CN114561456A - 一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。本发明提供的一种等温核酸检测的酶组合物，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白；利用所述酶组合物进行等温核酸检测时，无需对扩增产物进行单链化处理，实现对目的片段的一步法扩增及检测。

Description

一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。

背景技术

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌种抵御病毒入侵的一种获得性免疫的方式。当病毒入侵时，细菌或古细菌生成对应的能识别病毒基因组的向导RNA，可以引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶序列进行识别和切割。

CRISPR-Cas蛋白系统分为两大类，第一大类的Cas蛋白为多亚基组成的多蛋白效应复合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第二大类的Cas蛋白为单效应蛋白，包括Ⅱ型的Cas9a、Ⅴ型的Cas12a和Cas14a，Ⅵ型的Cas13a。近年来，运用Cas12a和Cas13a蛋白的附带切割效应，CRISPR-Cas蛋白在核酸检测中有良好的应用，Cas12a蛋白擅长识别双链DNA，Cas13a蛋白擅长识别单链RNA，Cas14a蛋白擅长识别单链DNA，因而RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。Cas12a也可以检测单链DNA，但通过比较Cas12a蛋白和Cas14a蛋白检测单核苷酸多态性(SNP)的能力，发现Cas14a蛋白的特异性强可实现高保真的SNP基因分型。鉴于Cas14a蛋白优秀的高保真检测功能，如何利用Cas14蛋白来检测核酸越来越引起人们的关注。

在检测核酸时，由于核酸的数量比较少，通常需要先将核酸进行扩增，再对扩增产物进行检测，而Cas14a蛋白所检测的DNA为单链DNA，这就需要首先生成单链DNA，而一般的常用的PCR扩增方法产物都是双链DNA，这样要求在使用Cas14蛋白检测时，需要将双链DNA变成单链DNA再进行检测，而且由于扩增和检测需要分开进行，增加了操作的复杂性和污染的风险。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的Cas14蛋白检测核酸技术操作复杂、并且需要两步法检测的缺陷，从而提供一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法，将核酸扩增和Cas14蛋白检测相结合，在检测过程中，无需对扩增产物进行单链化处理，操作简单、反应速度快，将会极大的解决使用Cas14蛋白在核酸检测过程中的缺陷。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种等温核酸检测的酶组合物，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白。

可选的，所述的重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX、T6UvsX或Rb69 UvsX；或

所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4GP32、T6 GP32或Rb69 GP32；或

所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或

所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY、T6 UvsY或Rb69 UvsY。

可选的，所述UvsX蛋白为如下A 1)-A 2)中任意一种：

A 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

A 2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述UvsY蛋白为如下B1)-B2)中任意一种：

B 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

B2)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

单链结合蛋白GP32为如下C1)-C2)中任意一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

C2)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述Cas14a蛋白为如下D1)-D2)中任意一种：

D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

D2)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白。

可选的，所述酶组合物中，重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-0.8)：(0.1-1.5)；

可选的，所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。

一种等温核酸检测试剂盒，包括：酶组合物；

可选的，还包括扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂中的至少一项；

可选的，所述扩增缓冲液中含有dNTPs、ATP、缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、dNTPs、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述缓冲液包括Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPS缓冲液；

可选的，所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠；

可选的，所述拥挤试剂包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或聚蔗糖；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量范围为8000-35000聚乙二醇；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量为35000聚乙二醇。

可选的，所述报告分子为单链DNA，所述单链DNA的一端修饰荧光基团，另一端修饰猝灭基团；

可选的，所述单链DNA5’修饰荧光基团F，3’修饰猝灭基团Q；

可选的，所述报告分子为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’；

可选的，所述荧光基团F为FAM、HEX、TET、JOE或VIC，猝灭基团Q为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

所述反应启动剂为含Mg²⁺的溶液；

可选的，所述反应启动剂为醋酸镁溶液或氯化镁溶液；

可选的，还包括：针对待测核酸设计的正向引物和反向引物；和/或

针对待测核酸的sgRNA；

可选的，待测核酸为DNA或RNA；可选的，所述DNA为双链DNA或单链DNA；

可选的，待测核酸为RNA时，所述酶组合物中还包括逆转录酶；可选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。

可选的，利用所述的等温核酸检测试剂盒配制的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300-500nM；sgRNA：浓度为50-200nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-0.8)：(0.1-1.5)；其中，重组酶200-500ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为150-300μM、ATP为1-5mM、醋酸钾为60-100mM、Tris缓冲液为30-100mM、磷酸肌酸为50-100mM，肌酸激酶50-100ng/μL，聚乙二醇35000 5-8％w/v；

所述报告分子浓度为100-500nM；

所述反应启动剂浓度为10mM-30mM

可选的，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；sgRNA：浓度为100nM；

所述酶组合物：重组酶260ng/μL，重组酶辅助蛋白98ng/μL，单链DNA结合酶280ng/μL，链置换DNA聚合酶88ng/μL，Cas14a蛋白100ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为240μM、ATP为5mM、醋酸钾为100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为60mM，肌酸激酶80ng/μL，聚乙二醇35000 7.72％w/v；

