transcriptase.
  • the present invention further provides a double strand in which any one of the following bases (13) to (18) is added to the 3 ′ end of one or both strands using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof:
  • Ligase is used to ligate DNA with a double-stranded adapter DNA in which a base complementary to any of the bases (13) to (18) is added to the 3 ′ end of one or both strands.
  • the present invention provides a method for producing DNA linked with double-stranded adapter DNA (FIG. 3).
  • the number of bases (13) to (18) is as follows. (13) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (14) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive cytosines (C) (15) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive guanines (G) (16) 1, 2, 3, or 4 thymines (T) (17) 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive bases, 2 of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) Combination of Species or More (18)
  • the modified base of any one of (13) to (17) described above is obtained by combining 1 to 4 consecutive adenines (A) at the 3 ′ end of one or both strands. It has an overhang of 1 to 20 consecutive cytosines (C), 1 to 20 consecutive guanines (G), 1 to 4 consecutive thymines (T) or any modified bases thereof.
  • the base of any one of (13) to (16) is projected at the 3 ′ end of the double-stranded DNA having a blunt end, and a double-stranded adapter DNA having a 3′-protruding end complementary thereto is then obtained.
  • the double-stranded adapter DNA is added to the double-stranded DNA with high efficiency that could not be achieved conventionally.
  • the base added to the 3 ′ end of one or both strands of double-stranded DNA is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive guanines (G) Whether the double stranded adapter DNA has 1, 2, 3, 4, 5 or 6 consecutive cytosines (C) at the 3 ′ end corresponding to the 3 ′ end of the double stranded DNA
  • the double-stranded adapter DNA has one, two, three, four, five, or six consecutive cytosines (C) added to one or both strands of the double-stranded DNA.
  • a phosphate group is added to the 5 'end of the double-stranded adapter DNA.
  • the addition efficiency of the double-stranded adapter DNA to the double-stranded DNA is preferably 90% or more.
  • Double-stranded adapter DNA may be DNA obtained from natural sources (eg, cells, tissues, or organs of various organisms) or processed versions thereof, or standard well known to those skilled in the art. It may be synthesized according to a typical DNA synthesis method. Examples of organisms include prokaryotes, eukaryotes, plants, animals, and the like.
  • the double-stranded adapter DNA may be further chemically modified or enzymatically modified. Chemical or enzymatic modification is as described above for double-stranded DNA.
  • the double-stranded adapter DNA may further have a restriction enzyme cleavage site.
  • restriction enzymes include AluI, Eco47III, EcoRV, FspI, HpaI, MscI, NruI, PvuII, RsaI, ScaI, SmaI, SspI, StuI, ThaI, AvaI, BamHI, BanII, BglII, ClaI, EcoRI, HindIII, HpaII , KpnI, MseI, NcoI, NdeI, NotI, PstI, PvuI, SacI / SstI, SalI, XbaI, XhoI, and I-CeuI, but are not limited thereto.
  • the present invention further provides a kit for preparing a double-stranded DNA in which any one of the following bases (19) to (24) is added to the 3 ′ end of one or both strands:
  • a kit including a first container that accommodates Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof.
  • the number of bases (19) to (24) is as follows. (19) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (20) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive cytosines (C) (21) 1, 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive guanines (G) (22) 1, 2, 3, or 4 thymines (T) (23) 2, 3, 4, 5, or 6 consecutive bases, 2 of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) Combination of at least species (24) Modified base according to any one of (19) to (23)
  • the kit includes deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate
  • a second container containing at least one of (dGTP) and deoxythymidine triphosphate (dTTP) may be further provided.
  • At least one of deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), and deoxythymidine triphosphate (dTTP) is the above (19) to (24 ) To be used as a component of the base to be added.
  • the kit of the present invention may further comprise a compound that promotes the addition of the above-mentioned base.
  • the type and concentration of the accelerating compound are as described above.
  • the promoting compound may be contained in the second container, or may be contained in a third container different from the first container and the second container.
  • Kits of the present invention further, MnCl 2, may be provided, such as additional reagents necessary for the addition of a base to double-stranded DNA (e.g., buffer).
  • a person skilled in the art can add one type of base.
  • DNA using one type of deoxynucleotide dATP for adding adenine, dCTP for adding cytosine, dGTP for adding guanine, dTTP for adding thymine.
  • dATP deoxynucleotide
  • dCTP deoxynucleotide
  • dGTP cytosine
  • dTTP for adding thymine
  • Deoxynucleotides can be polymerized at the 3 ′ end of.
  • one kind of base or a combination of two or more kinds of bases As will be understood by those skilled in the art, for example, after a base is protruded using a modified base whose 3 ′ end is reversibly blocked with a functional group such as an azidomethyl group, the block is removed, A double-stranded DNA in which any one of unmodified adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) protrudes at the 3 ′ end is prepared, and then further to this The modified base having the 3 ′ end reversibly blocked is extended, unblocked, and further one of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T). Extend the same or different base as the previous base By returning Ri can be added GG, AG, AG, GA, CG, CA etc., the base in
  • Example 1 Method for preparing 70 bp DNA labeled with FAM at one end
  • a 300 bp DNA fragment was PCR amplified with a FAM (6-carboxyfluorescein hydrate) labeled primer.
  • a 70 bp blunt end DNA fragment produced by treating this with PvuII was purified from polyacrylamide gel (FIG. 4).
  • a phosphate group is attached to the 5 ′ end of the DNA fragment not labeled with FAM.
  • Example 2 Addition of A, C, G or T to the blunt end of double-stranded DNA
  • the reaction product (E) subjected to the thymine addition reaction was used for fragment analysis using a capillary sequencer. Each reaction, 10nM DNA, 2mM MnCl 2, and each 4mM of dATP, dCTP, in the presence of each of dGTP, and dTTP, were carried out for 60 minutes at 37 ° C..
  • each DNA sample was heat-denatured at 96 degrees for 4 minutes in addition to HiDi Formamide (ThermoFisher SCIENTIFIC) previously mixed with LIZ500 size standard, and analyzed with an Applied Biosystems model 3130xl sequencer.
  • HiDi Formamide ThermoFisher SCIENTIFIC
  • Example 3 The analysis results are shown in FIG.
  • the blue line represents the signal according to FAM and the orange line represents the signal according to the LIZ500 size standard.
  • the fragment analysis of Examples 3, 4, and 6 was also performed under the same conditions and apparatus as in Example 2.
  • Example 3 Ligation of Adapter DNA to the End of Double-Stranded DNA Using Single-Stranded DNA
  • GAO guide adapter oligonucleotide
  • SARTScribe TM MMLV reverse transcriptase
  • the GAO used is adapter oligonucleotide 1 (also referred to as SA577): 5′-GACGTGTGCTCTTCGATCTCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 2).
  • the guanine addition reaction was performed at 30 ° C. for 15 minutes under the conditions of 50 nM DNA, 2 mM MnCl 2 , 4 mM dGTP.
  • 0.1 pmol of the reaction product of (B) guanine addition reaction and 2 pmol of SA577 were used, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Example 4 Ligation of Adapter DNA to the End of Double-Stranded DNA Using Single-Stranded DNA
  • GEO guide adapter oligonucleotide
  • Scribe TM MMLV reverse transcriptase
  • the GAO used is adapter oligonucleotide 2 (also referred to as SA617): 5′-GTGAACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCCATCTNNNNNNNNNC * C * CdOH-3 ′ (SEQ ID NO: 3).
  • the dOH at the 3 ′ end of the sequence is deoxy-terminal, and * represents a phosphorothioate group.
  • the guanine addition reaction was performed at 30 ° C. for 1 hour under the conditions of 100 nM DNA, 4 mM MnCl 2 and 4 mM dGTP.
  • Example 5 Confirmation of ligation of adapter DNA to the end of double-stranded DNA using single-stranded DNA by SYBR Green staining 300 bp PCR product (lane 1) prepared using KOD DNA polymerase, 3 of this DNA fragment 'Reaction product (lane 2) subjected to guanine addition reaction using MMLV reverse transcriptase (SMARTScribe TM , Takara Bio Inc.) at the end, and guide adapter oligonucleotide (GAO) and MMLV reverse transcriptase after guanine addition reaction
  • the reaction product (lane 3) in which the adapter sequence was ligated to the DNA fragment using the above and 100 bp marker (lane 4) were electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel and photographed after SYBR Green staining.
