CN116497093A - 一种高效恒温扩增方法 - Google Patents

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CN116497093A CN202310654935.0A CN202310654935A CN116497093A CN 116497093 A CN116497093 A CN 116497093A CN 202310654935 A CN202310654935 A CN 202310654935A CN 116497093 A CN116497093 A CN 116497093A
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Abstract

本发明公开了一种高效恒温扩增方法，本发明提供的重组酶转录酶介导的等温扩增反应试剂包括RNA聚合酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、ATP再生酶、ATP再生原料、逆转录酶，本发明公开的重组酶转录酶介导的等温扩增技术反应特异性高，扩增效率提升10倍以上，特别针对低拷贝底物的扩增增效尤为突出，具有极大的应用前景。

Description

一种高效恒温扩增方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种核酸扩增技术，尤其涉及一种重组酶转录酶介导的等温扩增技术。
背景技术
核酸扩增检测是通过酶的作用将待检核酸序列进行扩增，然后检出的方法。主要包括聚合酶链反应、聚合酶链反应直接测序、原位聚合酶链反应和端粒重复序列扩增法。核酸的等温扩增是一个简单的过程，可以在恒定温度下快速有效地积累核酸序列。现有已开发出各种等温扩增技术来替代聚合酶链反应(PCR)。这些等温扩增方法已用于生物传感目标，例如DNA，RNA，细胞，蛋白质，小分子和离子。这些技术在原位或细胞内生物成像和测序中的应用已得到充分证明。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)在病原体检测、合成生物学等研究中发挥着重要作用，现已广泛应用于临床。但PCR技术依赖价格高昂的核酸扩增仪，难以用于基层和现场即时检测。恒温扩增技术的出现利于基层和现场即时检测的进一步发展。目前涉及的恒温扩增技术主要包括链置换扩增、滚环扩增、环介导等温扩增等技术。然而，这些技术要么所需的温度相对较高(50～60℃)，要么需要起始加热步骤。重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37～42℃条件下实现待测靶标的快速检测，但RPA的恒温范围有限，检出限限制等问题仍亟待解决。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了以下的技术方案：
本发明提供了一种等温核酸扩增的组合物，所述组合物包括重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶。
进一步，所述RNA聚合酶的来源包括：T7噬菌体、T3噬菌体、T5噬菌体、SP6噬菌体、或K1E噬菌体。
本发明中使用的术语“RNA聚合酶”主要来自于噬菌体，如常用于体外转录的启动子有T7/T3/SP6，分别来源于噬菌体T7/噬菌体T3/噬菌体SP6，其序列含20个碱基，三者对应的RNA聚合酶是DNA依赖性RNA聚合酶，对相应的双链启动子具有严格特异性，从启动子开始催化单链DNA或双链DNA下游5'→3'RNA合成，酶的分子量约为99kDa。
在某些具体的实施例中，本专利中使用的RNA聚合酶及对应启动子共有5种，分别来源于噬菌体T3、T7、SP6、T5、K1E，常见的氨基酸序列分别参见NCBI号T3(P07659)、T7(P00573)、SP6(P06221)、K1E(Q2WC24)、T5(P19822)。
进一步，所述重组酶的来源包括噬菌体、原核生物、真核生物。
进一步，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1。
进一步，所述重组酶包括T4噬菌体的UvsX。
进一步，原核生物是大肠杆菌。
进一步，所述重组酶包括大肠杆菌的RecA。
进一步，所述重组酶包括真核生物的Rad51。
本发明中使用的术语“重组酶”主要指可用于RPA反应的重组酶(重组蛋白)，这些重组酶来自于原核生物、病毒或真核生物。典型的重组酶包括UvsX和RecA(如从任何物种获得的RecA蛋白或UvsX蛋白)，和他们的片段或突变体，或者它们之间的任意组合。RecA和UvsX蛋白可以从任何物种获得，RecA和UvsX片段或突变体蛋白也可以用合适的RecA和UvsX蛋白，核苷酸序列和分子生物学技术产生(见如在美国专利第8071308号中描述的UvsX突变体的形成)。
在某些具体的实施例中，UvsX蛋白可来自肌病毒科噬菌体蛋白(myoviridaephages)，如T4/T2/Rb69/Aehl/KVP40/不动杆菌噬菌体(Acinetobacterphage)133/气单胞菌噬菌体(Aeromonas phage)65/噬蓝藻体(cyanophage)P-SSM2/噬蓝藻体(cyanophage)PSSM4/噬蓝藻体(cyanophage)S-PM2/Rb14/Rb32/气单胞菌噬菌体(Aeromonas phage)25/弧茵噬茵体nt-1/phi-1/Rbl6/Rb43/噬菌体31/噬菌体44RR2.8t/Rb49/噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。
在某些具体的实施例中，重组酶还可以使用包括古细菌RADA和RADB蛋白和真核(如植物、哺乳动物和真菌)Rad51蛋白(如RAD51,RAD51B,RAD51C,RAD51D,DMCl,XRCC2,XRCC3和recA)在内的重组酶蛋白。
在一个实施例中，重组酶优选为重组酶UvsX，典型的UvsX的氨基酸序列参见NCBI序列号NP 049656.2。
进一步，所述重组酶辅助蛋白的来源包括噬菌体、大肠杆菌。
进一步，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1。