所述报告分子浓度为250nM；

所述反应启动剂浓度为25mM。

可选的，所述等温核酸检测试剂盒中，分为独立包装的三部分，第一部分为包括酶组合物、扩增缓冲液和报告分子的冻干粉，第二部分为反应缓冲液，第三部分为反应启动剂。

一种所述的等温核酸检测试剂盒在核酸检测中的用途；

可选的，在检测核酸中的用途；

可选的，在检测核酸突变中的用途；

可选的，所述核酸突变包括单个碱基突变和＞1个碱基突变；

可选的，在检测单核苷酸多态性中的用途。

一种利用所述的等温核酸检测试剂盒的等温核酸检测方法，包括：

取待测核酸，然后利用所述的等温核酸检测试剂盒配制等温核酸检测反应体系，随后恒温反应，并进行检测；

可选的，所述恒温反应的条件为：温度35-42℃，时间为20-60min；

可选的，所述检测中，为实时荧光定量检测

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的一种等温核酸检测酶组合物，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白；利用所述酶组合物进行等温核酸检测时，无需对扩增产物进行单链化处理，实现对目的片段的一步法扩增及检测。

2、本发明提供的一种等温核酸检测方法，不需要大型仪器设备，可在短时间内，实现目的片段的检测，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。

3、本发明提供的一种等温核酸检测方法，可将等温扩增和CRISPR-Cas14蛋白检测有机结合起来，可通过在一管中一步法来实现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例6中等温核酸检测的原理；

图2是本发明实施例1中表达载体pET-28a-UvsX的质粒图谱；

图3是本发明实施例2中表达载体pET-28a-UvsY的质粒图谱；

图4是本发明实施例3中表达载体pET-28a-GP32的质粒图谱；

图5是本发明实施例4中表达载体pET-28a-Cas14a的质粒图谱；

图6是本发明实施例6中等温核酸检测结果；

图7是本发明实施例8中等温核酸检测结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中的金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，购自北京百奥莱博科技有限公司，货号MT0192。

实施例1UvsX蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码重组酶UvsX的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1，UvsX基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，UvsX基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。委托上海生工合成UvsX基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)，并克隆pET-28a表达载体的NdeI和SacI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-UvsX，上述表达载体pET-28a-UvsX为委托上海生工合成，其质粒图谱如图2所示。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-UvsX转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan的平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.7mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)UvsX蛋白纯化

首先用缓冲液将其菌体进行超声破碎，取上清，10000rpm离心30min，使用NiSwpharose^TM 6Fast Flow(购买的公司及货号：GE，11-0008-87AF)在AKTA仪器上纯化，缓冲液冲洗至基线水平，然后用含咪唑浓度为250mM的缓冲液洗脱蛋白，洗脱后的蛋白经过sephadex G25(GE,17-0033-01)色谱柱脱盐(脱盐洗脱溶液：含250mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA)最终得到蛋白，-70℃保存，得到纯化后的UvsX蛋白。

实施例2UvsY蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码重组酶UvsY的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1。UvsY基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，委托上海生工合成UvsY基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:2所示)，克隆至pET-28a+表达载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，构建得到pET-28a-UvsY表达载体，上述表达载体pET-28a-UvsY表达载体由上海生工合成，其质粒图谱如图3所示。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体UvsY转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/ml Kan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)UvsY蛋白纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的UvsY蛋白。

实施例3GP32蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找埃希氏杆菌属噬菌体RB69病毒(Enterobacteria phage RB69)编码单链结合蛋白GP32的基因序列，GenBank序列号为NC_004928.1。GP32基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。委托上海生工合成GP32基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:3所示)，将此片段克隆至pET-28a+表达载体的NdeI和BanHI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-GP32，上述的表达载体pET-28a-GP32由上海生工合成，其质粒图谱见图4。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-GP32转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)GP32蛋白的纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的GP32蛋白。

实施例4Cas14a蛋白的获取

(1)构建表达载体

在NCBI上查找古细菌(GenBank:MK005732.1)的Cas14a蛋白的基因序列。Cas14a基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。委托上海生工合成Cas14a基因全长片段(核苷酸序列如SEQ ID No:4所示)，将合成的Cas14a基因克隆到T载体上，然后用NheI和BamHI双酶切，并将此片段克隆至pET-28a表达载体的NheI和BamHI酶切位点之间，构建表达载体pET-28a-Cas14a，上述表达载体pET-28a-Cas14a由上海生工合成，其质粒图谱见图5。

(2)构建重组工程菌及发酵

将重组表达载体pET-28a-Cas14a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含30μg/mlKan平板(LB琼脂平板)上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1L终浓度为30μg/ml的Kan的LB液体培养基中培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。

(3)Cas14a蛋白的纯化

同实施例1中“(3)UvsX蛋白纯化”的步骤，得到纯化后的Cas14a蛋白。

实施例5一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒

本实施例提供了一种等温核酸检测酶组合物，包括：

实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas14a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶I大片段和Cas14a蛋白的质量比为1：98/260：280/260：88/260：100/260。

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，ATP，醋酸钾，Tris缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，和聚乙二醇35000；

报告分子：序列为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’，其中F为FAM荧光基团，Q为BHQ1猝灭基团；