  • the guanine addition reaction was performed at 30 ° C. for 40 minutes under the conditions of 50 nM DNA, 4 mM MnCl 2 and 4 mM dGTP.
  • 0.1 pmol of guanine addition reaction product and 2 pmol of SA577 were used, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
  • the results are shown in FIG.
  • the image is obtained by processing one electrophoretic image, and the black vertical line indicates a portion where the images are pasted together.
  • bands of the PCR product and the reaction product after the guanine addition reaction were observed, and in lane 3, two bands were observed.
  • the small band seen in lane 3 is a product with GAO added to one end and the large band to both ends.
  • Example 6 Ligase Ligation of Double-stranded Adapter DNA to the End of Double-stranded DNA 70 bp blunt-end DNA fragment (A) labeled with FAM at one end, MMLV inverted at the 3 ′ end of this DNA fragment C mix1 which is an equal mixture of the reaction product (B) subjected to guanine addition reaction using a photoenzyme (SMARTScribe TM , Takara Bio Inc.) and four kinds of double-stranded adapter DNAs C1 to C4 after the guanine addition reaction -4 and products ligation reaction was performed with (C), it was used to fragment analysis by capillary sequencer. The guanine addition reaction was performed at 30 ° C.
  • the sequences of the double-stranded adapter DNAs C1 to C4 are as shown below.
  • P represents a phosphate group.
  • Example 7 Confirmation of ligation of double-stranded adapter DNA to the end of double-stranded DNA by SYBR Green staining 300 bp PCR product prepared using KOD DNA polymerase (lane 1), MMLV at the 3 ′ end of this DNA fragment A reaction product (lane 2) subjected to a guanine addition reaction using reverse transcriptase (SMARTScribe TM , Takara Bio Inc.), a mixture of equal amounts of four types of double-stranded adapter DNAs T1 to T4 after the adenine addition reaction.
  • STYScribe TM reverse transcriptase
  • the product of ligation reaction with mix1-4 (lane 3), the product of ligation reaction with G mix1-4 , which is an equal mixture of four types of double-stranded adapter DNA G1 to G4 after the cytosine addition reaction (lane 4) ), C mix1-4 the ligation reaction is a mixture of equal amounts after guanine addition reaction four double-stranded adapter DNA C1 ⁇ C4 Been product (lane 5), the product subjected to A Mix1-4 and ligation reaction is an equal mixture of double-stranded adapter DNA A1 ⁇ A4 of four after thymine addition reaction (lane 6) and 100bp markers (both sides of the Lane) was ligated with 10% polyacrylamide gel and photographed after SYBR Green staining.
  • the cytosine addition reaction, guanine addition reaction and thymine addition reaction were carried out at 30 ° C. for 45 minutes under the conditions of 4 mM MnCl 2 , 10 nM DNA, 4 mM dCTP, dGTP or dTTP.
  • the adenine addition reaction was carried out under the same conditions in the presence of dATP in a reaction solution not containing MnCl 2 .
  • T mix1-4, G mix1-4, C mix1-4 , A mix1-4 is, T from one DNA end of the DNA of 20bp in SEQ ID NO: 9, G, C, what A is 1-4 bases projecting Equal amounts are mixed.
  • C mix1-4 is as described in the sixth embodiment.
  • the sequences of the double-stranded adapter DNAs T1 to T4, G1 to G4, and A1 to A4 are as shown below.
  • P represents a phosphate group.
  • Example 8 Addition of modified base to the end of double-stranded DNA
  • AMS1 contains a nucleotide in which the 5-position of the pyrimidine base of thymidine is modified with a fluorescent dye and an azidomethyl group is added to the 3 ′ end of the sugar, and the base contains four types of modified bases.
  • a 70 bp blunt end DNA fragment (A) labeled with FAM at one 5 ′ end, the DNA fragment and the solution of AMS1 were mixed with Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase in the presence of 4 mM MnCl 2 at 30 ° C. for 30 minutes.
  • the reacted product (B) and the product (C) obtained by reacting this product with the contents of well 4 (crivage mix) of Reagent Tray in the above kit for 30 minutes at 65 ° C. were used for fragment analysis using a capillary sequencer. .
  • Example 9 Effect of Additives that Promote Base Addition
  • a 70-bp blunt-ended DNA fragment labeled with FAM at one 5 ′ end described in Example 1 was subjected to wild-type MMLV reverse transcriptase (M-MLV Reverse Transcriptase, Nippon Gene Co., Ltd.), in the presence of 4 mM MnCl 2 , each of 4 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP was used for 5 minutes at a temperature exceeding 30 ° C. with A, C, G and T addition reactions. It was.
  • the reaction product was used for fragment analysis using a capillary sequencer.
  • Example 10 Comparison of the effect of the presence or absence of an additive that promotes the addition of a base
  • a 280 bp blunt-ended DNA fragment obtained by amplifying with a FAM-labeled primer and FAM-labeled on the other 5 ′ end was inverted to a wild-type MMLV.
  • G addition reaction was performed at 30 ° C. in the presence of 4 mM MnCl 2 and 4 mM dGTP.
  • Example 11 Examination of types of additives that promote the addition of bases
  • a 70 bp blunt-ended DNA fragment labeled with FAM at one 5 ′ end was ligated with wild-type MMLV reverse transcriptase (M-MLV).
  • M-MLV wild-type MMLV reverse transcriptase
  • Reverse Transcriptase Nippon Gene Co., Ltd.
  • 4 mM MnCl 2 and 4 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP respectively.
  • the reaction solution was used for fragment analysis. The results are shown in FIG.
  • guanosine, guanosine monophosphate, guanosine diphosphate, guanosine triphosphate, deoxyguanosine, deoxyguanosine monophosphate and guanine have a promoting effect on the addition of cytosine.
  • cytidine, cytidine monophosphate, cytidine diphosphate, cytidine triphosphate, deoxycytidine, deoxycytidine monophosphate and cytosine have a promoting effect on the addition of guanine.
  • adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, deoxyadenosine, deoxyadenosine monophosphate, and adenine have a promoting effect on the addition of thymine.
  • Example 12 Additives that Promote Up to 20 Additions
  • a 70 bp blunt-ended DNA fragment labeled with FAM at one 5 ′ end was ligated to wild-type MMLV reverse transcriptase (M-MLV Reverse Transcriptasee).
  • B) to (D) were subjected to addition of C
  • (E) and (F) were subjected to addition of G at 30 ° C. for 2 hours in the presence of 4 mM MnCl 2 . .
  • (A) was carried out before the reaction, (C) in the presence of 5 mM guanosine monophosphate, and (D) in the presence of 10 mM guanosine diphosphate.
  • the present invention can also employ the following configurations.
  • a method for producing DNA comprising adding (1) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (2) 1-20 consecutive cytosines (C) (3) 1 to 20 consecutive guanines (G) (4) 1, 2, 3, or 4 consecutive thymines (T) (5) a combination of 2 or more of 2 to 20 consecutive bases among adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) (6) said (1) The modified base of any one of (5) to [5] The added base is 2, 3, or 4 adenine (A); 2, 3, 4, 5, or 6 The cytosine (C); 2, 3, 4, 5 or 6 guanine (G); or 2, 3, or 4 thymine (T) Method.
  • the base in any one of (7) to (12) is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 guanine (G), and the single-stranded adapter DNA is 1 to 10 cytosines (C) at the 3 ′ end, or one, two, three, four, five or six bases of any of (7) to (12) above
  • the method according to Item 5 wherein the single-stranded adapter DNA is cytosine (C) and has 1 to 10 guanines (G) at the 3 ′ end.
  • the length of the single-stranded adapter DNA is 4 bases or more and 100 bases or less.
  • [Item 9] The method according to any one of [Item 5] to [Item 7], wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 8 bases or more.
  • [Item 10] The method according to any one of items [5] to [7], wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 12 bases or more.
  • [Item 11] The method according to any one of Items 5 to 7, wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 16 bases or more.
  • [Item 12] The method according to any one of items [5] to [7], wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 20 bases or more.