进一步，所述重组酶辅助蛋白包括T4噬菌体的UvsY。
进一步，所述重组酶辅助蛋白包括大肠杆菌来源的RecR、RecO或RecF。
本发明中术语“重组酶辅助蛋白”可以是来自原核生物、病毒或真核生物。典型的装载蛋白包括大肠杆菌RecO、大肠杆菌RecR、UvsY，和它们的突变体或片段，或它们的组合。
在某些具体的实施例中，所述的重组酶辅助蛋白可以是典型的UvsY蛋白，其来源包括肌病毒噬菌体如T4/T2/T6/Rb69/Aehl/KVP40/不动杆菌噬菌体/气单胞菌噬茵体65/噬蓝藻体P-SSM2/噬蓝藻体PSSM4/噬蓝藻体S-PM2/Rbl4/Rb32/气单胞菌噬菌体25/弧茵噬茵体nt-1/phi-l/Rbl6/Rb43/噬菌体31/噬菌体44RR2.8t/Rb49/噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。在某个具体的实施例中，使用的重组酶辅助蛋白为UvsY，氨基酸序列参见NCBI序列号NP_049799.2。
进一步，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的浓度之比为(6-2):1。
在某些具体的实施例中，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的浓度之比为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1。
进一步，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的浓度之比为3:1。
进一步，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的摩尔质量之比为1：1。
进一步，所述单链结合蛋白的来源包括噬菌体、大肠杆菌。
进一步，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1。
进一步，所述单链结合蛋白包括T4噬菌体的GP32。
进一步，所述单链结合蛋白包括大肠杆菌的SSB。
本发明中术语“单链结合蛋白”是指用来稳定核苷酸，来源于各种物种，如从原核生物、病毒或真核生物的蛋白分子。典型的单链结合蛋白包括但不限于大肠杆菌SSB和那些源自肌病毒噬菌体的单链结合蛋白，例如T4/T2/T6/Rb69/Aehl/KVP40/不动杆菌噬菌体133/气单胞菌噬菌体65/噬蓝藻体/弧菌噬菌体等。
在某些具体的实施例中，本发明使用单链结合蛋白GP32，其氨基酸序列参见NCBI序列号NP_49854。
进一步，所述DNA聚合酶包括：Bsu Pol I、E.coli DNA聚合酶I/II/III/IV/V、T4gp43 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bacillus stearothermophilus聚合酶I大片段、Phi-29DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、Taq DNA聚合酶，铂Taq DNA聚合酶系列、TthDNA聚合酶、Bst聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Sac聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、TherminatorTM聚合酶、噬菌体B103聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶。
本发明中使用的术语“DNA聚合酶”拥有多种来源，包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I(如Klenow片段)，噬菌体T4 gp43 DNA聚合酶，嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶I的大片段，Phi-29 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Pol I，金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Pol I，大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I I，大肠杆菌DNA聚合酶I II，大肠杆菌DNA聚合酶IV，大肠杆菌DNA聚合酶V和它们的突变体或片段，或它们的组合。
在某一个具体的实施例中，本发明使用的DNA聚合酶为Bsu DNA聚合酶。Bsu DNA聚合酶大片段，Bsu DNAPolymerase Large Fragment来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，将Bacillus subtilis DNA聚合酶I基因的前296个密码子截去而得。该片段保留了Bsu DNA聚合酶5'-3’聚合酶活性，但是缺失了5'-3’核酸外切酶活性，同时该大片段自身缺失3'-5’核酸外切酶活性，其氨基酸序列参见NCBI序列号AAR00931.l。
进一步，所述逆转录酶选自：AMV逆转录酶与RNase H的组合、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶、或RSV逆转录酶。
本发明使用的术语“逆转录酶”是指依赖RNA的DNA聚合酶。该酶以RNA为模板，以dNTP为底物，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3’-OH末端上，根据碱基配对的原则，按5’-3’方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA,cDNA)。逆转录酶可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。
在某些具体的实施例中，使用的逆转录酶包括鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶和AMV逆转录酶。典型逆转录酶的氨基酸序列参见NCBI序列号AAA66622.1。