反应启动剂：醋酸镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA，靶序列见SEQ ID NO:7)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸的sgRNA,sgRNA序列如SEQ ID NO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；sgRNA浓度为100nM；

所述酶组合物：实施例1制备的UvsX蛋白260ng/μL，实施例2制备的UvsY蛋白98ng/μL，实施例3制备的GP32蛋白280ng/μL，DNA聚合酶88ng/μL，实施例4制备的Cas14a蛋白100ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为240μM、ATP为5mM、醋酸钾为100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为60mM，肌酸激酶80ng/μL，聚乙二醇35000的浓度为7.72％w/v；

所述报告分子浓度为250nM；

所述反应启动剂：醋酸镁溶液浓度为25mM。

实施例6一种等温核酸检测方法

本实施例提供了一种等温核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)采用TAKARA的植物DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取拟南芥(中国农业大学提供)叶片的基因组DNA，备用。

(2)以步骤(1)中的基因组DNA(不同浓度)或双蒸水为模板，然后利用实施例5中的等温核酸检测试剂盒，配制如下的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，各组分浓度如下：

2μL模板DNA、每条引物420nM、报告分子250nM、260ng/μL的UvsX蛋白、98ng/μL的UvsY蛋白、280ng/μL的GP32蛋白、sgRNA浓度为100nM(序列见SEQ ID NO:8)，88ng/μL的DNA聚合酶大片段以及100ng/μL的Cas14a、240μM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP中各240μM)、5mM ATP、100mM醋酸钾、100mM Tris缓冲液、60mM磷酸肌酸，80ng/μL肌酸激酶，7.72％(w/v)聚乙二醇35000；

进行以下几组反应：DNA模板为双蒸水，加入终浓度为25mM的醋酸镁启动剂；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液(拟南芥基因组DNA终浓度为114ng/μL)，加入终浓度为25mM的醋酸镁启动剂；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液10倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为11.4ng/μL)，加入终浓度为25mM的醋酸镁启动剂；或

DNA模板为拟南芥基因组DNA原液100倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为1.14ng/μL)，加入终浓度为25mM的醋酸镁启动剂；

将上述反应体系在37℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应60min，程序设置如下：变性(37℃，15s)-复性(37℃，15s)-延伸(37℃，30s)，设定60个循环，检测通道为FAM荧光检测通道。

检测结果如图6所示，本实施例的等温核酸检测方法，可以将核酸的扩增和检测整合到一起，在一个管中一步法反应，本发明的等温核酸检测的原理如图1所示，首先，重组酶和引物组成重组酶/引物二聚体，在于引物序列互补配对的序列处，在单链结合蛋白的参与下，打开双链DNA，形成D环结构，在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，延伸形成新的双链DNA，并将原来双链的一条单链DNA置换下来，由于有单链结合蛋白的存在，该单链DNA呈现单链状态，并且具有和sgRNA互补的序列，Cas14a蛋白在sgRNA的引导下，识别该单链DNA上的互补序列，进而激发Cas14a的非特异性切割活性，切割体系中的单链DNA报告分子，DNA报告分子被切割后，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光，被仪器检测到。

实施例7一种等温核酸检测试剂盒

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括由如下配制的混合试剂制成的冻干粉、独立包装的反应缓冲液和独立包装的醋酸镁溶液。

所述冻干粉的制备方法，包括：

首先，配制混合试剂，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

正向引物和反向引物的浓度各为420nM；正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)；

实施例1制备的UvsX蛋白260ng/μL，实施例2制备的UvsY蛋白98ng/μL，实施例3制备的GP32蛋白280ng/μL，DNA聚合酶88ng/μL，实施例4制备的Cas14a蛋白100ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度为240μM、ATP为5mM、Tris缓冲液为50mM、磷酸肌酸为60mM，肌酸激酶80ng/μL，聚乙二醇35000的浓度为4.72％w/v；

所述报告分子浓度为250nM；报告分子：序列为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’，其中F为FAM荧光基团，Q为BHQ1猝灭基团；

sgRNA(如SEQ ID NO:8所示)浓度为100nM；

将上述混合试剂分装到200μL离心管中，-70℃冷冻1-2小时，得到干粉管。

所述独立包装的醋酸镁溶液浓度为200mM。

所述独立包装的反应缓冲液：100mM Tris缓冲液、200mM醋酸钾、6％(w/v)聚乙二醇35000。

实施例8一种等温核酸检测方法

本实施例提供了一种等温核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)拟南芥基因组DNA提取：同实施例6中步骤(1)，备用。

(2)以步骤(1)中的基因组DNA(不同浓度)或双蒸水为模板，然后利用实施例7中的等温核酸检测试剂盒，配制如下的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，如下表1。

表1

表1中的模板分别为双蒸水、拟南芥基因组DNA原液(拟南芥基因组DNA终浓度为114ng/μL)、10倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为11.4ng/μL)、100倍体积稀释的拟南芥基因组DNA(拟南芥基因组DNA终浓度为1.14ng/μL)。混合均匀后，加入到干粉管(实施例7)中进行反应。

将上述反应体系在37℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应60min，程序设置如下：变性(37℃，15s)-复性(37℃，15s)-延伸(37℃，30s)，设定60个循环，检测通道为FAM荧光检测通道。