  • [Item 13] The method according to any one of [Item 5] to [Item 12], wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 100 bases or less.
  • [Item 14] The method according to any one of [Item 5] to [Item 12], wherein the length of the single-stranded adapter DNA is 75 bases or less.
  • [Claim 15] The single-stranded adapter DNA has the sequence represented by N 1 N 2 N 3 ... N n, N 1, N 2, N 3 ... N n may each be the same or different 15.
  • [Item 16] The method according to any one of items [5] to [15], wherein the addition of a base to the double-stranded DNA is performed in the presence of a compound that promotes the addition of the base.
  • [Claim 17] The method according to any one of [Claim 5] to [Claim 16], Dissociating the single-stranded adapter DNA from the complementary-stranded DNA, and producing a double-stranded DNA to which the complementary-stranded DNA has been added.
  • [Item 18] Double-stranded DNA in which any one of the following bases (13) to (18) is added to the 3 ′ end of one or both strands using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof: And ligating a double-stranded adapter DNA having a base complementary to any of the bases (13) to (18) added to the 3 ′ end of one or both strands using ligase.
  • a method for producing DNA in which double-stranded DNA is bound (13) 1, 2, 3, or 4 consecutive adenines (A) (14) 1-20 consecutive cytosines (C) (15) 1-20 consecutive guanines (G) (16) 1, 2, 3, or 4 consecutive thymines (T) (17) A combination of 2 or more of 2 to 20 consecutive bases selected from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or thymine (T) (18) Any one of the modified bases of (17) to [17], wherein any one of the bases of (13) to (18) is 1, 2, 3, or 4 adenine (A);
  • the double-stranded adapter DNA has 1, 2, 3, or 4 thymines (T) at the 3 ′ end,
  • the base of any one of (13) to (18) is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 guanine (G)
  • the double-stranded adapter DNA is 1, 2 Have 3, 4, 5, or 6 cytosines (C) at the 3 ′ end, The base of any
  • the base in any one of (7) to (12) is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 guanine (G)
  • the double-stranded adapter DNA is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 cytosine (C) at the 3 ′ end, or one or two bases of any of (7) to (12) above 3, 4, 5, or 6 cytosine (C)
  • the double-stranded adapter DNA comprises 1, 2, 3, 4, 5, or 6 guanines (G).
  • Item 16 The method according to Item 15 having at the 3 ′ end.
  • kits for preparing a double-stranded DNA in which any one of the following bases (19) to (24) is added to the 3 ′ end of one or both strands A kit comprising a first container containing Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or a mutant protein thereof.
  • the added base is 2, 3, or 4 adenine (A); 2, 3, 4, 5, or 6 cytosine (C); 2, 3, The kit according to [Item 22] or [Item 23], which is 1, 4, 5, or 6 guanine (G); or 2, 3, or 4 thymines (T).
  • the added base is 2, 3, 4, 5, or 6 cytosine (C); or 2, 3, 4, 5, or 6 guanine (G The kit according to [Item 22] or [Item 23].
  • the double-stranded adapter DNA of any sequence can be ligated with high efficiency to the double-stranded DNA of any sequence, so that the analysis is performed more than when the conventional technique is used. It is possible to reduce the amount of DNA necessary for the preparation. For example, it is possible not only to analyze fossil-derived DNA and bacterial DNA that is difficult to culture, but also to analyze a single or limited number of cells. It can also be used for analysis. It is also possible to reduce the amount of biological sample used to prepare DNA for human clinical diagnosis.
  • the methods and kits of the invention can be used in a wide range of fields including medicine, pharmacy, genetic engineering, analysis and the like because there are no restrictions on the base sequences of double-stranded DNA and adapter DNA.

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Abstract

ＤＮＡを作製する方法は、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３'末端に、下記の（１）～（６）のいずれかの塩基を付加することを含む。　（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）　（２）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）　（３）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）　（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）　（５）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基

Description

二本鎖ＤＮＡ末端の加工方法
　本発明は、末端が加工されたＤＮＡ断片の製造方法に関する。
　従来、平滑化２本鎖ＤＮＡの３’末端に１塩基を付加する方法として、ＤＮＡ複製酵素であるＴａｑポリメラーゼ等を作用させる方法が用いられてきた(非特許文献１）。例えばＴａｑポリメラーゼにより、平滑化２本鎖ＤＮＡ末端のうち３’末端にアデニン（Ａ）を１個付加させた産物を、チミン（Ｔ）を３'端に突出させたアダプターＤＮＡと連結反応させることが行われてきた。アダプターＤＮＡと連結させたＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を経て、あるいはＰＣＲ増幅を経ることなく、イルミナ株式会社あるいはPacific Biosciences Inc.社等が提供しているシーケンサーでの塩基配列決定に供されている。
　これにとどまらずＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡの末端に１塩基を突出させて連結反応等に利用することは、ＤＮＡの加工技術として、ＴＡ－クローニングなどに幅広く用いられている。
　これまでに知られているポリメラーゼによる末端塩基付加活性のうち、実際に利用可能な程度の強い活性を有するのは、アデニン（Ａ）の付加活性のみであり付加される塩基の数も最大で１である。
　平滑化２本鎖ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素として、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）も用いられている。ＴｄＴは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端にデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの各々）を重合する反応を触媒するが、この場合、塩基が３０～６０個と多数付加され、この数をコントロールすることができない。
　ＤＮＡの突出末端は制限酵素処理によっても作成できるが、各制限酵素は特定の認識配列のみを切断するため、制約が大きい。
Nucleic Acid Research 16(20) p. 9677-9686, 1988
　本発明の目的は、二本鎖ＤＮＡへ塩基を付加する新規な方法を提供することである。
　本発明の別の目的は、一方又は両方の鎖の３’末端に塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、かかる塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを連結する新規な方法を提供することにある。
　本発明のまた別の目的は、一方又は両方の鎖の３’末端に塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作成するための新規なキットを提供することにある。
　モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, ＭＭＬＶ）の逆転写酵素は、一本鎖のＲＮＡから相補的ＤＮＡ鎖を合成することが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼであるが、本発明者らは、期せずして、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を用いると、二本鎖ＤＮＡの３’末端に１～２０個程度のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）を付加できることを見出すとともに、突出させた付加塩基と相補的な塩基を有する一本鎖ＤＮＡと、かかる逆転写酵素とを作用させることで、一本鎖ＤＮＡの相補鎖が二本鎖ＤＮＡのかかる突出末端から合成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の一態様によれば、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）～（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法が提供される。
　（１）１個、２個、３個又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（３）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（５）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基
　本発明の別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（７）～（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）～（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかとを用いて、二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法が提供される。
　（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（８）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（９）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１１）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１２）前記（７）～（１１）のいずれかの修飾塩基
　本発明のまた別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（１３）～（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法が提供される。
　（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（１４）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（１５）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１７）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１８）前記（１３）～（１７）のいずれかの修飾塩基
　本発明のさらに別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）～（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、　（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を収容する第１の容器
を備えたキットが提供される。
　（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２０）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（２１）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（２３）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（２４）前記（１９）～（２３）のいずれかの修飾塩基