本发明还提供了一种等温核酸扩增体系，所述等温核酸扩增体系包含前面所述的组合物。
所述等温核酸扩增体系还包括ATP和/或其再生系统，所述ATP再生系统包括ATP再生酶、ATP再生酶催化底物。
进一步，所述ATP再生酶包括：肌酸激酶、聚磷酸激酶、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、乙酸激酶、或ATPS硫酸化酶。
进一步，所述ATP再生酶催化底物包括：磷酸肌酸、无机聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰磷酸、或APS。
术语“ATP再生酶”、“ATP再生酶催化底物”是指能够进行ATP再生的酶和所需原料，ATP再生系统作为能够不断循环提供ATP的系统，需要特异性的酶与相对应的催化底物进行反应。
本发明中术语“肌酸激酶”属于ATP再生体系中的一种体系，肌酸激酶(CreatineKinase,CK)是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。在某些具体的实施例中，肌酸激酶可选择兔肌激酶、鲤肌激酶，例如鲤肌激酶Ml型(M1-CK)。典型的肌酸激酶的氨基酸序列参见NCBI序列号NP_001075708.1。
进一步，所述等温核酸扩增体系还包括以下组分：
Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、dNTPs、RNasin。
本发明中术语“RNasin”与“核糖核酸酶抑制剂”同义，是指RNA酶的蛋白质抑制剂。可以从大鼠肝或人胚盘中提取获得，或者采用基因重组的方式制备。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。在某个具体的实施例中，所使用的RNasin的氨基酸序列参见NCBI序列号P13489.2。
进一步，所述等温核酸扩增体系还包括特异性扩增的引物。
进一步，所述引物包括上游引物，和下游引物。
进一步，所述上游引物包括含有启动子序列的上游引物。
进一步，所述启动子序列选自：T7、T3、T5、SP6、或K1E噬菌体的启动子序列。
进一步，所述选自T7噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述选自T3噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述选自T5噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述选自SP6噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述选自K1E噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步，所述上游引物还包含与目的基因5’端碱基位点互补的碱基。
进一步，所述上游引物的序列顺序为启动子序列的碱基、与目的基因5’端碱基位点互补的碱基。
进一步，所述下游引物的序列为与目的基因3’端碱基位点互补的碱基。
在具体的实施例中，上游引物、或下游引物中与目的基因互补的碱基数量可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、300、500个。
进一步，所述等温核酸扩增体系包括以下终浓度范围的组分：
RNA聚合酶0-100U/RXN、重组酶75-600ng/μL、重组酶辅助蛋白50-150ng/μL、单链结合蛋白150-1000ng/μL、DNA聚合酶25-150ng/μL、ATP再生酶0.1-15ng/μL、ATP再生酶催化底物50-500mM、逆转录酶125-1000U/RXN、ATP 5-20mM、引物1-600nM、模板1-500copies/RXN。
进一步，所述等温核酸扩增体系还包括以下终浓度范围的组分：
Tris-HCl 5-40mM、醋酸钾50-100mM、醋酸镁5-20mM、二硫苏糖醇0.5-5mM、聚乙二醇5％-10％w/w、dNTPs 100-500μM、RNasin 50-500U/RXN。
进一步，所述RNA聚合酶的终浓度为100U/RXN。
进一步，所述重组酶的终浓度为300ng/μL。
进一步，所述重组酶辅助蛋白的终浓度为100ng/μL。
进一步，所述单链结合蛋白的终浓度为300ng/μL。
进一步，所述DNA聚合酶的终浓度为100ng/μL。
进一步，所述ATP再生酶的终浓度为1ng/μL。
进一步，所述ATP再生酶催化底物的终浓度为200mM。
进一步，所述逆转录酶的终浓度为1000U/RXN。
进一步，所述Tris-HCl的终浓度为10mM。
进一步，所述醋酸钾的终浓度为50mM。
进一步，所述醋酸镁的终浓度为10mM。
进一步，所述二硫苏糖醇的终浓度为1mM。
进一步，所述聚乙二醇的终浓度为5％w/w。
进一步，所述dNTPs的终浓度为200μM。
进一步，所述ATP的终浓度为10mM。
进一步，所述RNasin的终浓度为50U/RXN。
进一步，所述引物的终浓度为100nM。
本发明还提供了一种重组酶转录酶介导的等温扩增方法，所述等温扩增方法包括如下步骤：
将核酸模板与前面所述的等温核酸扩增体系混合，在25-45℃下反应10-40min以完成重组酶转录酶介导的等温扩增反应。
进一步，所述核酸模板包括DNA序列和/或RNA序列。
进一步，所述DNA序列包括DNA单链、DNA双链。
进一步，所述DNA序列还包括具有特异性扩增的引物的序列或互补序列的DNA序列。
进一步，所述引物包括上游引物，和下游引物。
进一步，所述上游引物包括含有启动子序列的上游引物。
进一步，所述启动子序列选自：T7、T3、T5、SP6、或K1E噬菌体的启动子序列。
进一步，所述选自T7噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述选自T3噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述选自T5噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述选自SP6噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述选自K1E噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步，所述上游引物还包含与目的基因5’端碱基位点互补的碱基。
