CN109072202B

CN109072202B - 海洋dna聚合物

Info

Publication number: CN109072202B
Application number: CN201780019082.6A
Authority: CN
Inventors: A·N·拉森; Y·皮奥超斯基; N·G·阿塞法; O·拉纳
Original assignee: Universitetet I Tromso UIT
Current assignee: Universitetet I Tromso UIT
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2037-03-22
Also published as: WO2017162765A1; LT3433357T; BR112018068890A2; ZA201806872B; US10787653B2; KR102377213B1; ES2917190T3; PL3433357T3; JP6986286B2; CN109072202A; SG11201807651TA; EP3433357A1; KR20180132711A; US20190106686A1; JP2019509766A; GB201604876D0; EP3433357B1; CA3018433A1

Abstract

本发明涉及DNA聚合酶。特别地，本发明涉及基于嗜冷芽孢杆菌来源DNA聚合酶的DNA聚合酶。本发明提供分离的DNA聚合酶或其酶活性片段，所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。本发明还提供了包含编码DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子。本发明还提供了核苷酸聚合方法和扩增核酸的方法，其中使用DNA聚合酶或其酶活性片段。

Description

海洋DNA聚合物

技术领域

本发明涉及DNA聚合酶。特别地，本发明涉及基于一种嗜冷芽孢杆菌(Psychrobacillus sp.)来源DNA聚合酶的DNA聚合酶类。

背景技术

微生物鉴定的金标准仍然是培养和随后的致病因子的表型分化，这一过程通常需要花费数天进行和分析，并且这种延迟可能对传染病的发病率和死亡率具有重大影响。此外，许多微生物不能在培养基上生长，因此，现有的培养方法将无法检测到这些微生物。聚合酶链式反应(PCR)在许多方面彻底改变了分子遗传学和诊断领域。PCR技术中的主力是热稳定的高保真的DNA聚合酶，其与加热和冷却的循环事件一起获得链解离，引物退火和延伸，导致靶DNA序列的扩增。PCR技术现已广泛应用于生物医学和生命科学研究以及分子诊断领域。

即时(POC)诊断被描述为在医院环境之外患者的社区中实现疾病诊断的医疗工具或设备。理想的诊断测试应符合“ASSURED”标准：经济实惠(Affordable)，高敏感性(Sensitive)，高特异性(Specific)，用户友好(User-friendly)，快速稳定(Rapid andRobust)，无需仪器(Equipment-free)且易于储运(Delievered)。虽然PCR技术具有很高的潜力，但它仍然具有局限性，并且需要使用高精度电动热循环设备来重复加热和冷却过程以及操作设备的技术人员。由退火过程中的假性引发(spurious priming)引起的非特异性扩增是有问题的，并且PCR在“粗”样品中也倾向于抑制性化合物。此外，PCR设备庞大的设计导致PCR并入POC技术平台是一个不完美解决方案，并使基于PCR的方法难以用作POC诊断的主要技术驱动因素。

最近，人们越来越关注基于非PCR的方法或等温扩增方法。在这些方法中，核酸扩增在恒定(中等)温度下进行，并且不需要高精度温度循环和控制，或在高温下稳定的酶。据报道，等温扩增方法具有与PCR相当的分析灵敏度和特异性，以及对抑制性化合物更高的耐受性，同时允许更短的时间获取结果和更容易使用。这些特征使等温扩增方法非常适合那些开发POC分子诊断平台并且旨在满足“ASSURED”标准的人。在过去十年中已发表了许多方法用于核酸(RNA和DNA)的等温扩增(Gill,P.和A.Ghaemi(2008)Nucleosides NucleotidesNucleic Acids 27(3):224-243；Craw,P.和W.Balachandran(2012)Lab Chip 12(14):2469-2486；de Paz,H.D.等，(2014)Expert Rev Mol Diagn 14(7):827-843；Yan,L.等，(2014)Mol Biosyst 10(5):970-1003)。在一些方法中，成功依赖于反应设置中所用的DNA聚合酶固有的链置换活性。术语链置换描述了合成期间聚合酶置换遇到的下游DNA的能力。