　本発明によれば、二本鎖ＤＮＡへアデニン、チミンであれば１～４個程度、シトシン、グアニンであれば１～２０個程度を簡便に付加することができる。また、かかる付加反応を利用して、二本鎖ＤＮＡに任意の配列のアダプターＤＮＡを高効率で連結することができる。
二本鎖ＤＮＡへの１個、２個、３個、又は４個のアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンの付加反応について説明する略図。 二本鎖ＤＮＡへの二本鎖アダプターＤＮＡの連結反応について説明する略図。 二本鎖ＤＮＡへの二本鎖アダプターＤＮＡの連結反応について説明する略図。 ＦＡＭ標識された７０ｂｐ　ＤＮＡの調製方法について説明する略図。 二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを付加させた場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にアデニン付加したもの（Ｃ）（Ａ）のＤＮＡ断片にシトシン付加したもの、（Ｄ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加反応、及び（Ｅ）（Ａ）のＤＮＡ断片にチミン付加したもの。 二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を作用させた産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、（Ｃ）（Ｂ）の断片にガイドアダプターオリゴヌクレオチドを作用させた産物、及び（Ｄ）（Ｃ）の産物をＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理したもの。 二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を作用させた産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片にガイドアダプターオリゴヌクレオチドを作用させた産物。 各種ＤＮＡ産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した図。レーン１：ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物。レーン２：このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物。レーン３：グアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を付加した反応産物。レーン４：１００ｂｐマーカー。 二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらに二本鎖アダプターＤＮＡを連結した場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片に二本鎖アダプターＤＮＡを連結したもの。 各種ＤＮＡ産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した図。レーン１：ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物。レーン２：このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物。レーン３：アデニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｔ１～Ｔ４の等量混合物であるＴmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン４：シトシン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｇ１～Ｇ４の等量混合物であるＧmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン５：グアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｃ１～Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン６：チミン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ａ１～Ａ４の等量混合物であるＡmix1-4とライゲーション反応を行った産物。両側レーン：１００ｂｐマーカー。 二本鎖ＤＮＡの末端へ修飾塩基を付加し、さらにクリベージミックスを作用させた場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片に修飾塩基を付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片にクリベージミックスを作用させたもの。 二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを付加させた場合の、添加物が無い場合又は有る場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。（Ａ）未反応のサイズコントロール、（Ｂ）添加物がない場合、（Ｃ）ｄＡＭＰの添加、（Ｄ）ｄＣＭＰの添加、（Ｅ）ｄＧＭＰの添加、（Ｆ）ｄＴＭＰの添加。 二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＧを付加させた場合の、（Ａ）添加する化合物が無い場合、（Ｂ）デオキシシチジンを添加した場合、（Ｃ）デオキシシチジン一リン酸を添加した場合のＧの付加数を示すグラフ。 二本鎖ＤＮＡの平滑末端へ各種添加物の存在下で付加反応を行った場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。ＤＮＡ断片に（Ａ）シトシン、（Ｂ）グアニン、(Ｃ) チミンを付加したときのもの。添加物の反応溶液中の濃度を括弧内に示した。 二本鎖ＤＮＡの平滑末端へ各種添加物の存在下で付加反応を行った場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。反応前のＤＮＡ断片（Ａ）、Ｃの付加反応を促進化合物無し（Ｂ）、グアノシン一リン酸（Ｃ）、グアノシン二リン酸（Ｄ）添加で行ったもの、Ｇの付加反応を促進化合物なし（Ｅ）、及びシチジン二リン酸添加（Ｆ）で行ったもの。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。
　なお、本明細書において、「相補的」とは、必ずしも完全に相補的である必要はなく、相補的な核酸配列の一方又は両方に１つは複数の塩基の置換、付加及び／又は欠失を含んでよいことを意味する。
　また、本明細書において、ＤＮＡ鎖に「塩基が付加」されているとは、特にはデオキシヌクレオシド三リン酸を材料として用いてＤＮＡ鎖にデオキシヌクレオシド一リン酸が付加されることによりその構成要素として塩基が付加されていることを意味する。本明細書において「１～Ｎ個」とは、１からＮまでの整数のいずれかであることを指す。例えば「１～１０個」とは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を指す。
　本発明は、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, ＭＭＬＶ）逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１）～（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法を提供する。
　（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（３）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（５）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基
　モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素は、一本鎖のＲＮＡから相補的ＤＮＡ鎖を合成することが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼである。従来、ＭＭＬＶ逆転写酵素にはＤＮＡの３’末端に塩基を付加して突出部（オーバーハング）を形成する作用は無いと考えられていたところ、本発明者らは期せずして、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を用いて、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡとデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、又はデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を反応させると、二本鎖ＤＮＡの３’末端に１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）を付加できることを見出した（図１）。
　本発明によれば、（ｉ）天然型のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（アクセッション番号　ＮＰ　９５５９１、配列番号１）のみならず、その変異型タンパク質も使用することができる。
　以下、本明細書において「変異型タンパク質」とは、
　（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、
　（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
　（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質
を指す。
　（ｉｉ）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入の数は、好ましくは１～２００個、より好ましくは１～１００個、より好ましくは１～６０個、より好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個である。（ｉｉ）の二本鎖ＤＮＡへ付加される塩基の数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１個、２個、３個又は４個である。
　欠失には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の一部の配列を、例えば変異タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を高める目的、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のある活性を増大又は減少させる目的、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のある特性を改善させる目的、もしくはその他の目的で欠失させることが含まれる。
　（ｉｉｉ）の変異タンパク質は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性、好ましくは９２％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　（ｉｖ）の変異タンパク質は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と４０％以上の同一性、好ましくは５０％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９２％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質である。
　二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加される塩基の数は反応時間、ＤＮＡ濃度等によって変更可能であり、付加される塩基の数はキャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析にて確認することができる。付加される塩基の数は、アデニン、チミンで１～４個、シトシン、グアニンで１～２０個であるが、アデニン、チミンは２～４個であることが好ましく、２又は３個であることがより好ましく、２であることがさらに好ましい。シトシン、グアニンは１～１０個であることが好ましく、１～６個であることがより好ましく、２～４個であることがさらに好ましい。
　付加反応により、塩基が複数通りに付加された二本鎖ＤＮＡの混合物が生じる場合もあるが（例えばグアニンが１個付加された二本鎖ＤＮＡと、グアニンが２個付加された二本鎖ＤＮＡと、グアニンが３個付加された二本鎖ＤＮＡとが同時に生じる）、３’末端に塩基が２個付加された二本鎖ＤＮＡとは、塩基が他の個数（１個、３個、又は４個）で付加された二本鎖ＤＮＡが共存する場合も本発明の範囲に包含される。なお、図１では二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の３’末端に塩基が付加されているが、二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖の３’末端に塩基が付加されていてもよい。
　好ましい一実施形態では、上記（１）～（６）の各塩基の数は以下の通りである。
　（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
　（３）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
　（４）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
　（５）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基
　塩基は一般に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びシトシン（Ｃ）の順でＤＮＡに付加されやすいが、特異性の点でグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）が好ましく、グアニン（Ｇ）がより好ましい。
　３’末端に付加される塩基は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に直接的に付加されてもよいし、又は間接的に付加されてもよい。例えば、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に１個のアデニンをＴａｑポリメラーゼで３’末端に付加した後で、かかるアデニンを付加した二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、上記（１）～（６）のいずれかの塩基をモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて付加してもよい。このような場合も本発明の範囲に含まれる。
　３’末端に付加される塩基は、上記の（１）～（５）のいずれかの修飾塩基であってもよい。修飾塩基は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に付加することができる塩基であれば特に限定されないが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）をＯ－アルキル化（例えばＯ－メチル化）、Ｏ－アルコキシアルキル化（例えばＯ－メトキシメチル化）、Ｏ－アジドメチル化、Ｏ－オキシム化、Ｏ－アリル化したものや、フルオロ化、アミノ化、チオ化、蛍光色素等により標識化したもの等が挙げられる。このうち、例えばＯ－メチル化した塩基はＭＭＬＶ逆転写酵素による取り込み活性が認められている（Metzker et al. vol22, No.20 4259-4267）。
　二本鎖ＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。二本鎖ＤＮＡは好ましくは、塩基の付加前に平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡである。二本鎖ＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾としては、側鎖のメチル化、ビオチン化、脱リン酸化、リン酸化、蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びその誘導体等）、ダイデオキシ化、ホスホロチオエート化等が挙げられる。酵素的修飾としては、メチル化、ビオチン化、脱リン酸化、リン酸化、蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びその誘導体等）、酵素標識化（アルカリホスファターゼ等）が挙げられる。
　また本発明者らは、Ｍｎ2+がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）の付加を促進することを見出すとともに、各塩基の付加反応を促進する化合物を見出した。Ｍｎ2+はＭｎＣｌ等のマンガン塩の形で提供され、反応溶液中の濃度は好ましくは０．１～１００ｍＭ、より好ましくは０．５～１０ｍＭである。