检测结果如图7所示，本实施例的等温核酸检测方法，可以将核酸的扩增和检测整合到一起，在一个管中一步法反应，操作方便。

实施例9一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒

本实施例提供了一种等温核酸检测酶组合物，包括：

实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas14a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶I大片段和Cas14a蛋白的质量比为1：0.2：0.77：0.2：0.1。

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，ATP，醋酸钾，HEPES缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，和聚乙二醇35000；

报告分子：序列为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’，其中F为HEX荧光基团，Q为BHQ2猝灭基团；

反应启动剂：醋酸镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(序列见SEQ ID NO:7)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸的sgRNA,sgRNA序列如SEQ ID NO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300nM；sgRNA：浓度为50nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：0.2：0.77：0.2：0.1；其中，重组酶200ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为150μM、ATP为5mM、醋酸钾为60mM、HEPES缓冲液为30mM、磷酸肌酸为100mM，肌酸激酶50ng/μL，聚乙二醇35000 8％w/v；

所述报告分子浓度为100nM；

所述反应启动剂：醋酸镁溶液浓度为30mM。

实施例10一种等温核酸检测方法

本实施例与实施例6的区别在于，采用实施例9的试剂盒进行等温核酸检测，反应体系在35℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应40min，检测通道为HEX荧光检测通道。

实施例11一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒

本实施例提供了一种等温核酸检测酶组合物，包括：

实施例1制备的UvsX蛋白，实施例2制备的UvsY蛋白，实施例3制备的GP32蛋白，金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I大片段，实施例4制备的Cas14a蛋白；上述的UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、DNA聚合酶I大片段和Cas14a蛋白的质量比为1：4.6：2.3：0.8：1.5。

本实施例提供了一种等温核酸检测试剂盒，包括：

上述的酶组合物；

扩增缓冲液：dNTPs，ATP，醋酸钠，MOPS缓冲液，磷酸肌酸，肌酸激酶，和聚乙二醇8000；

报告分子：序列为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’，其中F为JOE荧光基团，Q为BHQ3猝灭基团；

反应启动剂：氯化镁溶液。

进一步的，还包括针对待测核酸(序列见SEQ ID NO:7)设计的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)；

进一步的，还包括针对待测核酸(拟南芥基因组DNA)的sgRNA,sgRNA序列如SEQ IDNO:8所示。

利用上述等温核酸检测试剂盒可以配制等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为500nM；sgRNA：浓度为200nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：4.6：2.3：0.8：1.5；其中，重组酶500ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为300μM、ATP为1mM、醋酸钠为100mM、MOPS缓冲液为60mM、磷酸肌酸为50mM，肌酸激酶100ng/μL，聚乙二醇8000 5％w/v；

所述报告分子浓度为500nM；

所述反应启动剂浓度为10mM。

实施例12一种等温核酸检测方法

本实施例与实施例6的区别在于，采用实施例11的试剂盒进行等温核酸检测，反应体系在42℃下在天隆荧光定量PCR仪器(Gentier 96E)中反应20min，检测通道为JOE荧光检测通道。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

<110> 北京盛因生物科技有限公司

<120> 一种重等温核酸检测方法及试剂盒

<130> HA202105576

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctgatt taaaatctcg tctgattaaa gcttctactt ctaaaatgac tgcagacttg 60

actaagtcta agctgtttaa taatcgcgat gaagtcccta ctcgtattcc gatgttgaat 120

attgcattag gtggtgcact gaatgcaggg ttgcaatcag gcttaactat ttttgctgct 180

ccttctaaac actttaaaac gttgtttgga ctaactatgg ttgcagcgta tatgaagaaa 240

tataaagatg caatctgttt gttttatgac tcagaattcg gtgcttcaga atcttatttt 300

cgttcaatgg gtgttgattt agaccgtgta gttcatactc cgattcaatc tgtcgaacaa 360

cttaaagttg atatgactaa tcagcttgac gctattgaac gcggtgataa agttattatc 420

tttattgact cgattggtaa tactgcgtct aagaaagaaa ctgaagatgc attgaacgag 480

aaagttgtag gtgatatgtc tcgtgctaag gcacttaaat ctctgttccg cattgtgact 540

ccttatctga ctattaaaga tattccatgt gttgcaatca accatacagc aatggaaatt 600

ggcggattgt atcctaaaga gattatgggt ggtggtacag gtattcttta ttctgccaac 660

acggtatttt ttatctctaa acgtcaggtt aaagaaggta cagaattgac cggttatgac 720

ttcacgttga aagcagaaaa atctcgcacc gttaaagaaa aatctacttt cccaatcacg 780

gttaattttg atggtggtat cgacccattc agtggcttgt tagaaatggc aactgaaatc 840

ggttttgtgg ttaagcctaa agccgggtgg tatgctcgtg aattccttga cgaagaaaca 900

ggtgaaatga ttcgtgaaga gaaatcgtgg cgtgctaaag ctactgattg tgtagaattc 960

tggggaccgt tgtttaaaca caaacctttc cgagatgcaa ttgaaactaa atataaacta 1020

ggtgctatct cttctattaa agaagttgat gacgctgtta acgaccttat taattgcaaa 1080

gcaacaacta aagttccggt taaaacttct gatgctccgt ctgcagcaga tatagaaaac 1140

gaccttgacg aaatggaaga tttcgatgaa taa 1173

<210> 2

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcttcaag gcaacctatg tataatggtt ttaggtcctt ccgatacagc cgggagatta 60