除了诊断之外，其他感兴趣的领域也受益于DNA聚合酶赋予的等温扩增技术。在这方面，全基因组扩增(多重置换扩增)对于基因组研究是重要的，尤其是当存在有限量的DNA和/或在单细胞处理时。同样在下一代测序方法中，无论是商业上可获得的还是在概念验证阶段，链置换聚合酶都是重要的，例如Pacific Biosciences Single Molecule Real Time(SMRT)DNA测序技术和用于下一代测序的等温扩增方法，由Ma等人于2013年发表(Ma,Z.等，Proc Natl Acad Sci U S A 110(35):14320-14323)。

然而，目前用于各种等温技术的聚合酶的选择非常有限。通常，不同的等温方法需要30-65℃的反应温度，这主要取决于反应中使用的聚合酶的工作范围。

例如，大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶仅在相对窄的温度范围内显示出有用的聚合酶活性水平，并且在低至中等温度(例如25℃)下具有相对低的活性。本领域需要在宽的温度范围内表现出有用的聚合酶活性水平和良好的稳定性的DNA聚合酶，特别是在低至中等温度下，但更好也在较高温度下。这种聚合酶可用于在宽温度范围内进行的等温扩增反应，包括室温或接近室温的温度。发明人已鉴定出来自一种来自嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶，其令人惊讶地符合这些标准。嗜冷芽孢杆菌是冷适应的，其DNA聚合酶I在低温下有活性。然而，与其他海洋DNA聚合酶类不同，嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I在20-25℃以上不会快速失活，因此表现为一种在宽温度范围内非常有用的DNA聚合酶。此外，嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I通常比其他海洋聚合酶类更活跃。

发明内容

因此，在第一方面，本发明提供了分离的DNA聚合酶或其酶活性片段，该DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1的DNA聚合酶基于来自一种在挪威北部分离的海洋细菌嗜冷芽孢杆菌(在本文中也称为PB或Pb或PbI)的DNA聚合酶I的氨基酸序列。然而，SEQ ID NO:1缺少嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I序列中存在的5'-3'-外切核酸酶结构域。在优选的实施方案中，5'-3'-外切核酸酶结构域不存在于DNA聚合酶中，因为5'-3'-外切核酸酶可降解扩增混合物中的引物和/或产物，其活性通常是不需要的。

在一些实施方案中，本发明提供了分离的DNA聚合酶或其酶活性片段，所述DNA聚合酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或由与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列组成。

在优选的实施方案中，本发明的DNA聚合酶包含(或由其组成)至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、优选至少80％、85％、90％或95％，例如至少98％或99％或99.5％与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，本发明的DNA聚合酶包含(或由其组成)具有单个或多个氨基酸改变(添加、取代、插入或缺失)的氨基酸序列。这些序列优选含有至多5个(例如，仅1个、2个、3个、4个或5个)，优选1个、2个或3个，更优选1个或2个的改变的氨基酸。可用保守的或非保守的氨基酸取代。优选地，所述改变是保守氨基酸取代。

优选地，本发明的DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，DNA聚合酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，DNA聚合酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列(或由其组成)。本发明还提供了SEQ ID NO:3的变体和片段。本文所述的SEQ ID NO:1的变体和片段的类型经必要的变更后适用于SEQ ID NO:3的变体和片段。

还提供了本发明的DNA聚合酶的酶活性片段。酶活性片段是具有DNA聚合酶活性的片段。酶活性片段的长度可以是至少400、至少450、至少475、至少500、至少525、至少550、至少560、至少570或至少575个氨基酸。优选的片段长度为至少525、至少550、至少560、至少570或至少575个氨基酸。片段与SEQ ID NO:1的相应部分至少70％，优选至少80％、至少85％或至少90％，更优选至少95％(例如至少98％或99％或99.5％)或100％相同。

对于任何给定的DNA聚合酶，通常存在观察到最大聚合酶活性的温度。对于许多DNA聚合酶，当温度从观察到最大活性的温度偏离(例如降低或增加)时，即使仅有适度的温度偏离时，聚合酶活性通常显著降低，这意味着许多聚合酶仅适合用于相当窄的温度范围内进行的应用。

本发明人已经发现，有利地是，在广泛的温度范围内，包括在低温到适度的温度下，嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I相对于在观察到最大聚合酶活性的温度下的DNA聚合酶活性表现出充分的DNA聚合酶活性。即，本发明人发现，与许多DNA聚合酶不同，该嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I在与观察到最大活性的温度显著不同的温度下显示出其最大聚合酶活性的有用部分。