　よって好ましくは、本発明のＤＮＡを作製する方法は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加を、当該Ｍｎ2+及び塩基の付加を促進する化合物の存在下で行うことで促進することができる。
　具体的には、反応容器に、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのタンパク質；二本鎖ＤＮＡへ塩基を付加する材料となるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はその組み合わせ）；当該塩基の付加を促進する化合物；ＭｎＣｌ2；必要な追加の試薬（例えば緩衝液）を入れて反応させることにより、二本鎖ＤＮＡの３’末端への塩基の付加を促進することができる。塩基の付加を促進する化合物を添加することにより、塩基の付加を促進する化合物無しで同じ時間反応させた場合に比べて、二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基の数を増加させることができる。　塩基の付加を促進する化合物（以下、促進化合物と称する）は、好ましくは当該塩基と対合する化合物であり、より好ましくは当該塩基と対合する塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドである。
　二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がシチジンの場合、好ましい促進化合物は、グアニン、グアノシン若しくはデオキシグアノシン、グアノシン若しくはデオキシグアノシンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、サイクリックグアノシン一リン酸、グアニンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、グアニンであり、さらにより好ましくはグアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、又はデオキシグアノシンである。１～４個のＣを付加するにはデオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸が特に適している。 ５個以上のＣを付加するか、可逆的にブロックされた修飾塩基を用いて１個ずつ塩基を付加する場合には、グアノシン一リン酸及びグアノシン二リン酸が適している。 
　理論に束縛されないが、これらのグアニン、グアニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＣＴＰと一過的にワトソン－クリック対合することでＣの付加反応を促進すると考えられる。
　グアニン、グアニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１～１００ｍＭである。グアノシンの反応溶液中の濃度は好ましくは、グアノシンの飽和濃度の約２０～４０％、より好ましくは約４０％である。
　グアノシン一リン酸の濃度は好ましくは０．１～１００ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭ～２０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。グアノシン二リン酸の濃度は好ましくは０．１～１００ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ～約１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭである。グアノシン三リン酸の濃度は好ましくは約２ｍＭである。 デオキシグアノシンの濃度は好ましくは、デオキシグアノシンの飽和濃度の約３０～約５０％、より好ましくは約４０％である。 デオキシグアノシン一リン酸の濃度は好ましくは約５ｍＭ～約３０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。グアニンの濃度は好ましくは約２ｍＭである。 
　二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がチミンの場合、好ましい促進化合物は、アデニン、アデノシン若しくはデオキシアデノシン、アデノシン若しくはデオキシアデノシンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、サイクリックアデノシン一リン酸、アデニンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、アデニンであり、さらにより好ましくはアデノシン及びデオキシアデノシンである。
　理論に束縛されないが、これらのアデニン、アデニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＴＴＰと一過的にワトソン－クリック対合することでＴの付加反応を促進すると考えられる。
　アデニン、アデニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１～１００ｍＭである。アデノシンの濃度は、好ましくはアデノシンの飽和濃度の約２０～４０％、最も好ましくは約４０％である。デオキシアデノシンの濃度は、好ましくはデオキシアデノシンの飽和濃度の約３０～約４０％であり、最も好ましくは約４０％である。アデノシン二リン酸の濃度は好ましくは１ｍＭから１０ｍＭであり、最も好ましくは約５ｍＭである。アデノシン一リン酸の濃度は、好ましくは０．１～１００ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ～約２０ｍＭであり、最も好ましくは約１０ｍＭである。デオキシアデノシン一リン酸の濃度は好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭであり、最も好ましくは約１０ｍＭである。アデニンの濃度は好ましくは１０ｍＭである。アデノシン三リン酸の濃度は好ましくは２ｍＭである。 
　二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がグアニンの場合、好ましい促進化合物は、シトシン、シチジン若しくはデオキシシチジン、シチジン若しくはデオキシシチジンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、シチジン、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン三リン酸、シトシンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、シチジン、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン、デオキシシチジン一リン酸、シトシンであり、さらにより好ましくはデオキシシチジ及びシチジンである。
　６個以下のＧを付加するにはデオキシシチジンが適しており、５個以下のＧを付加するにはシチジンが適している。 ５個以上のＣを付加するか、可逆的ブロックされた修飾塩基を用いて１個ずつ塩基を付加する場合には、シチジン二リン酸が適している。 
　理論に束縛されないが、これらのシチジン、シチジンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＧＴＰと一過的にワトソン－クリック対合することでＧの付加反応を促進すると考えられる。
　シチジン、シチジンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１～１０００ｍＭである。シチジンの濃度は好ましくは０．１～１００ｍＭ、より好ましくは約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭである。シチジン一リン酸の濃度は好ましくは約０．１～約１００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ～３０ｍＭ、最も好ましくは約３０ｍＭである。シチジン二リン酸の濃度は好ましくは約１～約１０ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭである。 シチジン三リン酸の濃度は好ましくは約１～約１０ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭである。 デオキシシチジンの濃度は好ましくは約１００ｍＭから約３００ｍＭ、最も好ましくは約２００ｍＭである。 デオキシシチジン一リン酸の濃度は好ましくは約０．１～約１００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ～約３０ｍＭ、最も好ましくは約１５ｍＭである。シトシンの濃度は好ましくは約０．１～約１００ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。 
　二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がアデニンの場合、好ましい促進化合物は、チミン；５－メチルウリジン、チミジン、ウリジン、若しくはデオキシウリジン５－メチルウリジン、チミジン、ウリジン、若しくはデオキシウリジンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。
　理論に束縛されないが、これらのチミン、チミンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＡＴＰと一過的にワトソン－クリック対合することでＡの付加反応を促進すると考えられる。
　チミン、チミンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１～１００ｍＭである。 
　本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（７）～（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、（７）～（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、前記一本鎖アダプターＤＮＡ及びその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法を提供する（図２）。
　（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（８）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（９）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１１）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１２）前記（７）～（１１）のいずれかの修飾塩基
　好ましい一実施形態では、上記（７）～（１２）の各塩基の数は以下の通りである。
　（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（８）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
　（９）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１０）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
　（１１）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１２）前記（７）～（１１）のいずれかの修飾塩基
　一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の相補的な塩基の数は限定されないが、一つの好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、連続する１～１０個のアデニン（Ａ）、１～１０個のシトシン（Ｃ）、１～１０個のグアニン（Ｇ）、１～１０個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。別の好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、連続する２個以上のアデニン（Ａ）、連続する２個以上のシトシン（Ｃ）、連続する２個以上のグアニン（Ｇ）、連続する２個以上のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。この場合、塩基の上限は好ましくは１０個以下、より好ましくは６個以下である。　好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、１～６個のアデニン（Ａ）、１～６個のシトシン（Ｃ）、１～６個のグアニン（Ｇ）、１～６個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。より好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、２～６個のアデニン（Ａ）、２～６個のシトシン（Ｃ）、２～６個のグアニン（Ｇ）、２～６個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。さらに好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、２～６個のシトシン（Ｃ）、２～６個のグアニン（Ｇ）、又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。
　一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の相補的な塩基を構成するオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドより形成してもよいし、部分的に又は全部をリボヌクレオチドより形成してもよい。例えば、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端の連続する１～１０個のアデニン（Ａ）、１～１０個のシトシン（Ｃ）、１～１０個のグアニン（Ｇ）、１～１０個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を構成するオリゴヌクレオチドを、すべてデオキシリボヌクレオチドとしてもよいし、リボヌクレオチドとしてもよい。本明細書において、一本鎖アダプターＤＮＡの一部がリボヌクレオチドより構成されている場合も「一本鎖アダプターＤＮＡ」の用語に含まれる。
　平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（７）～（１２）のいずれかの塩基を突出させた上で（図２の反応（１））、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、任意の短い塩基配列を有する一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成することにより、二本鎖を伸張させることができる（図２の反応（２））。
　本発明は、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（７）～（１２）のいずれかの塩基を突出させた上で（図２の反応（１））、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、突出塩基と相補的な塩基配列を有しかつ３’末端がデオキシ末端である任意の短い塩基配列を有する一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成し、一本鎖アダプターＤＮＡを上記相補鎖ＤＮＡから解離させ、上記相補鎖ＤＮＡが付加された上記二本鎖ＤＮＡを製造する方法も提供する。３’末端がデオキシ末端である一本鎖アダプターＤＮＡと上記平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡとの間にはニックがあるため、熱を加えることにより３’末端がデオキシ末端である一本鎖アダプターＤＮＡは、これに相補的な付着末端を有する二本鎖ＤＮＡから解離させることができる。
　一本鎖アダプターＤＮＡの全体の長さの下限値は、好ましくは４塩基以上であり、例えば８塩基以上、１２塩基以上、１６塩基以上、又は２０塩基以上である。一本鎖アダプターＤＮＡの全体の長さの上限値は、好ましくは１００塩基以下、より好ましくは７５塩基以下である。
　二本鎖ＤＮＡの３’末端に突出させた塩基と一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の塩基の少なくとも一部は相補的であり、好ましくは、二本鎖ＤＮＡに付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のグアニン（Ｇ）であり、一本鎖アダプターＤＮＡが１～１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、二本鎖ＤＮＡに付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のシトシン（Ｃ）であり、一本鎖アダプターＤＮＡが１～１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する。
