CN114592043A - 一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。本发明提供的一种等温核酸检测的酶组合物，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7RNA聚合酶和Cas13a蛋白；利用所述酶进行等温核酸检测时，无需对扩增产物进行单链化处理，实现对目的片段的一步法扩增及检测。

Description

一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。

背景技术

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌种抵御病毒入侵的一种获得性免疫的方式。当病毒入侵时，细菌或古细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，可以引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶序列进行识别和切割。CRISPR-Cas13是基于细菌免疫系统的RNA靶向和编辑系统，可保护其免受病毒侵袭。该系统类似于CRISPR-Cas9系统，但与靶向DNA的Cas9不同，Cas13蛋白仅靶向切割单链RNA。Cas13a(又叫C2c2)最初是2015年被成功鉴定出来，是CRISPR-Cas系统中的第二大类第VI型，是家族中目前发现的唯一只靶向ssRNA的系统。它的结合和切割的对象为RNA。

从结构上来看，Cas13a含有两个HEPN(higher eukaryotes and prokaryotesnucleotide-binding,HEPN)结构域。HEPN结构域对Cas13a割RNA目标是必需的。目前科学家们已经从Leptotrichia buccalis、Leptotrichia wadei、Leptotrichia shahii以及Lachnospiraceae bacterium等多种细菌中解析出了Cas13a的结构，根据其来源不同分别称为LbuCas13a、LwaCas13a、LshCas13a和LbaCas13a。Cas13家族包括4中亚型，即Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。目前用在核酸检测方面的，大多是用Cas13a。

Cas13a有一个特别之处，那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的RNA，而不管它们是否与crRNA同源，或是否存在PFS。这个活性也就是平时听到最多的“附带切割(collateralcleavage)”效应。

2017年，张锋等利用Cas13a开发了SHERLOCK(Specific High SensitivityEnzymatic Reporter UnLOCKing)的检测系统。利用该方法，研究人员灵敏地检测了各种DNA或RNA靶标，包括寨卡病毒、登革热病毒、细菌分离株、抗性基因、人类DNA基因型和癌症突变等。随后，科学家们利用Cas13a蛋白结合等温核酸扩增技术，开发出来检测各种病毒细菌以及其他的核酸的工具，并且表现出了优秀的灵敏度和特异性。

在检测核酸时，由于核酸的数量比较少，通常需要先将核酸进行扩增，再对扩增产物进行检测，使用Cas13a检测核酸时，主要分为两个步骤，第一步为核酸扩增，第二步为Cas13a检测，步骤相对复杂，由于扩增和检测需要分开进行，增加了操作的复杂性和污染的风险。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的Cas13a蛋白检测核酸技术操作复杂、并且需要两步法检测的缺陷，从而提供一种一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法，将核酸扩增和Cas13a蛋白检测相结合，在检测过程中，将核酸扩增和检测整合到一起，实现对目的片段的一步法扩增及检测，操作简单、反应速度快，将会极大的解决使用Cas13a蛋白在核酸检测过程中的缺陷。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种等温核酸检测的酶组合物，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7RNA聚合酶和Cas13a蛋白。

可选的，所述重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX蛋白、T6UvsX蛋白或Rb69 UvsX蛋白；或

所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY蛋白、T6UvsY蛋白或Rb69 UvsY蛋白；或

所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4GP32蛋白、T6GP32蛋白或Rb69 GP32蛋白；或

所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或

所述Cas13a蛋白为韦德纤毛菌来源的LwCas13a蛋白。

可选的，所述UvsX蛋白为如下A1)-A2)中任意一种：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

A2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述UvsY蛋白为如下B1)-B2)中任意一种：

B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

B2)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

单链结合蛋白GP32为如下C1)-C2)中任意一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

C2)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述Cas13a蛋白为如下D1)-D2)中任意一种：

D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

D2)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白。

可选的，所述酶组合物中，重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶Cas13a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-1)：0.1-1.2)；T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.2-1U/μL，所述在使用时的终浓度是指配制的等温核酸检测反应体系中的终浓度。

可选的，所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。

可选的，还包括扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂中的至少一种；

可选的，所述等温核酸检测试剂盒中，分为独立包装的三部分，第一部分为包括酶组合物、扩增缓冲液和报告分子的冻干粉，第二部分为反应缓冲液，第三部分为反应启动剂；所述反应缓冲液中含有缓冲液A、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述扩增缓冲液中包含dNTPs、NTPs、ATP、缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；其中，dNTPs为脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP，NTPs为核苷三磷酸，包括腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)以及尿苷三磷酸(UTP)；ATP中文名称为腺苷三磷酸。

可选的，所述缓冲液A包括Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPS缓冲液；

可选的，所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠；

可选的，所述拥挤试剂包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或聚蔗糖；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量范围为8000-35000的聚乙二醇；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量为35000的聚乙二醇。

可选的，所述报告分子为单链RNA，所述单链RNA的一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团；

可选的，所述单链RNA的5’端修饰荧光基团F，3’端修饰淬灭基团Q；

可选的，所述报告分子为：5’-F-UUUUU-Q-3’；

可选的，所述荧光基团F为FAM、HEX、TET、JOE或VIC，淬灭基团Q为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