进一步，所述上游引物的序列顺序为启动子序列的碱基、与目的基因5’端碱基位点互补的碱基。
进一步，所述下游引物的序列为与目的基因3’端碱基位点互补的碱基。
进一步，所述核酸模板来自于血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、消化组织的细胞悬浮液、粪类物质的提取物、或来自人、动物的组织和器官样本、环境样品、食物样品。
本发明中使用的术语“样本”、“待测样本”是指来自于靶核酸的样品中提取和纯化的RNA或DNA，或不提取和纯化RNA或DNA而直接添加这些相同样品，所述样品诸如口腔拭子、鼻咽或鼻样品、血液、尿液、唾液、痰、粪便、环境样品或食物，或来自接触表面等。术语“样本”还包括加工样品如保存、固定和/或稳定的样品。作为固定剂，能使用交联以及非交联固定剂(非限制性市售示例包括PAXgene组织固定剂或卡诺伊溶液)。能用于稳定样品的市售可得稳定剂示例包括但不限于RNAlater、AllprotectTissue(组织)、RNAprotect Cell(细胞)、RNAprotect Saliva(唾液)、RNAprotectBacteria(细菌)、PAXgene Blood RNA(血液RNA)、PAXgene Blood DNA(血液DNA)、PAXgeneBone Marrow RNA(骨髓RNA)和QIAsafe。
本发明中所用术语“核酸模板”、“靶基因”、“靶核酸”、“模板”或“目的基因”同义，相互之间可替换使用，所指的是待扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。在双链分子的情况下，优选在扩增、合成或测序这些分子以前使其链变性，以形成第一条和第二条链，或者可以直接使用双链分子作为模板。在单链模板的情况下，与模板的部分互补的引物在适当的条件下杂交，接着具有聚合酶活性(DNA聚合酶和/或逆转录酶)的一种或多种多肽可以合成与所述模板的全部或部分互补的核酸分子。或者，对于双链模板，可以将一个或多个启动子与一种或多种聚合酶组合使用，以产生与模板的全部或部分互补的核酸分子。
进一步，所述重组酶转录酶介导的等温扩增方法包括如下步骤：
P1、提供包含至少第一和第二交互引物结合区的DNA模板；
P2、提供包含第一和第二片段的上游引物，和不含启动子序列的下游引物，其中，上游引物的第二片段可与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述上游引物的第一片段包括噬菌体的启动子序列；
P3、上游引物，下游引物在结合DNA模板后在重组酶、重组酶辅助蛋白、DNA聚合酶及单链结合蛋白的作用下分别进行两轮扩增，得到可用作RNA聚合酶转录模板的中间产物1，和多个RNA链的中间产物2；
P4、逆转录酶将中间产物2作为模板，逆转录合成DNA·RNA杂合链的中间产物3；
P5、重组酶、重组酶辅助蛋白将中间产物3中的DNA与RNA分开，继续以DNA为模板，结合上游引物得到中间产物1。
进一步，当所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法中的模板为RNA时，需要先进行逆转录过程后再进行所述的P1-P5的扩增步骤。
本发明中使用的术语“一”、“二”、“第一”、“第二”等描述，仅用于区分不同的序列、引物、并不限定具体的类型。
本发明所使用的术语“交互引物结合区”是指模板DNA和/或扩增子上正向和反向交互引物结合于其上的区域。文中使用的术语“交互引物”指的是两个或更多引物，这些引物用于划定在扩增过程中指数级扩增的原始模板多核苷酸区域的边界。
在一些实施例中，额外的引物可以结合到正向交互引物和/或反向交互引物的区域5’中。在使用这些额外引物的情况下，正向交互引物结合位点和/或反向交互引物结合位点可以包围这些额外引物的结合区及交互引物自身的结合区。比如在一些实施例中，该方法可以使用结合到位于正向和/或反向交互引物结合区的区域5’上的一个或多个额外引物。
本发明所使用的术语“互补”是指第二片段或下游片段具有充足的互补性，以便在结合过程中的通用条件下能够结合到模板上的交互引物结合区。这要求交互引物的第二片段或下游片段相对于模板上的交互引物结合区具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％的互补性。交互引物的第二片段或下游片段的长度可以为至少5个核苷酸，至少10个核苷酸，至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，甚至至少70个核苷酸。
本发明还提供了一种重组酶转录酶介导的等温扩增反应的产品，所述产品包括前面所述的等温核酸扩增体系中所包含的试剂。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、设备、装置、试纸条。
本发明还提供了一种使用前面所述的产品在非疾病诊断目的的病原基因检测中的应用。
本发明还提供了前面所述的等温核酸扩增体系中的试剂、前面所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法在制备用于基因快速合成的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测和鉴定病菌或病毒中的核酸序列的检测系统，所述检测系统包括前面所述的等温核酸扩增体系中包含的试剂。
进一步，所述检测系统包括扩增单元，所述扩增单元通过使用前面所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法进行核酸扩增。
本发明的有益效果：
1、本发明所使用的重组酶转录酶介导的等温扩增(RTMA,Recombinase-transcription mediated amplification)技术利用含高特异性转录启动子的引物、相应的RNA聚合酶、RNase和逆转录酶，持续扩增模板，为重组酶聚合酶扩增(RPA)提供持续的模板，提升扩增效率10倍以上。尤其对低拷贝底物的扩增效果尤为突出。