　一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型に作製した二本鎖アダプターＤＮＡの、二本鎖ＤＮＡへの付加効率は、好ましくは９０％以上である。
　一実施形態において、一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示す。ｎは整数であり、好ましくは１から１００、より好ましくは４から３０の整数である。つまり、一本鎖アダプターＤＮＡは一つの分子内に塩基をｎ個含み、ｎ個の塩基の各々は同一又は異なってアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンである。一つの分子内の塩基はアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンのうちの一種類、二種類、三種類又は四種類であってもよい。
　好ましくは、一本鎖アダプターＤＮＡはＮに関してアデニン、シトシン、グアニン、及びチミンを等量ずつ含むＤＮＡの混合物である。一本鎖アダプターＤＮＡをいわゆるミックス塩基の構成とすることで、かかる一本鎖ＤＮＡは分子タグなどと呼ばれるお互いに異なる配列をこの部分に有することとなる。アダプターＤＮＡを結合させたＤＮＡをＰＣＲなどによって増幅させた場合に、もともと同じＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子が同じ配列をこの部分に有することを利用すると、一様ではないＰＣＲによる増幅の影響を取り除いてデータを解析できる。
　一本鎖アダプターＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡ又はそれを加工したものであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。
　一本鎖アダプターＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾又は酵素的修飾については二本鎖ＤＮＡに関して上述した通りである。一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端にホスホロチオエート基を導入すると反応中の一本鎖アダプターの分解が抑制されるため好ましい。また、一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端をデオキシ末端にすると一本鎖アダプターＤＮＡ同士がアニーリングして逆転写酵素による伸長反応が起きることを抑制できるため好ましい。
　本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（１３）～（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法を提供する（図３）。
　（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（１４）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（１５）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１７）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１８）前記（１３）～（１７）のいずれかの修飾塩基
　好ましい一実施形態では、上記（１３）～（１８）の各塩基の数は以下の通りである。　（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（１４）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
　（１５）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１６）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
　（１７）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１８）前記（１３）～（１７）のいずれかの修飾塩基
　二本鎖アダプターＤＮＡは、一方又は両方の鎖の３’末端に、１～４個の連続するアデニン（Ａ）、１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）、１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）、１～４個の連続するチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基の突出を有する。
　平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（１３）～（１６）のいずれかの塩基を突出させた上で、これと相補的な３’突出末端を有する二本鎖アダプターＤＮＡを作用させることで、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに従来達成し得なかった高い効率で付加される。
　好ましくは、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）であり、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの３’末端に対応する３’末端に１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）を有するか、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖に付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）であり、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの３’末端に対応する３’末端に１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）を有する。
　二本鎖アダプターＤＮＡの５’末端にはリン酸基が付加されていることが好ましい。
　二本鎖アダプターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの付加効率は、好ましくは９０％以上である。
　二本鎖アダプターＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡ又はそれを加工したものであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。
　二本鎖アダプターＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾又は酵素的修飾については二本鎖ＤＮＡに関して上述した通りである。また、二本鎖アダプターＤＮＡはさらに、制限酵素切断部位を有していてもよい。制限酵素の例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、PvuII、RsaI、ScaI、SmaI、SspI、StuI、ThaI、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、HindIII、HpaII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、SalI、XbaI、XhoI、及びI-CeuIが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）～（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を収容する第１の容器
を備えたキットを提供する。
　（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２０）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（２１）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（２３）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（２４）前記（１９）～（２３）のいずれかの修飾塩基
　好ましい一実施形態では、上記（１９）～（２４）の各塩基の数は以下の通りである。　（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２０）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
　（２１）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
　（２２）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
　（２３）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（２４）前記（１９）～（２３）のいずれかの修飾塩基
　また、上記キットは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備えていてもよい。
　デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つは上記（１９）～（２４）の付加される塩基の構成成分として使用されるヌクレオチドである。
　本発明のキットはさらに、上述の塩基の付加を促進する化合物を備えていてもよい。上記促進化合物の種類と濃度は上述の通りである。上記促進化合物は、上記第２の容器に収容されてもよいし、第１の容器及び第２の容器とは異なる第３の容器に収容されてもよい。
　二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’平滑末端に上記（１９）～（２４）のいずれかの塩基を付加する方法については、図１を参照しながら上記に説明した通りである。二本鎖ＤＮＡへの上記（１９）～（２４）のいずれかの塩基の付加は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて行うことができる。
　本発明のキットはさらに、ＭｎＣｌ2、二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加に必要な追加の試薬（例えば緩衝液）などを備えてもよい。
　なお、上記（１）～（４）、（７）～（１０）、（１３）～（１６）、（１９）～（２２）の各々に関して、一種類の塩基を付加する場合は、当業者に理解されるように、例えば一種類のデオキシヌクレオチド（アデニンを付加する場合はｄＡＴＰ、シトシンを付加する場合はｄＣＴＰ、グアニンを付加する場合はｄＧＴＰ、チミンを付加する場合はｄＴＴＰ）を用いてＤＮＡの３’末端にデオキシヌクレオチドを重合することができる。
　また、上記（１）～（６）、（７）～（１２）、（１３）～（１８）、（１９）～（２４）の各々に関して、一種類の塩基又は二種類以上の塩基の組み合わせを付加する場合は、当業者に理解されるように、例えば３’端がアジドメチル基等の官能基により可逆的にブロックされた修飾塩基を用いて１塩基を突出させた後に、ブロックを外し、修飾のないアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のいずれか１つが３’端に突出した二本鎖ＤＮＡを作製し、次に、これに対して更に３’端が可逆的にブロックされた修飾塩基を伸長させ、ブロックを外し、更に１つアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のいずれか１つであって先の塩基と同一又は異なる塩基を伸長させ、これを繰り返すことで、ＧＧ、ＡＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＣＧ、ＣＡ等、制御した様式で塩基を付加することができる。
　本明細書中に引用されているすべての特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１　片方の末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐ　ＤＮＡの調製方法
　３００ｂｐのＤＮＡ断片をＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン水和物）標識されたプライマーでＰＣＲ増幅した。これをＰｖｕＩＩ処理して生じた７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルより精製した（図４）。当該ＤＮＡ断片のＦＡＭ標識されていない方の５’末端にはリン酸基がついている。
実施例２　二本鎖ＤＮＡの平滑末端へのＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの付加
　片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTSCRIBETM、タカラバイオ株式会社）を用いてアデニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、シトシン付加反応を行った反応産物（Ｃ）、グアニン付加反応を行った反応産物（Ｄ）、及びチミン付加反応を行った反応産物（Ｅ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。各反応は、１０ｎＭ　ＤＮＡ、２ｍＭ　ＭｎＣｌ2、及びそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの各々の存在下で、３７℃で６０分行った。
　キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析では、各ＤＮＡサンプルを、予めLIZ500サイズスタンダードと混合したHiDi Formamide（ThermoFisher SCIENTIFIC社）に加え、９６度で４分熱変性し、Applied Biosystemsのモデル3130xlシーケンサーにより解析した。
　解析結果を図５に示す。青線がＦＡＭ、オレンジ線がLIZ500サイズスタンダードによるシグナルを表す。以下、実施例３、４、６のフラグメント解析も実施例２と同じ条件及び装置で行った。
　図５に示すように、本実施例の条件では、アデニン付加反応では２個、３個、及び４個のアデニンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、シトシン付加反応では１個及び２個のシトシンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、グアニン付加反応では２個及び３個のグアニンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、チミン付加反応では１個、２個及び３個のチミンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察された。
実施例３　一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結
　片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、グアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（Ｃ）、及び（Ｃ）をＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理したＧＡＯ連結反応産物（Ｄ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。使用したＧＡＯはアダプターオリゴヌクレオチド１（ＳＡ５７７とも称する）：５’－ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＣ－３’（配列番号２）である。グアニン付加反応は５０ｎＭ　ＤＮＡ、２ｍＭ　ＭｎＣｌ2、４ｍＭ　ｄＧＴＰの条件で３０℃で１５分行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ５７７を使用し、反応は３７℃で３０分間行った。
　解析結果を図６に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９７％と測定され、一本鎖ＤＮＡであるアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。
実施例４　一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結