所述反应启动剂为含Mg²⁺的溶液；

可选的，所述反应启动剂为醋酸镁溶液或氯化镁溶液；

可选的，还包括：针对待测核酸设计的正向引物和反向引物；和/或

针对待测核酸的sgRNA；

可选的，所述正向引物或反向引物中一条引物中含有T7 RNA聚合酶启动子序列；

可选的，待测核酸为DNA或RNA；可选的，所述DNA为双链DNA或单链DNA；

可选的，待测核酸为RNA时，所述酶组合物中还包括逆转录酶；可选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。

可选的，利用所述的等温核酸检测试剂盒配制的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300-500nM；sgRNA：浓度为50-200nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、Cas13a蛋白和T7 RNA聚合酶；重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-1)：(0.1-1.2)；其中，重组酶200-500ng/μL,T7 RNA聚合酶0.2-1U/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为150-300μM、NTPs中每种碱基的浓度均为1-3mM，ATP为1-5mM、醋酸盐为60-100mM、Tris缓冲液为30-100mM、磷酸肌酸为40-100mM，肌酸激酶50-100ng/μL，聚乙二醇35000 5-8％w/v；

所述报告分子浓度为100-500nM；

所述反应启动剂浓度为10mM-30mM；

可选的，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；sgRNA：浓度为100nM；

所述酶组合物：重组酶260ng/μL，重组酶辅助蛋白88ng/μL，单链DNA结合酶300ng/μL，链置换DNA聚合酶90ng/μL，Cas13a蛋白35ng/μL，T7 RNA聚合酶20U；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为240μM、NTPS中每种碱基的浓度均为2mM，ATP为5mM、醋酸盐为100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为40mM，肌酸激酶90ng/μL，聚乙二醇35000 5％w/v，T7 RNA聚合酶20U；

所述报告分子浓度为250nM；

所述反应启动剂浓度为20mM。

一种所述的等温核酸检测试剂盒在核酸检测中的用途；

可选的，在检测核酸突变中的用途；

可选的，所述核酸突变包括单个碱基突变和＞1个碱基突变；

可选的，在检测单核苷酸多态性中的用途。

一种利用所述的等温核酸检测试剂盒的等温核酸检测方法，包括：

取待测核酸，然后利用所述的等温核酸检测试剂盒配制等温核酸检测反应体系，随后恒温反应，并进行检测；

可选的，所述恒温反应的条件为：温度35-42℃，时间为20-60min；

可选的，所述检测中，为实时荧光定量检测。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供了一种用于等温核酸检测的酶组合物，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7 RNA聚合酶和Cas13a蛋白；利用所述酶组合物进行等温核酸检测时，将核酸扩增和检测整合到一起，实现对目的片段的一步法扩增及检测，将会对操作和应用带来极大的方便。

2、本发明提供的一种等温核酸检测试剂盒，包括：酶组合物、扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂；利用所述试剂盒进行等温核酸检测时，将核酸扩增和检测整合到一起，实现对目的片段的一步法扩增及检测。

3、本发明提供的一种等温核酸检测方法，不需要大型仪器设备，可在短时间内，实现目的片段的检测，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。

4、本发明提供的一种等温核酸检测方法，可将等温扩增和CRISPR-Cas13a蛋白检测有机结合起来，可通过在一管中一步法来实现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例6中等温核酸检测的原理；

图2是本发明实施例1中表达载体pET-28a-UvsX的质粒图谱；

图3是本发明实施例2中表达载体pET-28a-UvsY的质粒图谱；

图4是本发明实施例3中表达载体pET-28a-GP32的质粒图谱；

图5是本发明实施例4中表达载体pET-28a-Cas13a的质粒图谱；

图6是本发明实施例6中等温核酸检测结果；

图7是本发明实施例8中等温核酸检测结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中的金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，购自北京百奥莱博科技有限公司，货号MT0192。T7 RNA聚合酶购自ThermoFisher，货号EP0112。

实施例1 UvsX蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码重组酶UvsX的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1，UvsX基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，UvsX基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。委托上海生工合成UvsX基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)，并克隆至pET-28a表达载体的NdeI和SacI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-UvsX，上述表达载体pET-28a-UvsX为委托上海生工合成，其质粒图谱如图2所示。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-UvsX转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan的平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.7mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)UvsX蛋白纯化

首先用缓冲液将其菌体进行超声破碎，取上清，10000rpm离心30min，使用NiSwpharose^TM 6 Fast Flow(购买的公司及货号：GE，11-0008-87AF)在AKTA仪器上纯化，缓冲液冲洗至基线水平，然后用含咪唑浓度为250mM的缓冲液洗脱蛋白，洗脱后的蛋白经过sephadex G25(GE,17-0033-01)色谱柱脱盐(脱盐洗脱溶液：含250mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA)最终得到蛋白，-70℃保存，得到纯化后的UvsX蛋白。

实施例2 UvsY蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码重组酶UvsY的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1。UvsY基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，委托上海生工合成UvsY基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:2所示)，克隆至pET-28a+表达载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，构建得到pET-28a-UvsY表达载体，上述表达载体pET-28a-UvsY表达载体由上海生工合成，其质粒图谱如图3所示。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体UvsY转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/ml Kan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)UvsY蛋白纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的UvsY蛋白。

实施例3GP32蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码单链结合蛋白GP32的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1。GP32基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。委托上海生工合成GP32基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:3所示)，将此片段克隆至pET-28a+表达载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-GP32，上述的表达载体pET-28a-GP32由上海生工合成，其质粒图谱见图4。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-GP32转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)GP32蛋白的纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的GP32蛋白。