ttagttaaaa gagagaatat tatgaagctg gaagatttac aggaagagtt agacgcagac 120

ttagctattg atacgacaaa gttgcaatat gagacggcga ataatgttaa gttatacagc 180

aaatggctac gtaagcactc atttattcgt aaagaaatgt tgcgtataga gactcagaag 240

aaaactgctc taaaagcaag attagactac tactcgggac gaggtgatgg tgatgaattc 300

agtatggacc gatacgagaa atctgaaatg aaaactgtcc tggccgcaga taaagatgtg 360

cttaaaatag agactacttt acaatactgg ggaattttac ttgagttctg tagtggtgca 420

cttgatgcgg ttaagtctcg tagttttgca cttaaacata ttcaagatat gcgagaattt 480

gaagcggggc aataa 495

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtttaaac gtaaaagtac cgcagacctc gcagctcaga tggctaaact gaatggtaac 60

aaaggtttct cttcagaaga taaaggtgaa tggaagctga aactcgatgc atccggtaat 120

ggtcaagcgg taattcgttt cctgccggca aaaacagatg acgcacttcc gtttgcaatt 180

cttgttaacc acgggttcaa gaaaaatggc aaatggtata ttgaaacctg ttcatctaca 240

cacggcgatt atgactcttg tcctgtatgt cagtacatta gtaaaaatga cctgtacaat 300

accaacaaaa ctgaatattc tcaactgaaa cgtaaaactt cttattgggc taatattctg 360

gttgttaaag acccacaagc tccagataat gaaggtaagg tattcaaata ccgttttggt 420

aaaaagattt gggacaaaat caatgcaatg attgcagttg atactgaaat gggtgaaact 480

cctgttgatg taacttgtcc atgggaaggt gctaactttg tgctgaaagt taaacaggtt 540

tctggtttca gtaactatga cgaatctaaa ttcctgaatc aatctgcgat tccaaacatt 600

gatgatgaat ctttccagaa agaattgttc gaacaaatgg ttgacctttc tgaaatgact 660

tctaaagata agttcaaatc gtttgaagaa ttgaatacta aatttaatca agttcttggt 720

actgccgctc tgggtggtgc agcagccgca gcagcttctg ttgcagataa agttgcttct 780

gacctcgacg attttgataa agacatggaa gcctttagtt ctgcaaaaac tgaagatgac 840

ttcatgagtt cctcgtcttc tgacgatggc gacctcgatg acctgttagc tggtctataa 900

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaagtac aaaaaactgt gatgaagaca ctttctttga gaatattaag acctctgtac 60

tcacaagaaa tagaaaaaga gattaaagaa gaaaaagaaa gaagaaaaca agccggagga 120

actggagagc ttgacggggg attttataaa aagcttgaga agaagcattc agagatgttc 180

agctttgata ggttaaactt attgttgaat caattacaaa gagaaattgc taaggtctac 240

aatcatgcca tcagtgaatt gtatatagcg actatcgctc aaggtaacaa gagcaacaaa 300

cattatatta gtagtattgt ctataatcga gcatatggat acttttataa cgcttacata 360

gccttaggga tatgttcaaa agttgaagca aattttagat ccaatgaact cctaacacaa 420

caaagcgcat tgcctacagc aaagtcagat aattttccaa tagttttaca taaacaaaaa 480

ggtgctgagg gagaggatgg aggatttagg atatctactg aggggagcga tctgatattt 540

gagataccca ttccgttcta tgaatataat ggggagaacc gaaaagaacc ctataaatgg 600

gttaaaaaag gaggacaaaa acctgtgtta aaacttatac tttctacttt taggagacaa 660

agaaataagg ggtgggcaaa agacgagggc acggatgcgg aaataagaaa ggttacagaa 720

gggaagtatc aagtcagcca aatagaaata aataggggta aaaaactagg agaacatcaa 780

aaatggtttg ccaatttcag catagagcaa ccaatttatg aaagaaaacc taatcggagt 840

attgtcggcg gattagacgt gggaataaga tcccccctag tatgtgcaat taacaactca 900

ttttcgagat attctgttga ttccaatgat gtatttaagt tttctaaaca agtattcgca 960

tttagaagac ggctattatc gaaaaactct ttgaaaagga aaggtcatgg ggcggctcat 1020

aagttagaac ctatcacgga aatgacagaa aaaaatgaca agtttagaaa gaaaataatt 1080

gagagatggg ccaaggaagt tacaaatttc tttgttaaaa accaagtagg aattgttcag 1140

atagaagatt tatcaacgat gaaagacaga gaggatcatt tttttaatca atatcttaga 1200

ggattttggc cttattacca aatgcagaca ttaattgaga acaagctcaa agagtatggg 1260

attgaggtaa aaagggtaca ggcaaaatat acgtctcagt tgtgctcaaa ccctaattgc 1320

aggtattgga ataactattt taactttgaa taccgaaaag taaataaatt cccaaaattt 1380

aaatgtgaaa agtgtaactt agaaataagt gctgactata acgctgctcg caatctatca 1440

actcccgata tagagaaatt tgtggcaaaa gctacaaaag gcattaattt gccagaaaaa 1500

tga 1503

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacataatcg gagaaataca gattacagag 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttacagcgc aagttccaag gatcgtagct ac 32