2、本发明所使用的重组酶转录酶介导的等温扩增技术可以使用DNA模板，也可使用RNA模板，或是两者的结合，本技术在扩增时可以将中间产物作为额外的扩增模板，大大提高了扩增效率。
附图说明
图1是重组酶转录酶介导的等温扩增技术原理图，其中，A以DNA为模板，B以RNA为模板；
图2是不同来源的启动子-RNAP对DNA扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是SP6 RNAP对DNA扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是SP6 RNAP对RNA扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图5是重组酶UvsX添加量对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图6是UvsX与重组酶辅助蛋白UvsY的比例对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图7是单链结合蛋白GP32添加量对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图8是DNA聚合酶Bsu添加量对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图9是ATP浓度对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图10是逆转录酶M-MLV添加量对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图11是模板量对扩增影响的琼脂糖凝胶电泳图；
图12是模板量对扩增影响的荧光分析图；
注：M指DNAMarker，DNA Marker I(天根，货号MD101，600bp-100bp)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细说明本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1重组酶转录酶介导的等温扩增技术的原理
重组酶转录酶介导的等温扩增(RTMA,Recombinase-transcription mediatedamplification)技术利用含高特异性转录启动子的引物、相应的RNA聚合酶、RNase和逆转录酶，持续扩增模板，为重组酶聚合酶扩增(RPA)提供持续的模板，提升扩增效率10倍以上。尤其对低拷贝底物的扩增效果尤为突出。
本实施例以SP6启动子-RNA聚合酶、重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY、单链结合蛋白GP32、DNA聚合酶Bsu、逆转录酶MMLV为例对RTMA技术的技术原理进行简单解释。
如图1A所示，当模板为双链DNA时，在UvsX/UvsY/GP32/Bsu作用下，分别以带启动子序列的上游引物(Primer#1)和不带启动子序列的下游引物(Primer#2)进行2轮扩增，得到可用做SP6 RNA聚合酶转录模板的中间产物1(Intermediate①)，得到众多RNA链的中间产物2(Intermediate②)。M-MLV逆转录酶以中间产物2为模板，逆转录合成DNA·RNA杂合链的中间产物3(Intermediate③)。而重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY可将中间产物3中杂合的DNA和RNA分开，接着以其中的DNA为模板，沿着上游引物得到中间产物4(Intermediate④)。中间产物4实际上与UvsX/UvsY/GP32/Bsu作用下的中间产物1一致，再经过一轮扩增后即可得到中间产物1。
在上述循环中，所得DNA·RNA杂合链的中间产物3为UvsX/UvsY/GP32/Bsu扩增提供了额外的模板，实现了中间产物4的积累，从而大大提高了扩增效率。
如图1B所示，当模板为RNA时，需要额外的使用M-MLV逆转录酶进行逆转录过程后才能进行如图1所示的UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增。
本专利中以SP6噬菌体的启动子、RNA聚合酶、重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY、单链结合蛋白GP32、DNA聚合酶Bsu、逆转录酶M-MLV为例探究了该技术的细节，但技术本身涵盖的范围更广，重组酶转录酶介导的等温扩增体系覆盖范围如表1所示。
表1、重组酶转录酶介导的等温扩增体系覆盖范围
实施例2以SP6噬菌体的启动子-RNA聚合酶，UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增体系
SP6噬菌体的启动子-RNA聚合酶，UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增体系的体系范围如表2所示。
表2体系总体积为50μL，不足部分用超纯水补充。所用引物、模板序列见表3。
表3引物、模板序列信息
实施例3循环扩增体系中各组分对扩增的影响
1、实验方法
1)琼脂糖凝胶电泳检测反应终点
在PCR仪上37℃保温30min后再56℃保温3min。用DEPC水稀释一定倍数，再与6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)按比例混合后上样，2％琼脂糖凝胶，Marker使用DNAMarker I(天根，货号MD101，600bp-100bp)，电压100V，40min后取出在紫外灯下观察。
2)SYBR Green I染料对反应过程的监测
SYBR Green I染料(索莱宝，货号SR4110)终浓度为0.2×-1×。反应时间30min，在497nm处每30s读取一次荧光，使用博日FQD-96X荧光定量检测系统监测。
2、实验体系及实验结果
2.1RNAP对扩增的影响
2.1.1不同来源的启动子-RNAP对DNA扩增的影响