实施例4Cas13a蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)编码Cas13a基因序列(Leptotrichia wadei，LwaCas13a)的基因序列，GenBank序列号为NZ_KI271421.1。Cas13a基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。委托上海生工合成Cas13a基因全长片段，将合成的Cas13a基因克隆到T载体上，然后用NdeI和SacI双酶切,并将此片段克隆至pET-28a表达载体的NdeI和SacI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-Cas13a，上述表达载体pET-28a-Cas13a由上海生工合成，其质粒图谱见图5。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-Cas13a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)Cas13a蛋白的纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的Cas13a蛋白。

实施例5一种酶组合物、等温核酸检测试剂盒

酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas13a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：88/260：300/260：90/260：35/260，T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.4U/μL

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，NTPs、ATP，Tris缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，聚乙二醇35000或醋酸钾；

报告分子：序列为：5’-F-UUUUU-Q-3’，其中F为FAM荧光基团，Q为BHQ1淬灭基团；

反应启动剂：醋酸镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA序列见SEQ ID NO:7的6-203位)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA)的sgRNA序列如SEQ ID NO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；

所述报告分子浓度为250nM；

sgRNA浓度为100nM；

所述酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白260ng/μL，实施例2制备的UvsY蛋白88ng/μL，实施例3制备的GP32蛋白300ng/μL，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段90ng/μL，实施例4制备的Cas13a蛋白35ng/μL；T7 RNA聚合酶20U。

所述扩增缓冲液：dNTPs中dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为240μM、NTPs中ATP、UTP、CTP、GTP均为2mM、ATP为5mM、醋酸钾100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为40mM，肌酸激酶90ng/μL，聚乙二醇35000的浓度为5％w/v；

所述反应启动剂浓度为20mM。

实施例6一种等温核酸检测方法

本实施例提供了一种等温核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)采用TAKARA的植物DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取拟南芥(中国农业大学提供)叶片的基因组DNA，备用。

(2)以步骤(1)中的基因组DNA(不同浓度)或双蒸水为模板，然后利用实施例5中的等温核酸检测试剂盒，配制如下的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，各组分终浓度如下：

2μL模板DNA、每条引物420nM、报告分子250nM、260ng/μL RB69来源的UvsX蛋白(实施例1制备)、88ng/μL RB69来源的UvsY蛋白(实施例2制备)、300ng/μL RB69来源的GP32蛋白(实施例3制备)、sgRNA浓度为100nM(序列见SEQ ID NO:8)，90ng/μL金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段以及35ng/μL Cas13a(实施例4制备)、240μM dNTPS(dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度均为240μM)、2mM NTPs(ATP、UTP、CTP、GTP的浓度均为2mM)、5mM ATP、100mM醋酸钾、100mM Tris缓冲液、40mM磷酸肌酸；90ng/μL肌酸激酶；5％(w/v)聚乙二醇35000；T7 RNA聚合酶20U；

进行以下几组反应：

DNA模板为双蒸水，然后加入终浓度为20mM的醋酸镁溶液；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液(拟南芥基因组DNA终浓度为106ng/μL)，然后加入终浓度为20mM的醋酸镁溶液；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液10倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为10.6ng/μL)，然后加入终浓度为20mM的醋酸镁溶液；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液100倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为1.06ng/μL)，然后加入终浓度为20mM的醋酸镁溶液；

将上述反应体系在37℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应60min，程序设置如下：变性(37℃，15s)-复性(37℃，15s)-延伸(37℃，30s)，设定60个循环，检测通道为FAM荧光检测通道。

检测结果如图6所示，本实施例的等温核酸检测方法，可以将核酸的扩增和检测整合到一起，在一个管中一步法反应，本发明的等温核酸检测的原理如图1所示，首先，重组酶和引物组成重组酶/引物二聚体，在与引物序列互补配对的序列处，在单链结合蛋白的参与下，打开双链DNA，形成D环结构，在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，延伸形成新的双链DNA，并将原来双链的一条单链DNA置换下来，最终生成双链DNA，由于正向引物F有T7 RNA聚合酶启动子序列，因此产生的双链DNA具有T7 RNA聚合酶启动子序列，在T7 RNA聚合酶的作用下，转录出单链RNA，并且具有和sgRNA互补的序列，Cas13a蛋白在sgRNA的引导下，识别该单链RNA上的互补序列，进而激发Cas13a的非特异性切割活性，切割体系中的单链RNA报告分子，RNA报告分子被切割后，荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光，被仪器检测到。

实施例7一种等温核酸检测试剂盒

酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas13a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：88/260：300/260：90/260：35/260，T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.4U/μL。

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括上述的酶组合物的冻干粉、独立包装的反应缓冲液和独立包装的醋酸镁溶液。

所述冻干粉的制备方法，包括：

首先，配制混合试剂，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；正向引物(核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)

所述报告分子：序列为：5’-F-UUUUU-Q-3’，其中F为FAM荧光基团，Q为BHQ1淬灭基团，浓度为250nM；

sgRNA浓度为100nM(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)；

所述酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白260ng/μL，实施例2制备的UvsY蛋白88ng/μL，实施例3制备的GP32蛋白300ng/μL，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段90ng/μL，实施例4制备的Cas13a蛋白35ng/μL；T7 RNA聚合酶20U。