<210> 7

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacataatcg gagaaataca gattacagag agcgagagag atcgacggcg aagctcttta 60

cccggaaacc attgaaatcg gacggtttag tgaaaatgga ggatcaagtt gggtttgggt 120

tccgtccgaa cgacgaggag ctcgttggtc actatctccg taacaaaatc gaaggaaaca 180

ctagccgcga cgttgaagta gccatcagcg aggtcaacat ctgtagctac gatccttgga 240

acttgcgctg taag 254

<210> 8

<211> 180

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucacugaua aaguggagaa ccgcuucacc aaaagcuguc ccuuagggga uuagaacuug 60

agugaaggug ggcugcuugc aucagccuaa ugucgagaag ugcuuucuuc ggaaaguaac 120

ccucgaaaca aauucauuug aaagaaugaa ggaaugcaac ucgccgucga ucucucucgc 180

<210> 9

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Ser Asp Leu Lys Ser Arg Leu Ile Lys Ala Ser Thr Ser Lys Met

1 5 10 15

Thr Ala Asp Leu Thr Lys Ser Lys Leu Phe Asn Asn Arg Asp Glu Val

20 25 30

Pro Thr Arg Ile Pro Met Leu Asn Ile Ala Leu Gly Gly Ala Leu Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Gln Ser Gly Leu Thr Ile Phe Ala Ala Pro Ser Lys His

50 55 60

Phe Lys Thr Leu Phe Gly Leu Thr Met Val Ala Ala Tyr Met Lys Lys

65 70 75 80

Tyr Lys Asp Ala Ile Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Phe Gly Ala Ser

85 90 95

Glu Ser Tyr Phe Arg Ser Met Gly Val Asp Leu Asp Arg Val Val His

100 105 110

Thr Pro Ile Gln Ser Val Glu Gln Leu Lys Val Asp Met Thr Asn Gln

115 120 125

Leu Asp Ala Ile Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Ile Phe Ile Asp Ser

130 135 140

Ile Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Thr Glu Asp Ala Leu Asn Glu

145 150 155 160

Lys Val Val Gly Asp Met Ser Arg Ala Lys Ala Leu Lys Ser Leu Phe

165 170 175

Arg Ile Val Thr Pro Tyr Leu Thr Ile Lys Asp Ile Pro Cys Val Ala

180 185 190

Ile Asn His Thr Ala Met Glu Ile Gly Gly Leu Tyr Pro Lys Glu Ile

195 200 205

Met Gly Gly Gly Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Ala Asn Thr Val Phe Phe

210 215 220

Ile Ser Lys Arg Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Leu Thr Gly Tyr Asp

225 230 235 240

Phe Thr Leu Lys Ala Glu Lys Ser Arg Thr Val Lys Glu Lys Ser Thr

245 250 255

Phe Pro Ile Thr Val Asn Phe Asp Gly Gly Ile Asp Pro Phe Ser Gly

260 265 270

Leu Leu Glu Met Ala Thr Glu Ile Gly Phe Val Val Lys Pro Lys Ala

275 280 285

Gly Trp Tyr Ala Arg Glu Phe Leu Asp Glu Glu Thr Gly Glu Met Ile

290 295 300

Arg Glu Glu Lys Ser Trp Arg Ala Lys Ala Thr Asp Cys Val Glu Phe

305 310 315 320

Trp Gly Pro Leu Phe Lys His Lys Pro Phe Arg Asp Ala Ile Glu Thr

325 330 335

Lys Tyr Lys Leu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Lys Glu Val Asp Asp Ala

340 345 350

Val Asn Asp Leu Ile Asn Cys Lys Ala Thr Thr Lys Val Pro Val Lys

355 360 365

Thr Ser Asp Ala Pro Ser Ala Ala Asp Ile Glu Asn Asp Leu Asp Glu

370 375 380

Met Glu Asp Phe Asp Glu

385 390

<210> 10

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Leu Gln Gly Asn Leu Cys Ile Met Val Leu Gly Pro Ser Asp Thr

1 5 10 15

Ala Gly Arg Leu Leu Val Lys Arg Glu Asn Ile Met Lys Leu Glu Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Glu Leu Asp Ala Asp Leu Ala Ile Asp Thr Thr Lys Leu

35 40 45

Gln Tyr Glu Thr Ala Asn Asn Val Lys Leu Tyr Ser Lys Trp Leu Arg

50 55 60

Lys His Ser Phe Ile Arg Lys Glu Met Leu Arg Ile Glu Thr Gln Lys

65 70 75 80

Lys Thr Ala Leu Lys Ala Arg Leu Asp Tyr Tyr Ser Gly Arg Gly Asp

85 90 95

Gly Asp Glu Phe Ser Met Asp Arg Tyr Glu Lys Ser Glu Met Lys Thr

100 105 110

Val Leu Ala Ala Asp Lys Asp Val Leu Lys Ile Glu Thr Thr Leu Gln

115 120 125

Tyr Trp Gly Ile Leu Leu Glu Phe Cys Ser Gly Ala Leu Asp Ala Val

130 135 140

Lys Ser Arg Ser Phe Ala Leu Lys His Ile Gln Asp Met Arg Glu Phe

145 150 155 160

Glu Ala Gly Gln

<210> 11

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Asp Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu

35 40 45

Pro Ala Lys Thr Asp Asp Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His

50 55 60

Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Asn Thr Asn Lys Thr Glu Tyr Ser Gln Leu Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Ser Tyr Trp Ala Asn Ile Leu Val Val Lys Asp Pro Gln Ala Pro

115 120 125

Asp Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe Gly Lys Lys Ile Trp

130 135 140

Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Thr Glu Met Gly Glu Thr

145 150 155 160

Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala Asn Phe Val Leu Lys

165 170 175

Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Ser Lys Phe Leu

180 185 190

Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu Ser Phe Gln Lys Glu

195 200 205

Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met Thr Ser Lys Asp Lys

210 215 220

Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly

225 230 235 240

Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala Asp

245 250 255

Lys Val Ala Ser Asp Leu Asp Asp Phe Asp Lys Asp Met Glu Ala Phe

260 265 270

Ser Ser Ala Lys Thr Glu Asp Asp Phe Met Ser Ser Ser Ser Ser Asp

275 280 285

Asp Gly Asp Leu Asp Asp Leu Leu Ala Gly Leu

290 295

<210> 12

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Glu Val Gln Lys Thr Val Met Lys Thr Leu Ser Leu Arg Ile Leu

1 5 10 15

Arg Pro Leu Tyr Ser Gln Glu Ile Glu Lys Glu Ile Lys Glu Glu Lys

20 25 30

Glu Arg Arg Lys Gln Ala Gly Gly Thr Gly Glu Leu Asp Gly Gly Phe

35 40 45

Tyr Lys Lys Leu Glu Lys Lys His Ser Glu Met Phe Ser Phe Asp Arg

50 55 60

Leu Asn Leu Leu Leu Asn Gln Leu Gln Arg Glu Ile Ala Lys Val Tyr

65 70 75 80

Asn His Ala Ile Ser Glu Leu Tyr Ile Ala Thr Ile Ala Gln Gly Asn

85 90 95

Lys Ser Asn Lys His Tyr Ile Ser Ser Ile Val Tyr Asn Arg Ala Tyr

100 105 110

Gly Tyr Phe Tyr Asn Ala Tyr Ile Ala Leu Gly Ile Cys Ser Lys Val

115 120 125

Glu Ala Asn Phe Arg Ser Asn Glu Leu Leu Thr Gln Gln Ser Ala Leu

130 135 140

Pro Thr Ala Lys Ser Asp Asn Phe Pro Ile Val Leu His Lys Gln Lys

145 150 155 160

Gly Ala Glu Gly Glu Asp Gly Gly Phe Arg Ile Ser Thr Glu Gly Ser

165 170 175

Asp Leu Ile Phe Glu Ile Pro Ile Pro Phe Tyr Glu Tyr Asn Gly Glu

180 185 190

Asn Arg Lys Glu Pro Tyr Lys Trp Val Lys Lys Gly Gly Gln Lys Pro

195 200 205

Val Leu Lys Leu Ile Leu Ser Thr Phe Arg Arg Gln Arg Asn Lys Gly

210 215 220

Trp Ala Lys Asp Glu Gly Thr Asp Ala Glu Ile Arg Lys Val Thr Glu

225 230 235 240

Gly Lys Tyr Gln Val Ser Gln Ile Glu Ile Asn Arg Gly Lys Lys Leu

245 250 255

Gly Glu His Gln Lys Trp Phe Ala Asn Phe Ser Ile Glu Gln Pro Ile

260 265 270

Tyr Glu Arg Lys Pro Asn Arg Ser Ile Val Gly Gly Leu Asp Val Gly

275 280 285

Ile Arg Ser Pro Leu Val Cys Ala Ile Asn Asn Ser Phe Ser Arg Tyr

290 295 300

Ser Val Asp Ser Asn Asp Val Phe Lys Phe Ser Lys Gln Val Phe Ala

305 310 315 320

Phe Arg Arg Arg Leu Leu Ser Lys Asn Ser Leu Lys Arg Lys Gly His

325 330 335

Gly Ala Ala His Lys Leu Glu Pro Ile Thr Glu Met Thr Glu Lys Asn

340 345 350

Asp Lys Phe Arg Lys Lys Ile Ile Glu Arg Trp Ala Lys Glu Val Thr

355 360 365

Asn Phe Phe Val Lys Asn Gln Val Gly Ile Val Gln Ile Glu Asp Leu

370 375 380

Ser Thr Met Lys Asp Arg Glu Asp His Phe Phe Asn Gln Tyr Leu Arg

385 390 395 400

Gly Phe Trp Pro Tyr Tyr Gln Met Gln Thr Leu Ile Glu Asn Lys Leu

405 410 415

Lys Glu Tyr Gly Ile Glu Val Lys Arg Val Gln Ala Lys Tyr Thr Ser

420 425 430

Gln Leu Cys Ser Asn Pro Asn Cys Arg Tyr Trp Asn Asn Tyr Phe Asn

435 440 445

Phe Glu Tyr Arg Lys Val Asn Lys Phe Pro Lys Phe Lys Cys Glu Lys

450 455 460

Cys Asn Leu Glu Ile Ser Ala Asp Tyr Asn Ala Ala Arg Asn Leu Ser

465 470 475 480

Thr Pro Asp Ile Glu Lys Phe Val Ala Lys Ala Thr Lys Gly Ile Asn

485 490 495

Leu Pro Glu Lys

500

Claims (10)