　片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、及びグアニン付加反応後にガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（Ｃ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。使用したＧＡＯはアダプターオリゴヌクレオチド２（ＳＡ６１７とも称する）：５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣ＊Ｃ＊ＣｄＯＨ－３’（配列番号３）である。配列の３’末端のｄＯＨはデオキシ末端であることを、＊はホスホロチオエート基を表す。グアニン付加反応は１００ｎＭ　ＤＮＡ、４ｍＭ　ＭｎＣｌ2、４ｍＭ　ｄＧＴＰの条件で３０℃で１時間行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ６１７を使用し、反応は３７℃で２時間行った。
　解析結果を図７に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９３％と測定され、一本鎖ＤＮＡであるアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。
実施例５　一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結のＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色による確認
　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン１）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（レーン２）、及びグアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素とを用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（レーン３）、及び１００ｂｐマーカー（レーン４）を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した。グアニン付加反応は５０ｎＭ　ＤＮＡ、４ｍＭ　ＭｎＣｌ2、４ｍＭ　ｄＧＴＰの条件で３０℃で４０分行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌのグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ５７７を使用し、反応は３７℃で２時間行った。
　結果を図８に示す。画像は１つの泳動画像を加工したものであり、黒の縦線は画像を張り合わせた部分を示す。レーン１及びレーン２にはそれぞれＰＣＲ産物とグアニン付加反応後の反応産物のバンドが観察され、レーン３には二本のバンドが観察された。レーン３で見られるサイズの小さいバンドは片側末端に、大きいバンドは両側末端にＧＡＯが付加した産物である。
実施例６　二本鎖ＤＮＡの末端への二本鎖アダプターＤＮＡのリガーゼによる連結
　片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、及びグアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｃ１～Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物（Ｃ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。グアニン付加反応は１００ｎＭ　ＤＮＡ、２ｍＭ　ＭｎＣｌ2、４ｍＭ　ｄＧＴＰの条件で３０℃で９０分行った。ライゲーション反応には、TAKARA Bio社のLigation kitを使用し、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＣmix1-4を使用し、１６℃で１０分間行った。
　二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｃ１～Ｃ４の配列は以下に示す通りである。Ｐはリン酸基を表す。
　解析結果を図９に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９８％と測定され、二本鎖ＤＮＡであるアダプターＤＮＡをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。
Ｃ１　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　　３’－ＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号５）
Ｃ２　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　３’－ＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号６）
Ｃ３　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　３’－ＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号７）
Ｃ４　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　３’－ＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号８）
実施例７　二本鎖ＤＮＡの末端への二本鎖アダプターＤＮＡの連結のＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色による確認
　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン１）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（レーン２）、アデニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｔ１～Ｔ４の等量混合物であるＴmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン３）、シトシン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｇ１～Ｇ４の等量混合物であるＧmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン４）、グアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ｃ１～Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン５）、チミン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ　Ａ１～Ａ４の等量混合物であるＡmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン６）及び１００ｂｐマーカー（両側のレーン）をライゲーションした産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した。シトシン付加反応、グアニン付加反応及びチミン付加反応は４ｍＭ　ＭｎＣｌ2、１０ｎＭ　ＤＮＡ、４ｍＭ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰの条件で３０℃で４５分行った。アデニン付加反応はＭｎＣｌ2を含まない反応溶液でｄＡＴＰの存在下で同様の条件で行った。
　Ｔmix1-4、Ｇmix1-4、Ｃmix1-4、Ａmix1-4は、配列番号９の２０ｂｐのＤＮＡの一方のＤＮＡ末端からＴ、Ｇ、Ｃ、Ａが１～４塩基突出したものを等量ずつ混合したものである。Ｃmix1-4は実施例６で説明した通りである。二本鎖アダプターＤＮＡ Ｔ１～Ｔ４、Ｇ１～Ｇ４、Ａ１～Ａ４の配列は以下に示す通りである。Ｐはリン酸基を表す。
　３’－ＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号９）
　結果を図１０に示す。レーン１及びレーン２にはそれぞれＰＣＲ産物とグアニン付加反応後の反応産物のバンドが観察された。レーン３から６で３本見えるバンドは、下側のバンドはライゲーションされなかったＤＮＡ断片であり、真ん中のバンドはＤＮＡ断片の片側末端にアダプターが連結された産物であり、上側のバンドはＤＮＡ断片の両側末端にアダプターが連結された産物である。本実施例でも、二本鎖ＤＮＡであるアダプターＤＮＡをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。
Ｔ１　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　　３’－ＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１０）
Ｔ２　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　３’－ＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１１）
Ｔ３　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　３’－ＴＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１２）
Ｔ４　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　３’－ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１３）
Ｇ１　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　　３’－ＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１４）
Ｇ２　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　３’－ＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１５）
Ｇ３　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　３’－ＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１６）
Ｇ４　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　３’－ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１７）
Ａ１　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　　３’－ＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１８）
Ａ２　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　　３’－ＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号１９）
Ａ３　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　　３’－ＡＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号２０）
Ａ４　　５’　Ｐ－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
　　３’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ－５’（配列番号２１）
実施例８　二本鎖ＤＮＡの末端への修飾塩基の付加
　イルミナ株式会社のMiSeq Reagent Kit v3のwell 5 (アンプリフィケーションミックス; AMS1)の内容物をフェノール/クロロフォールム/イソアミルアルコール処理し、遠心した上清をエタノール沈殿した。沈殿をTE bufferに溶解し、260 nmに吸収があることを確認した。AMS1はチミジンのピリミジン塩基の5位が蛍光色素で修飾され、かつ糖の３’端にアジドメチル基が付加されたヌクレオチドを含み、塩基には4種類の修飾塩基を含んでいる。 
　片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片とAMS1の当該溶液を、４ｍＭ　ＭｎＣｌ2の存在下でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素と３０℃で３０分反応させた産物（Ｂ）、さらにこの産物を上記キットのReagent Trayのwell 4 (クリベージミックス)の内容物と６５℃で３０分反応させた産物（Ｃ）をキャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。 
　結果を図１１に示す。パネル（Ｂ）で見られるブロードなピークは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素が、かかる修飾塩基を２本鎖ＤＮＡ末端に付加可能であることを示している。 また、パネルＣではクリベージミックスと作用させることでピークの位置が大きく変わっているが、これは塩基の部分にある発蛍光団がクリベージミックスの作用で脱離したことがＤＮＡ分子の負電荷を減少させたことによると推測される。 
実施例９　塩基の付加を促進する添加物の影響
　実施例１に記載の片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型MMLV逆転写酵素(M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン) を用いて、４ｍＭのＭｎＣｌ2存在下でそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々を用いてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの付加反応を３０℃を超える温度で５分間行った。反応産物を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。
　反応溶液中に添加物を加えないときの結果と、終濃度１０ｍＭとなるようｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰを添加物として加えたときの結果を図１２（Ａ）～（Ｆ）に示す。その結果、Ｃの付加反応をｄＧＭＰが、Ｇの付加反応をｄＣＭＰが、Ｔの付加反応をｄＡＭＰが促進することが確認された。
実施例１０　塩基の付加を促進する添加物の有無の効果の比較
　ＦＡＭ標識されたプライマーで増幅して得られた片方の５’末端をＦＡＭ標識した２８０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン）を用いて、４ｍＭ　ＭｎＣｌ2、４ｍＭ　ｄＧＴＰ存在下で、Ｇの付加反応を３０℃で行った。（Ａ）はデオキシシチジンを添加せず、（Ｂ）はデオキシシチジンを終濃度２００ｍＭで添加した場合、（Ｃ）デオキシシチジン一リン酸を最終濃度２ｍＭで添加した結果を図１３に示す。
　デオキシシチジン及びデオキシシチジン一リン酸を反応溶液に加えた場合、これらの化合物を添加しない場合に比べて、末端のグアニンの付加数が多い平滑末端ＤＮＡの割合が増大しており、デオキシシチジン及びデオキシシチジン一リン酸は平滑末端ＤＮＡへのグアニンの付加を促進することが確認された。
実施例１１　塩基の付加を促進する添加物の種類の検討
　実施例９と同様に、片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型MMLV逆転写酵素(M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン) を用いて、４ｍＭのＭｎＣｌ2存在下でそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々を用いてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの付加反応を３０℃を超える温度で５分間行った。付加反応前、反応溶液中に化合物を添加しない場合、各種化合物を付加した場合で、反応溶液をフラグメント解析に用いた。結果を図１４に示す。
　シトシンの付加に対し、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、グアニンは促進効果があることが判明した。
　また、グアニンの付加に対し、シチヂン、シチヂン一リン酸、シチヂン二リン酸、シチヂン三リン酸、デオキシシチヂン、デオキシシチヂン一リン酸、シトシンは促進効果があることが判明した。
　さらに、チミンの付加に対し、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、アデニンは促進効果があることが判明した。
実施例１２　最大２０個の付加を促進する添加物
　実施例９と同様に、片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptaseｅ、株式会社ニッポンジーン）を用いて、４ｍＭ　ＭｎＣｌ2の存在下で、(Ｂ)から（Ｄ）はＣの付加を、(Ｅ)と(Ｆ)はＧの付加反応を３０℃で２時間行った。（Ａ）は反応前、(Ｃ)は５ｍＭのグアノシン一リン酸存在下で、(Ｄ)は１０ ｍＭのグアノシン二リン酸存在下で行った。 (Ｆ)は２ｍＭのシチジン二リン酸存在下で行った。結果を図１５に示す。シトシンの付加に対し、グアノシン一リン酸が強力な促進効果を示し、最大２０個のシトシンが付加することが判明した。またグアニンの付加に対し、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸が強力な促進効果を示し、最大２０個のグアニンが付加することが判明した。