所述扩增缓冲液：dNTPs中dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为240μM、NTPs中ATP、UTP、CTP、GTP均为2mM、ATP为5mM、Tris缓冲液为50mM、磷酸肌酸为40mM，肌酸激酶90ng/μL，聚乙二醇35000的浓度为2％w/v；

将上述混合试剂分装到200μL离心管中，-70℃冷冻1-2小时后，冻干机中过夜冻干，得到干粉管。

所述独立包装的醋酸镁溶液浓度为200mM。

所述独立包装的反应缓冲液：100mM Tris缓冲液、200mM醋酸钾、6％(w/v)聚乙二醇35000。

实施例8一种等温核酸检测方法

本实施例提供了一种等温核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)拟南芥基因组DNA提取：同实施例6中步骤(1)，备用。

(2)以步骤(1)中的基因组DNA(不同浓度)或双蒸水为模板，然后利用实施例7中的等温核酸检测试剂盒，配制如下的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，如下表1。

表1

表1中的模板分别为双蒸水、拟南芥基因组DNA原液(拟南芥基因组DNA终浓度为106ng/μL)、10倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为10.6ng/μL)、100倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为1.06ng/μL)。混合均匀后，加入到干粉管中进行反应。

将上述反应体系在37℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应60min，程序设置如下：变性(37℃，15s)-复性(37℃，15s)-延伸(37℃，30s)，设定60个循环，检测通道为FAM荧光检测通道。

检测结果如图7所示，本实施例的等温核酸检测方法，本实施例的冻干后的检测酶组合物，可以很好的将核酸的扩增和检测整合到一起，操作方便，结果良好。

实施例9一种酶组合物、等温核酸检测试剂盒

酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas13a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：0.2：0.77：0.2：0.1，T7RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.2U/μL

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，NTPS、ATP，HEPES缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，聚乙二醇35000或醋酸钠；

报告分子：序列为：5’-F-UUUUU-Q-3’，其中F为TET荧光基团，Q为BHQ2淬灭基团；

反应启动剂：氯化镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA序列见SEQ ID NO:7的6-203位)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA)的sgRNA序列如SEQ ID NO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300nM；

所述报告分子浓度为100nM；

sgRNA浓度为50nM；

所述酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白、实施例2制备的UvsY蛋白、实施例3制备的GP32蛋白、金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段和实施例4制备的Cas13a蛋白的质量比例为1：0.2：0.77：0.2：0.1；其中实施例1制备的UvsX蛋白500ng/μL；T7 RNA聚合酶终浓度为0.2U/μL。

所述扩增缓冲液：dNTPs中dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为150μM、NTPs中ATP、UTP、CTP、GTP均为1mM、ATP为1mM、醋酸钠为60mM，HEPES缓冲液为30mM、磷酸肌酸为100mM，肌酸激酶50ng/μL，聚乙二醇8000的浓度为8％w/v；

所述反应启动剂浓度为10mM。

实施例10

本实施例与实施例6的区别在于，采用实施例9的试剂盒进行等温核酸检测，反应体系在35℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应40min，检测通道为TET荧光检测通道。

实施例11一种酶组合物、等温核酸检测试剂盒

酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas13a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：4.6：2.3：1：1.2，T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为1U/μL；

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，NTPS、ATP，MOPS缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，聚乙二醇35000或醋酸钾；

报告分子：序列为：5’-F-UUUUU-Q-3’，其中F为VIC荧光基团，Q为BHQ3淬灭基团；

反应启动剂：醋酸镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA序列见SEQ ID NO:7的6-203位)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA)的sgRNA序列如SEQ ID NO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为500nM；

所述报告分子浓度为500nM；

sgRNA浓度为200nM；

所述酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白、实施例2制备的UvsY蛋白、实施例3制备的GP32蛋白、金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段和实施例4制备的Cas13a蛋白的质量比例为1：4.6：2.3：1：1.2；其中，实施例1制备的UvsX蛋白200ng/μL；T7 RNA聚合酶的终浓度为1U/μL。

所述扩增缓冲液：dNTPs中dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为300μM、NTPs中ATP、UTP、CTP、GTP均为3mM、ATP为3mM、醋酸钾为100mM、MOPS缓冲液为60mM、磷酸肌酸为70mM，肌酸激酶100ng/μL，聚乙二醇8000的浓度为6％w/v；

所述反应启动剂浓度为30mM。

实施例12

本实施例与实施例6的区别在于，采用实施例11的试剂盒进行等温核酸检测，反应体系在42℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应20min，检测通道为VIC荧光检测通道。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

<110> 北京盛因生物科技有限公司

<120> 一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法

<130> HA202105142

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctgatt taaaatctcg tctgattaaa gcttctactt ctaaaatgac tgcagacttg 60