1.一种等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白。

2.根据权利要求1所述的等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述的重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX、T6 UvsX或Rb69 UvsX；或

所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4 GP32、T6 GP32或Rb69GP32；或

所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或

所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY、T6 UvsY或Rb69 UvsY。

3.根据权利要求1或2所述的等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述UvsX蛋白为如下A1)-A2)中任意一种：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

A2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述UvsY蛋白为如下B1)-B2)中任意一种：

B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

B2)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

单链结合蛋白GP32为如下C1)-C2)中任意一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

C2)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

和/或，

所述Cas14a蛋白为如下D1)-D2)中任意一种：

D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

D2)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白。

4.根据权利要求1-3任一项所述的等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物中，重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-0.8)：(0.1-1.5)；

可选的，所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。

5.一种等温核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的等温核酸检测的酶组合物；

可选的，还包括扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂中的至少一种；

可选的，所述等温核酸检测试剂盒中，分为独立包装的三部分，第一部分为包括酶组合物、扩增缓冲液和报告分子的冻干粉，第二部分为反应缓冲液，第三部分为反应启动剂；所述反应缓冲液中含有缓冲液、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述扩增缓冲液中含有dNTPs、ATP、缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、dNTPs、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；

可选的，所述缓冲液包括Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPS缓冲液；

可选的，所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠；

可选的，所述拥挤试剂包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或聚蔗糖；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量范围为8000-35000的聚乙二醇；

可选的，所述拥挤试剂为平均分子量为35000的聚乙二醇。

6.根据权利要求5所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，

所述报告分子为单链DNA，所述单链DNA的一端修饰荧光基团，另一端修饰猝灭基团；

可选的，所述单链DNA5’修饰荧光基团F，3’修饰猝灭基团Q；

可选的，所述报告分子为：5’-F-TTTTTTTTTTTT-Q-3’；

可选的，所述荧光基团F为FAM、HEX、TET、JOE或VIC，猝灭基团Q为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

7.根据权利要求5或6所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应启动剂为含Mg²⁺的溶液；

可选的，所述反应启动剂为醋酸镁溶液或氯化镁溶液；

可选的，还包括：针对待测核酸设计的正向引物和反向引物；和/或

针对待测核酸的sgRNA；

可选的，待测核酸为DNA或RNA；可选的，所述DNA为双链DNA或单链DNA；

可选的，待测核酸为RNA时，所述酶组合物中还包括逆转录酶；可选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。

8.根据权利要求5-7任一项所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，利用所述的等温核酸检测试剂盒配制的等温核酸检测反应体系，按50μL反应体系计，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为300-500nM；sgRNA：浓度为50-200nM；

所述酶组合物：重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)：(0.2-0.8)：(0.1-1.5)；其中，重组酶200-500ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为150-300μM、ATP为1-5mM、醋酸钾为60-100mM、Tris缓冲液为30-100mM、磷酸肌酸为50-100mM，肌酸激酶50-100ng/μL，聚乙二醇35000 5-8％w/v；

所述报告分子浓度为100-500nM；

所述反应启动剂浓度为10mM-30mM；

可选的，包括如下终浓度的组分：

引物：正向引物和反向引物的浓度各为420nM；sgRNA：浓度为100nM；

所述酶组合物：重组酶260ng/μL，重组酶辅助蛋白98ng/μL，单链DNA结合酶280ng/μL，链置换DNA聚合酶88ng/μL，Cas14a蛋白100ng/μL；

所述扩增缓冲液：dNTPs中每种碱基的浓度均为240μM、ATP为5mM、醋酸钾为100mM、Tris缓冲液为100mM、磷酸肌酸为60mM，肌酸激酶80ng/μL，聚乙二醇35000 7.72％w/v；

所述报告分子浓度为250nM；

所述反应启动剂浓度为25mM。

9.一种如权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒在核酸检测中的用途；

可选的，在检测核酸突变中的用途；

可选的，所述核酸突变包括单个碱基突变和＞1个碱基突变；

可选的，在检测单核苷酸多态性中的用途。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的等温核酸检测的酶组合物或权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒的等温核酸检测方法，其特征在于，包括：

取待测核酸，然后利用权利要求1-4任一项所述的等温核酸检测的酶组合物或权利要求5-8任一项所述的等温核酸检测试剂盒配制等温核酸检测反应体系，随后恒温反应，并进行检测；

可选的，所述恒温反应的条件为：温度35-42℃，时间为20-60min；

可选的，所述检测中，为实时荧光定量检测。

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