分别以VP2-F、VP2-F-T3、VP2-F-T7、VP2-F-SP6、VP2-F-T5、VP2-F-K1E为上游引物，按25U/RXN添加相应的RNAP，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图2所示。
使用ImageJ软件测量电泳图各条带辉度，结果显示，几个样品的荧光强度比约为1:2.9:5:5.8:3.1:1.4(None:T3:T7:SP6:K1E:T5)，不同来源的启动子-RNAP对扩增均有一定的提升效果，其中SP6来源的启动子-RNAP对扩增的提升效果最明显，可将扩增量提升5.8倍；其次则是T7来源的启动子-RNAP，可将扩增量提升5倍。
2.1.2SP6 RNAP对DNA扩增的影响
在2.1.1基础上，以VP2-F-SP6为上游引物，按0,25,50,100U/RXN添加SP6RNAP，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图3所示。
结果显示，随着SP6 RNAP添加量的升高，DNA扩增量有显著的提升。根据实验结果，启动子-RNAP体系可将扩增效率提高15倍以上。
2.1.3SP6 RNAP对RNA扩增的影响
在2.1.1与2.1.2基础上，以VP2-F-SP6为上游引物，按0,25,50,100U/RXN添加SP6RNAP，以Canine parvovirus VP2 RNA片段为模板，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图4所示。
结果显示，随着SP6 RNAP添加量的升高，RNA扩增量有显著的提升。与DNA扩增相比，低添加量(25U/RXN)的SP6 RNAP使RNA扩增显著增加，但后续的随着RNAP添加量的增加，其扩增效果的提升量低于DNA扩增。
2.2重组酶UvsX对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按37.5,75,150,300,600ng/μL的浓度添加UvsX，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析，结果如图5所示。
结果显示，UvsX浓度为300ng/μL时，扩增效果最优，此时c(UvsX):c(UvsY)＝3:1，此时两者的摩尔量之比约为1:1。
2.3重组酶UvsX与重组酶辅助蛋白UvsY的比例对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，UvsX与UvsY的浓度比分别设置为6:1,5:1,4:1,3:1,2:1。具体浓度为c(UvsX):c(UvsY)＝300:50,300:60:300:75,300:100,300:150，单位为ng/μL。其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析，结果如图6所示。
结果显示，c(UvsX):c(UvsY)在6:1～2:1范围内，均有明显的扩增，其中，UvsX浓度为300ng/μL时，UvsY浓度为100ng/μL时，扩增效果最优，此时c(UvsX):c(UvsY)＝3:1，此时两者的摩尔量之比约为1:1。
2.4单链结合蛋白SSB对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按75,150,300,600,1000ng/μL的浓度添加SSB，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图7所示。
结果显示，GP32浓度为300ng/μL时，扩增效果最优。
2.5DNA聚合酶Bsu对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按6.25,12.5,25,50,100ng/μL的浓度添加Bsu，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图8所示。
结果显示，Bsu浓度为100ng/μL时，扩增效果较好，随着添加量的提升，扩增量没有明显提升。
2.6ATP对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按6.25,12.5,25,50,100ng/μL的浓度添加Bsu，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图9所示。
结果显示，ATP浓度为10mM时，扩增效果最佳，随着添加量的提升，扩增量反而下降。
2.7逆转录酶对扩增的影响
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按62.5,125,250,500,100U/RXN的浓度添加逆转录酶M-MLV，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图10所示。
结果显示，逆转录酶浓度为1000U/RXN时，扩增效果较好，随着添加量的提升，扩增量没有明显提升。
2.8模板量对扩增的影响
该项检测用两种手段观察，一是利用琼脂糖凝胶电泳观察终点扩增效果；二是利用SYBR GREEN I染料观察其扩增过程(荧光强度与双链DNA的量呈正比)。
2.8.1琼脂糖凝胶电泳观察终点扩增效果
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按0,0.1,1,10,102,103,104,105,106,107拷贝/RXN的量添加模板，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM。用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图11所示。
2.8.2SYBR GREEN I染料观察扩增过程