actaagtcta agctgtttaa taatcgcgat gaagtcccta ctcgtattcc gatgttgaat 120

attgcattag gtggtgcact gaatgcaggg ttgcaatcag gcttaactat ttttgctgct 180

ccttctaaac actttaaaac gttgtttgga ctaactatgg ttgcagcgta tatgaagaaa 240

tataaagatg caatctgttt gttttatgac tcagaattcg gtgcttcaga atcttatttt 300

cgttcaatgg gtgttgattt agaccgtgta gttcatactc cgattcaatc tgtcgaacaa 360

cttaaagttg atatgactaa tcagcttgac gctattgaac gcggtgataa agttattatc 420

tttattgact cgattggtaa tactgcgtct aagaaagaaa ctgaagatgc attgaacgag 480

aaagttgtag gtgatatgtc tcgtgctaag gcacttaaat ctctgttccg cattgtgact 540

ccttatctga ctattaaaga tattccatgt gttgcaatca accatacagc aatggaaatt 600

ggcggattgt atcctaaaga gattatgggt ggtggtacag gtattcttta ttctgccaac 660

acggtatttt ttatctctaa acgtcaggtt aaagaaggta cagaattgac cggttatgac 720

ttcacgttga aagcagaaaa atctcgcacc gttaaagaaa aatctacttt cccaatcacg 780

gttaattttg atggtggtat cgacccattc agtggcttgt tagaaatggc aactgaaatc 840

ggttttgtgg ttaagcctaa agccgggtgg tatgctcgtg aattccttga cgaagaaaca 900

ggtgaaatga ttcgtgaaga gaaatcgtgg cgtgctaaag ctactgattg tgtagaattc 960

tggggaccgt tgtttaaaca caaacctttc cgagatgcaa ttgaaactaa atataaacta 1020

ggtgctatct cttctattaa agaagttgat gacgctgtta acgaccttat taattgcaaa 1080

gcaacaacta aagttccggt taaaacttct gatgctccgt ctgcagcaga tatagaaaac 1140

gaccttgacg aaatggaaga tttcgatgaa taa 1173

<210> 2

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcttcaag gcaacctatg tataatggtt ttaggtcctt ccgatacagc cgggagatta 60

ttagttaaaa gagagaatat tatgaagctg gaagatttac aggaagagtt agacgcagac 120

ttagctattg atacgacaaa gttgcaatat gagacggcga ataatgttaa gttatacagc 180

aaatggctac gtaagcactc atttattcgt aaagaaatgt tgcgtataga gactcagaag 240

aaaactgctc taaaagcaag attagactac tactcgggac gaggtgatgg tgatgaattc 300

agtatggacc gatacgagaa atctgaaatg aaaactgtcc tggccgcaga taaagatgtg 360

cttaaaatag agactacttt acaatactgg ggaattttac ttgagttctg tagtggtgca 420

cttgatgcgg ttaagtctcg tagttttgca cttaaacata ttcaagatat gcgagaattt 480

gaagcggggc aataa 495

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtttaaac gtaaaagtac cgcagacctc gcagctcaga tggctaaact gaatggtaac 60

aaaggtttct cttcagaaga taaaggtgaa tggaagctga aactcgatgc atccggtaat 120

ggtcaagcgg taattcgttt cctgccggca aaaacagatg acgcacttcc gtttgcaatt 180

cttgttaacc acgggttcaa gaaaaatggc aaatggtata ttgaaacctg ttcatctaca 240

cacggcgatt atgactcttg tcctgtatgt cagtacatta gtaaaaatga cctgtacaat 300

accaacaaaa ctgaatattc tcaactgaaa cgtaaaactt cttattgggc taatattctg 360

gttgttaaag acccacaagc tccagataat gaaggtaagg tattcaaata ccgttttggt 420

aaaaagattt gggacaaaat caatgcaatg attgcagttg atactgaaat gggtgaaact 480

cctgttgatg taacttgtcc atgggaaggt gctaactttg tgctgaaagt taaacaggtt 540

tctggtttca gtaactatga cgaatctaaa ttcctgaatc aatctgcgat tccaaacatt 600

gatgatgaat ctttccagaa agaattgttc gaacaaatgg ttgacctttc tgaaatgact 660

tctaaagata agttcaaatc gtttgaagaa ttgaatacta aatttaatca agttcttggt 720

actgccgctc tgggtggtgc agcagccgca gcagcttctg ttgcagataa agttgcttct 780

gacctcgacg attttgataa agacatggaa gcctttagtt ctgcaaaaac tgaagatgac 840

ttcatgagtt cctcgtcttc tgacgatggc gacctcgatg acctgttagc tggtctataa 900

<210> 4

<211> 3459

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaagtga ccaaggtcga cggcatcagc cacaagaagt acatcgaaga gggcaagctc 60