　以上、本発明の実施形態及び実施例について具体的に説明したが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
　例えば、上述の実施形態及び実施例において挙げた構成、方法、工程、形状、材料及び数値などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれと異なる構成、方法、工程、形状、材料及び数値などを用いてもよい。
　また、上述の実施形態の構成、方法、工程、形状、材料及び数値などは、本発明の主旨を逸脱しない限り、互いに組み合わせることが可能である。
　また、本発明は以下の構成を採用することもできる。
［項１］モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）～（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法。
　（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（３）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（５）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基
［項２］前記付加される塩基は、２個、３個、若しくは４個のアデニン（Ａ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）；又は２個、３個、若しくは４個のチミン（Ｔ）である［項１］に記載の方法。
［項３］前記付加される塩基は、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；若しくは２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）である［項１］に記載の方法。
［項４］　前記二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項１］～［項３］のいずれか一項に記載の方法。
［項５］一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（７）～（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）～（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質とを用いて、一本鎖アダプターＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法。
　（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（８）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（９）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１１）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１２）前記（７）～（１１）のいずれかの修飾塩基
［項６］前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のチミン（Ｔ）を３’末端に有するか、
　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、
　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有するか、
　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のアデニン（Ａ）を３’末端に有する［項４］に記載の方法。
［項７］前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する［項５］に記載の方法。
［項８］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが４塩基以上１００塩基以下である［項５］～［項７］のいずれかに記載の方法。
［項９］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが８塩基以上である［項５］～［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１０］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１２塩基以上である［項５］～［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１１］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１６塩基以上である［項５］～［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１２］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが２０塩基以上である［項５］～［項７］のいずれかにに記載の方法。
［項１３］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１００塩基以下である［項５］～［項１２］のいずれかに記載の方法。
［項１４］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが７５塩基以下である［項５］～［項１２］のいずれかに記載の方法。
［項１５］前記一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示し、ｎは１から１００の整数である［項５］～［項１４］のいずれかに記載の方法。
［項１６］前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項５］～［項１５］のいずれか一項に記載の方法。
［項１７］［項５］～［項１６］のいずれか一項に記載の方法と、
　前記一本鎖アダプターＤＮＡを前記相補鎖ＤＮＡから解離させることと
を含む、前記相補鎖ＤＮＡが付加された二本鎖ＤＮＡを製造する方法。
［項１８］一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（１３）～（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法。
　（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（１４）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（１５）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（１７）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（１８）前記（１３）～（１７）のいずれかの修飾塩基
［項１９］前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）を３’末端に有するか、
　前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、
　前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有するか、
　前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）を３’末端に有する［項１８］に記載の方法。
［項２０］前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する［項１５］に記載の方法。
［項２１］　前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項１８］～［項２０］のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）～（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
　モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を収容する第１の容器
を備えたキット。
　（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
　（２０）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
　（２１）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
　（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
　（２３）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
　（２４）前記（１９）～（２３）のいずれかの修飾塩基
［項２３］デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備える［項２２］に記載のキット。
［項２４］前記付加される塩基は、２個、３個、若しくは４個のアデニン（Ａ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）；又は２個、３個、若しくは４個のチミン（Ｔ）である［項２２］又は［項２３］に記載のキット。
［項２５］前記付加される塩基は、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；若しくは２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）である［項２２］又は［項２３］に記載のキット。
［項２６］　前記塩基の付加を促進する化合物をさらに備える［項２２］～［項２５］のいずれか一項に記載のキット。
　本発明の方法によれば、任意の配列の二本鎖ＤＮＡに任意の配列の二本鎖アダプターＤＮＡを高効率で連結することができるため、従来の技術を使用した場合よりも解析を実施するのに必要なＤＮＡ量を減らすことができる。例えば、化石由来のＤＮＡ、培養が困難な細菌のＤＮＡなど、多量にＤＮＡを得ることが難しかった場合の解析が可能となるだけでなく、単一のあるいは限定された数の細胞を解析対象とする解析にも用いることができる。またヒトの臨床診断に際してＤＮＡを調整するのに用いる生体試料の量を低減することが可能である。発明の方法及びキットは、二本鎖ＤＮＡ及びアダプターＤＮＡの塩基配列に制約が無いため、医学、薬学、遺伝子工学、分析等を含む広範な分野で使用することができる。

Claims (12)

  1. 　（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）～（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法。
    　（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
    　（２）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
    　（３）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
    　（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
    　（５）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
    　（６）前記（１）～（５）のいずれかの修飾塩基
  2. 　前記二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項１に記載の方法。
  3. 　一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（７）～（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）～（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかとを用いて、前記一本鎖アダプターＤＮＡ及びその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法。
    　（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
    　（８）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
    　（９）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
    　（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
    　（１１）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
    　（１２）前記（７）～（１１）のいずれかの修飾塩基
  4. 　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
    　前記（７）～（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１～１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する請求項３に記載の方法。
  5. 　前記一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示し、ｎは１から１００の整数である請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　請求項３～６のいずれか一項に記載の方法と、
    　前記一本鎖アダプターＤＮＡを前記相補鎖ＤＮＡから解離させることと
    を含む、前記相補鎖ＤＮＡが付加された二本鎖ＤＮＡを製造する方法。
  8. 　一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（１３）～（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）～（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法。
    　（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
    　（１４）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
    　（１５）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
    　（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
    　（１７）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
    　（１８）前記（１３）～（１７）のいずれかの修飾塩基
  9. 　前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項８に記載の方法。
  10. 　一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）～（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
    　（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を収容する第１の容器
    を備えたキット。
    　（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
    　（２０）１～２０個の連続するシトシン（Ｃ）
    　（２１）１～２０個の連続するグアニン（Ｇ）
    　（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
    　（２３）２～２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
    　（２４）前記（１９）～（２３）のいずれかの修飾塩基
  11. 　デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備える請求項１０に記載のキット。
  12. 　前記塩基の付加を促進する化合物をさらに備える請求項１０又は１１に記載のキット。 
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