以VP2-F-SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按0,0.1,1,10,102,103,104,105,106,107拷贝/RXN的量添加模板，其余组分添加量为Tris-HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP50U/RXN、M-MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM。此外，反应体系还需加入SYBR Green I染料至染料终浓度为0.2×-1×，最后用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于荧光定量检测仪中37℃反应30min。在497nm处每30s读取一次荧光，使用博日FQD-96X荧光定量检测系统监测。结果如图12所示。
结果显示，本技术的最低检测限低至1copy/RXN，具有较高的灵敏度。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种等温核酸扩增的组合物，其特征在于，所述组合物包括重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶；
优选地，所述RNA聚合酶的来源包括：T7噬菌体、T3噬菌体、T5噬菌体、SP6噬菌体、或K1E噬菌体；
优选地，所述重组酶的来源包括噬菌体、原核生物、真核生物；
优选地，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1；
优选地，所述重组酶包括T4噬菌体的UvsX；
优选地，原核生物是大肠杆菌；
优选地，所述重组酶包括大肠杆菌的RecA；
优选地，所述重组酶包括真核生物的Rad51；
优选地，所述重组酶辅助蛋白的来源包括噬菌体、大肠杆菌；
优选地，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1；
优选地，所述重组酶辅助蛋白包括T4噬菌体的UvsY；
优选地，所述重组酶辅助蛋白包括大肠杆菌来源的RecR、RecO或RecF；
优选地，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的浓度之比为(6-2):1；
优选地，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的浓度之比为3:1；
优选地，所述重组酶与重组酶辅助蛋白的摩尔质量之比为1：1；
优选地，所述单链结合蛋白的来源包括噬菌体、大肠杆菌；
优选地，所述噬菌体包括T4、T6、Rb69或Aeh 1；
优选地，所述单链结合蛋白包括T4噬菌体的GP32；
优选地，所述单链结合蛋白包括大肠杆菌的SSB；
优选地，所述DNA聚合酶包括：Bsu Pol I、E.coli DNA聚合酶I/II/III/IV/V、T4 gp43DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bacillus stearothermophilus聚合酶I大片段、Phi-29 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、Taq DNA聚合酶，铂Taq DNA聚合酶系列、Tth DNA聚合酶、Bst聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Sac聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、TherminatorTM聚合酶、噬菌体B103聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶；
优选地，所述逆转录酶包括：AMV逆转录酶与RNase H的组合、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶、或RSV逆转录酶。
2.一种等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系包含权利要求1所述的组合物；
所述等温核酸扩增体系还包括ATP和/或其再生系统，所述ATP再生系统包括ATP再生酶、ATP再生酶催化底物；
优选地，所述ATP再生酶包括：肌酸激酶、聚磷酸激酶、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、乙酸激酶、或ATPS硫酸化酶；
优选地，所述ATP再生酶催化底物包括：磷酸肌酸、无机聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰磷酸、或APS；
优选地，所述等温核酸扩增体系还包括以下组分：
Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、dNTPs、RNasin。
3.如权利要求2所述的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系还包括特异性扩增的引物；
优选地，所述引物包括上游引物，和下游引物；
优选地，所述上游引物包括含有启动子序列的上游引物；
优选地，所述启动子序列选自：T7、T3、T5、SP6、或K1E噬菌体的启动子序列；
优选地，所述选自T7噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述选自T3噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述选自T5噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述选自SP6噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述选自K1E噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，所述上游引物还包含与目的基因5’端碱基位点互补的碱基；
优选地，所述上游引物的序列顺序为启动子序列的碱基、与目的基因5’端碱基位点互补的碱基；
优选地，所述下游引物的序列为与目的基因3’端碱基位点互补的碱基。
4.如权利要求2所述的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系中，各组分的终浓度范围为：