gtgaagtcca ccagcgagga aaaccggacc agcgagagac tgagcgagct gctgagcatc 120

cggctggaca tctacatcaa gaaccccgac aacgcctccg aggaagagaa ccggatcaga 180

agagagaacc tgaagaagtt ctttagcaac aaggtgctgc acctgaagga cagcgtgctg 240

tatctgaaga accggaaaga aaagaacgcc gtgcaggaca agaactatag cgaagaggac 300

atcagcgagt acgacctgaa aaacaagaac agcttctccg tgctgaagaa gatcctgctg 360

aacgaggacg tgaactctga ggaactggaa atctttcgga aggacgtgga agccaagctg 420

aacaagatca acagcctgaa gtacagcttc gaagagaaca aggccaacta ccagaagatc 480

aacgagaaca acgtggaaaa agtgggcggc aagagcaagc ggaacatcat ctacgactac 540

tacagagaga gcgccaagcg caacgactac atcaacaacg tgcaggaagc cttcgacaag 600

ctgtataaga aagaggatat cgagaaactg tttttcctga tcgagaacag caagaagcac 660

gagaagtaca agatccgcga gtactatcac aagatcatcg gccggaagaa cgacaaagag 720

aacttcgcca agattatcta cgaagagatc cagaacgtga acaacatcaa agagctgatt 780

gagaagatcc ccgacatgtc tgagctgaag aaaagccagg tgttctacaa gtactacctg 840

gacaaagagg aactgaacga caagaatatt aagtacgcct tctgccactt cgtggaaatc 900

gagatgtccc agctgctgaa aaactacgtg tacaagcggc tgagcaacat cagcaacgat 960

aagatcaagc ggatcttcga gtaccagaat ctgaaaaagc tgatcgaaaa caaactgctg 1020

aacaagctgg acacctacgt gcggaactgc ggcaagtaca actactatct gcaagtgggc 1080

gagatcgcca cctccgactt tatcgcccgg aaccggcaga acgaggcctt cctgagaaac 1140

atcatcggcg tgtccagcgt ggcctacttc agcctgagga acatcctgga aaccgagaac 1200

gagaacgata tcaccggccg gatgcggggc aagaccgtga agaacaacaa gggcgaagag 1260

aaatacgtgt ccggcgaggt ggacaagatc tacaatgaga acaagcagaa cgaagtgaaa 1320

gaaaatctga agatgttcta cagctacgac ttcaacatgg acaacaagaa cgagatcgag 1380

gacttcttcg ccaacatcga cgaggccatc agcagcatca gacacggcat cgtgcacttc 1440

aacctggaac tggaaggcaa ggacatcttc gccttcaaga atatcgcccc cagcgagatc 1500

tccaagaaga tgtttcagaa cgaaatcaac gaaaagaagc tgaagctgaa aatcttcaag 1560

cagctgaaca gcgccaacgt gttcaactac tacgagaagg atgtgatcat caagtacctg 1620

aagaatacca agttcaactt cgtgaacaaa aacatcccct tcgtgcccag cttcaccaag 1680

ctgtacaaca agattgagga cctgcggaat accctgaagt ttttttggag cgtgcccaag 1740

gacaaagaag agaaggacgc ccagatctac ctgctgaaga atatctacta cggcgagttc 1800

ctgaacaagt tcgtgaaaaa ctccaaggtg ttctttaaga tcaccaatga agtgatcaag 1860

attaacaagc agcggaacca gaaaaccggc cactacaagt atcagaagtt cgagaacatc 1920

gagaaaaccg tgcccgtgga atacctggcc atcatccaga gcagagagat gatcaacaac 1980

caggacaaag aggaaaagaa tacctacatc gactttattc agcagatttt cctgaagggc 2040

ttcatcgact acctgaacaa gaacaatctg aagtatatcg agagcaacaa caacaatgac 2100

aacaacgaca tcttctccaa gatcaagatc aaaaaggata acaaagagaa gtacgacaag 2160

atcctgaaga actatgagaa gcacaatcgg aacaaagaaa tccctcacga gatcaatgag 2220

ttcgtgcgcg agatcaagct ggggaagatt ctgaagtaca ccgagaatct gaacatgttt 2280

tacctgatcc tgaagctgct gaaccacaaa gagctgacca acctgaaggg cagcctggaa 2340

aagtaccagt ccgccaacaa agaagaaacc ttcagcgacg agctggaact gatcaacctg 2400

ctgaacctgg acaacaacag agtgaccgag gacttcgagc tggaagccaa cgagatcggc 2460

aagttcctgg acttcaacga aaacaaaatc aaggaccgga aagagctgaa aaagttcgac 2520

accaacaaga tctatttcga cggcgagaac atcatcaagc accgggcctt ctacaatatc 2580

aagaaatacg gcatgctgaa tctgctggaa aagatcgccg ataaggccaa gtataagatc 2640

agcctgaaag aactgaaaga gtacagcaac aagaagaatg agattgaaaa gaactacacc 2700

atgcagcaga acctgcaccg gaagtacgcc agacccaaga aggacgaaaa gttcaacgac 2760

gaggactaca aagagtatga gaaggccatc ggcaacatcc agaagtacac ccacctgaag 2820

aacaaggtgg aattcaatga gctgaacctg ctgcagggcc tgctgctgaa gatcctgcac 2880

cggctcgtgg gctacaccag catctgggag cgggacctga gattccggct gaagggcgag 2940

tttcccgaga accactacat cgaggaaatt ttcaatttcg acaactccaa gaatgtgaag 3000

tacaaaagcg gccagatcgt ggaaaagtat atcaacttct acaaagaact gtacaaggac 3060

aatgtggaaa agcggagcat ctactccgac aagaaagtga agaaactgaa gcaggaaaaa 3120

aaggacctgt acatccggaa ctacattgcc cacttcaact acatccccca cgccgagatt 3180

agcctgctgg aagtgctgga aaacctgcgg aagctgctgt cctacgaccg gaagctgaag 3240

aacgccatca tgaagtccat cgtggacatt ctgaaagaat acggcttcgt ggccaccttc 3300

aagatcggcg ctgacaagaa gatcgaaatc cagaccctgg aatcagagaa gatcgtgcac 3360

ctgaagaatc tgaagaaaaa gaaactgatg accgaccgga acagcgagga actgtgcgaa 3420

ctcgtgaaag tcatgttcga gtacaaggcc ctggaataa 3459

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatacgact cactataggt acataatcgg agaaatacag attacagag 49

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgaaggaaa cactagccgc gacgttgaag 30

<210> 7

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acaaatacat aatcggagaa atacagatta cagagagcga gagagatcga cggcgaagct 60

ctttacccgg aaaccattga aatcggacgg tttagtgaaa atggaggatc aagttgggtt 120

tgggttccgt ccgaacgacg aggagctcgt tggtcactat ctccgtaaca aaatcgaagg 180

aaacactagc cgcgacgttg aagtagccat cagcg 215

<210> 8

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccuuu acccggaaac cauugaaauc 60

ggac 64

<210> 9

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Ser Asp Leu Lys Ser Arg Leu Ile Lys Ala Ser Thr Ser Lys Met

1 5 10 15

Thr Ala Asp Leu Thr Lys Ser Lys Leu Phe Asn Asn Arg Asp Glu Val

20 25 30

Pro Thr Arg Ile Pro Met Leu Asn Ile Ala Leu Gly Gly Ala Leu Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Gln Ser Gly Leu Thr Ile Phe Ala Ala Pro Ser Lys His

50 55 60

Phe Lys Thr Leu Phe Gly Leu Thr Met Val Ala Ala Tyr Met Lys Lys

65 70 75 80

Tyr Lys Asp Ala Ile Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Phe Gly Ala Ser

85 90 95

Glu Ser Tyr Phe Arg Ser Met Gly Val Asp Leu Asp Arg Val Val His

100 105 110

Thr Pro Ile Gln Ser Val Glu Gln Leu Lys Val Asp Met Thr Asn Gln

115 120 125

Leu Asp Ala Ile Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Ile Phe Ile Asp Ser

130 135 140

Ile Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Thr Glu Asp Ala Leu Asn Glu

145 150 155 160

Lys Val Val Gly Asp Met Ser Arg Ala Lys Ala Leu Lys Ser Leu Phe

165 170 175

Arg Ile Val Thr Pro Tyr Leu Thr Ile Lys Asp Ile Pro Cys Val Ala

180 185 190

Ile Asn His Thr Ala Met Glu Ile Gly Gly Leu Tyr Pro Lys Glu Ile

195 200 205

Met Gly Gly Gly Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Ala Asn Thr Val Phe Phe

210 215 220

Ile Ser Lys Arg Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Leu Thr Gly Tyr Asp

225 230 235 240

Phe Thr Leu Lys Ala Glu Lys Ser Arg Thr Val Lys Glu Lys Ser Thr

245 250 255

Phe Pro Ile Thr Val Asn Phe Asp Gly Gly Ile Asp Pro Phe Ser Gly

260 265 270

Leu Leu Glu Met Ala Thr Glu Ile Gly Phe Val Val Lys Pro Lys Ala

275 280 285

Gly Trp Tyr Ala Arg Glu Phe Leu Asp Glu Glu Thr Gly Glu Met Ile

290 295 300

Arg Glu Glu Lys Ser Trp Arg Ala Lys Ala Thr Asp Cys Val Glu Phe

305 310 315 320

Trp Gly Pro Leu Phe Lys His Lys Pro Phe Arg Asp Ala Ile Glu Thr

325 330 335

Lys Tyr Lys Leu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Lys Glu Val Asp Asp Ala

340 345 350

Val Asn Asp Leu Ile Asn Cys Lys Ala Thr Thr Lys Val Pro Val Lys

355 360 365

Thr Ser Asp Ala Pro Ser Ala Ala Asp Ile Glu Asn Asp Leu Asp Glu

370 375 380

Met Glu Asp Phe Asp Glu

385 390

<210> 10

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Leu Gln Gly Asn Leu Cys Ile Met Val Leu Gly Pro Ser Asp Thr

1 5 10 15

Ala Gly Arg Leu Leu Val Lys Arg Glu Asn Ile Met Lys Leu Glu Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Glu Leu Asp Ala Asp Leu Ala Ile Asp Thr Thr Lys Leu

35 40 45

Gln Tyr Glu Thr Ala Asn Asn Val Lys Leu Tyr Ser Lys Trp Leu Arg

50 55 60

Lys His Ser Phe Ile Arg Lys Glu Met Leu Arg Ile Glu Thr Gln Lys

65 70 75 80

Lys Thr Ala Leu Lys Ala Arg Leu Asp Tyr Tyr Ser Gly Arg Gly Asp

85 90 95

Gly Asp Glu Phe Ser Met Asp Arg Tyr Glu Lys Ser Glu Met Lys Thr

100 105 110

Val Leu Ala Ala Asp Lys Asp Val Leu Lys Ile Glu Thr Thr Leu Gln

115 120 125

Tyr Trp Gly Ile Leu Leu Glu Phe Cys Ser Gly Ala Leu Asp Ala Val

130 135 140

Lys Ser Arg Ser Phe Ala Leu Lys His Ile Gln Asp Met Arg Glu Phe

145 150 155 160

Glu Ala Gly Gln

<210> 11

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Asp Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu

35 40 45

Pro Ala Lys Thr Asp Asp Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His

50 55 60

Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Asn Thr Asn Lys Thr Glu Tyr Ser Gln Leu Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Ser Tyr Trp Ala Asn Ile Leu Val Val Lys Asp Pro Gln Ala Pro