RNA聚合酶0-100U/RXN、重组酶75-600ng/μL、重组酶辅助蛋白50-150ng/μL、单链结合蛋白150-1000ng/μL、DNA聚合酶25-150ng/μL、ATP再生酶0.1-15ng/μL、ATP再生酶催化底物50-500mM、逆转录酶125-1000U/RXN、ATP 5-20mM、引物1-600nM、模板1-500copies/RXN；
优选地，所述各组分终浓度范围还为：Tris-HCl 5-40mM、醋酸钾50-100mM、醋酸镁5-20mM、二硫苏糖醇0.5-5mM、聚乙二醇5％-10％w/w、dNTPs100-500μM、RNasin 50-500U/RXN；
优选地，所述RNA聚合酶的终浓度为100U/RXN；
优选地，所述重组酶的终浓度为300ng/μL；
优选地，所述重组酶辅助蛋白的终浓度为100ng/μL；
优选地，所述单链结合蛋白的终浓度为300ng/μL；
优选地，所述DNA聚合酶的终浓度为100ng/μL；
优选地，所述ATP再生酶的终浓度为1ng/μL；
优选地，所述ATP再生酶催化底物的终浓度为200mM；
优选地，所述逆转录酶的终浓度为1000U/RXN；
优选地，所述Tris-HCl的终浓度为10mM；
优选地，所述醋酸钾的终浓度为50mM；
优选地，所述醋酸镁的终浓度为10mM；
优选地，所述二硫苏糖醇的终浓度为1mM；
优选地，所述聚乙二醇的终浓度为5％w/w；
优选地，所述dNTPs的终浓度为200μM；
优选地，所述ATP的终浓度为10mM；
优选地，所述RNasin的终浓度为50U/RXN；
优选地，所述引物的终浓度为100nM。
5.如权利要求2所述的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系进行反应时的温度为恒温；
优选地，所述恒温的温度范围为25-45℃；
优选地，所述恒温状态下的反应时间为10-40min。
6.一种重组酶转录酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述等温扩增方法包括如下步骤：
将核酸模板与权利要求2-5任一项所述的等温核酸扩增体系混合，在25-45℃下反应10-40min以完成重组酶转录酶介导的等温扩增反应；
优选地，所述核酸模板包括DNA序列和/或RNA序列；
优选地，所述DNA序列包括DNA单链、DNA双链；
优选地，所述DNA序列还包括具有特异性扩增的引物的序列或互补序列的DNA序列；
优选地，所述引物包括上游引物，和下游引物；
优选地，所述上游引物包括含有启动子序列的上游引物；
优选地，所述启动子序列选自：T7、T3、T5、SP6、或K1E噬菌体的启动子序列；
优选地，所述选自T7噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述选自T3噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述选自T5噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述选自SP6噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述选自K1E噬菌体的启动子序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，所述上游引物还包含与目的基因5’端碱基位点互补的碱基；
优选地，所述上游引物的序列顺序为启动子序列的碱基、与目的基因5’端碱基位点互补的碱基；
优选地，所述下游引物的序列为与目的基因3’端碱基位点互补的碱基；
优选地，所述核酸模板来自于血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水、渗出液、骨髓、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、上呼吸道或下呼吸道、鼻咽抽吸物或鼻腔冲洗物、消化组织的细胞悬浮液、粪类物质的提取物、或来自人、动物的组织和器官样本、环境样品、食物样品；
优选地，所述重组酶转录酶介导的等温扩增方法包括如下步骤：
P1、提供包含至少第一和第二交互引物结合区的DNA模板；
P2、提供包含第一和第二片段的上游引物，和不含启动子序列的下游引物，其中，上游引物的第二片段可与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述上游引物的第一片段包括噬菌体的启动子序列；
P3、上游引物，下游引物在结合DNA模板后在重组酶、重组酶辅助蛋白、DNA聚合酶及单链结合蛋白的作用下分别进行两轮扩增，得到可用作RNA聚合酶转录模板的中间产物1，和多个RNA链的中间产物2；
P4、逆转录酶将中间产物2作为模板，逆转录合成DNA·RNA杂合链的中间产物3；
P5、重组酶、重组酶辅助蛋白将中间产物3中的DNA与RNA分开，继续以DNA为模板，结合上游引物得到中间产物1；
优选地，当所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法中的模板为RNA时，需要先进行逆转录过程后再进行所述的P1-P5的扩增步骤。
7.一种重组酶转录酶介导的等温扩增反应的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求2-5任一项所述的等温核酸扩增体系中所包含的试剂；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、设备、装置、试纸条。
8.一种使用权利要求7所述的产品在非疾病诊断目的的病原基因检测中的应用。
9.权利要求2-5任一项所述的等温核酸扩增体系中的试剂、权利要求6所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法在制备用于基因快速合成的产品中的应用。
10.一种用于检测和鉴定病菌或病毒中的特定核酸序列的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括权利要求2-5任一项所述的等温核酸扩增体系中包含的试剂；
优选地，所述检测系统包括扩增单元，所述扩增单元通过使用权利要求6所述的重组酶转录酶介导的等温扩增方法进行核酸扩增。
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