115 120 125

Asp Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe Gly Lys Lys Ile Trp

130 135 140

Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Thr Glu Met Gly Glu Thr

145 150 155 160

Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala Asn Phe Val Leu Lys

165 170 175

Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Ser Lys Phe Leu

180 185 190

Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu Ser Phe Gln Lys Glu

195 200 205

Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met Thr Ser Lys Asp Lys

210 215 220

Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly

225 230 235 240

Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala Asp

245 250 255

Lys Val Ala Ser Asp Leu Asp Asp Phe Asp Lys Asp Met Glu Ala Phe

260 265 270

Ser Ser Ala Lys Thr Glu Asp Asp Phe Met Ser Ser Ser Ser Ser Asp

275 280 285

Asp Gly Asp Leu Asp Asp Leu Leu Ala Gly Leu

290 295

<210> 12

<211> 1152

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu

1100 1105 1110

Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys

1115 1120 1125

Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys

1130 1135 1140

Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1145 1150

Claims (10)

1.一种用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7 RNA聚合酶和Cas13a蛋白。

2.根据权利要求1所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX蛋白、T6 UvsX蛋白或Rb69 UvsX蛋白；或

所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY蛋白、T6 UvsY蛋白或Rb69 UvsY蛋白；或

所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4GP32蛋白、T6 GP32蛋白或Rb69 GP32蛋白；或

所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或

所述Cas13a蛋白为韦德纤毛菌来源的LwCas13a蛋白。

3.根据权利要求2所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述UvsX蛋白为如下A1)-A2)中任意一种：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

A2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述UvsY蛋白为如下B1)-B2)中任意一种：

B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

B2)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

单链结合蛋白GP32为如下C1)-C2)中任意一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

C2)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述Cas13a蛋白为如下D1)-D2)中任意一种：

D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

D2)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物中，重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-1)：(0.1-1.2)；T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.2-1U/μL。

可选的，所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。

5.一种等温核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的用于等温核酸检测的酶组合物；

可选的，还包括扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂中的至少一种；

可选的，所述等温核酸检测试剂盒中，分为独立包装的三部分，第一部分为包括酶组合物、扩增缓冲液和报告分子的冻干粉，第二部分为反应缓冲液，第三部分为反应启动剂；所述反应缓冲液中含有缓冲液A、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述扩增缓冲液中包含dNTPs、NTPs、ATP、缓冲液A、磷酸肌酸、肌酸激酶、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述缓冲液A包括Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPS缓冲液；

可选的，所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠；

可选的，所述拥挤试剂包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或聚蔗糖；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量范围为8000-35000的聚乙二醇；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量为35000的聚乙二醇。

6.根据权利要求5所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述报告分子为单链RNA，所述单链RNA的一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团；

可选的，所述单链RNA的5’端修饰荧光基团F，3’端修饰淬灭基团Q；

可选的，所述报告分子为：5’-F-UUUUU-Q-3’；

可选的，所述荧光基团F为FAM、HEX、TET、JOE或VIC，淬灭基团Q为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

7.根据权利要求5或6所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应启动剂为含Mg²⁺的溶液；

可选的，所述反应启动剂为醋酸镁溶液或氯化镁溶液；

可选的，还包括：针对待测核酸设计的正向引物和反向引物；和/或

针对待测核酸的sgRNA；

可选的，所述正向引物或反向引物中一条引物中含有T7 RNA聚合酶启动子序列；

可选的，待测核酸为DNA或RNA；可选的，所述DNA为双链DNA或单链DNA；

可选的，待测核酸为RNA时，所述酶组合物中还包括逆转录酶；可选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。

8.根据权利要求5-7任一项所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，利用所述的等温核酸检测试剂盒配制的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300-500nM；sgRNA：浓度为50-200nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶、Cas13a蛋白和T7RNA聚合酶；重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-1)：(0.1-1.2)；其中，重组酶200-500ng/μL,T7 RNA聚合酶0.2-1U/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为150-300μM、NTPs中每种碱基的浓度均为1-3mM，ATP为1-5mM、醋酸盐为60-100mM、Tris缓冲液为30-100mM、磷酸肌酸为40-100mM，肌酸激酶50-100ng/μL，聚乙二醇35000为5-8％w/v；

所述报告分子浓度为100-500nM；

所述反应启动剂浓度为10mM-30mM；

可选的，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；sgRNA：浓度为100nM；

所述酶组合物：重组酶260ng/μL，重组酶辅助蛋白88ng/μL，单链DNA结合酶300ng/μL，DNA聚合酶90ng/μL，Cas13a蛋白35ng/μL，T7 RNA聚合酶20U；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为240μM、NTP中每种碱基的浓度均为2mM，ATP为5mM、醋酸盐为100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为40mM，肌酸激酶90ng/μL，聚乙二醇35000 5％w/v，T7 RNA聚合酶20U；

所述报告分子浓度为250nM；

所述反应启动剂浓度为20mM。

9.一种如权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒在核酸检测中的用途；

可选的，在检测核酸突变中的用途；

可选的，所述核酸突变包括单个碱基突变和＞1个碱基突变；

可选的，在检测单核苷酸多态性中的用途。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的等温核酸检测的酶组合物或权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒的等温核酸检测方法，其特征在于，包括：

取待测核酸，然后利用权利要求1-4任一项所述的等温核酸检测的酶组合物或权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒配制等温核酸检测反应体系，随后恒温反应，并进行检测；

可选的，所述恒温反应的条件为：温度35-42℃，时间为20-60min；

可选的，所述检测中，为实时荧光定量检测。

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