因此，在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶在宽范围的温度下显示出其最大聚合酶活性的显著比例。

在优选的实施方案中，DNA聚合酶显示其最大活性的温度为约37℃至42℃，优选37℃-40℃(例如37、38、39或40℃)。

本发明的一些DNA聚合酶在0℃至35℃的温度范围内显示出其最大聚合酶活性的显著比例。

本发明的一些DNA聚合酶在0℃至35℃的温度范围内显示出其最大聚合酶活性的至少30％。

本发明的一些DNA聚合酶在10℃至35℃的温度范围内显示出其最大聚合酶活性的至少40％。

本发明的一些DNA聚合酶在15℃至35℃的温度范围内显示出其最大聚合酶活性的至少50％。

本发明的一些DNA聚合酶在20℃至35℃的温度范围内显示出其最大聚合酶活性的至少60％。

本发明的一些DNA聚合酶在30℃至35℃的温度范围内表现出至少70％(优选至少80％或至少90％)的最大聚合酶活性。

在一些实施方案中，在与聚合酶表现出最大活性的温度偏离(增加或减少)至多约10℃(例如，1、2、3、4、5、6、7、9或10℃)的温度下，本发明的DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少约30％。

在一些实施方案中，在与聚合酶表现出最大活性的温度偏离(增加或减少)至多约5℃(例如，1、2、3、4、5℃)的温度下，本发明的DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少约60％。

在一些实施方案中，在低于聚合酶表现出最大活性的温度达约35℃至40℃的温度下(例如，低于40℃、30℃、20℃、10℃、或5℃)，本发明的DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少约30％。

在一些实施方案中，在低于聚合酶表现出最大活性的温度达约12℃至约15℃的温度下(例如，低于1、2、3、4、5、10、12或15℃)，本发明的DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少约60％。

在一些实施方案中，在低于聚合酶表现出最大活性的温度达约5℃至约10℃的温度下(例如，低于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃)，本发明的DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少约70％(优选其最大聚合酶活性的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％)。

适合用于分析DNA聚合酶活性的测定法是本领域已知的。因此，这种测定可用于确定相对于在聚合酶显示其最大活性的温度下表现出的DNA聚合酶活性在任何给定温度下的DNA聚合酶活性。可以使用单核苷酸掺入测定法来评估上述DNA聚合酶活性。在示例性的单核苷酸掺入测定中，由在其5'末端用荧光团标记的19个核苷酸组成的引物与由40个核苷酸组成的模板DNA链退火；在反应中，设置唯一存在的dNTP是dATP，因此在5'-3'方向上聚合酶可在第20位延伸引物仅一个核苷酸(因为在模板链上的相应(互补)位置处存在一个T)；随后对变性聚丙烯酰胺凝胶(例如12％聚丙烯酰胺/7M尿素)进行分析并扫描荧光团标记的寡核苷酸，显示引物由19个寡核苷酸组成，且引物由核苷酸腺嘌呤延伸后因而由20个寡核苷酸组成；酶活性(即聚合酶活性)通过表示延伸引物(强度1)和未延伸引物(强度0)条带的密度测定来测定；相对掺入率计算如下：掺入[％]＝强度1/(强度0+强度1)*100。

因此，可以在具有以下步骤的测定中评估DNA聚合酶活性：(i)提供由19个核苷酸组成的引物，其在5'末端用荧光团标记，(ii)将所述引物与40个核苷酸组成的模板DNA链退火形成引物-模板复合物，(iii)在相关温度(即研究中的温度)下，在引物3'末端的第20位掺入引物的唯一dNTP存在时，将所述退火的引物-模板复合物与DNA聚合酶一起温育(所述dNTP与退火的模板DNA链上的相关核苷酸互补)且(iv)测定与未延伸引物(19个核苷酸)相比的延伸引物(20个核苷酸)的量，其中延伸引物相对于未延伸引物的量对应于聚合酶活性的水平(即延伸引物的量越高表示聚合酶活性越高)。

优选的引物和模板链如实施例中所描述。

特别优选的单核苷酸掺入测定在本文的实施例部分中描述。因此，在优选的实施方案中，相对DNA聚合酶活性由根据实施例部分所描述的单核苷酸掺入测定法评估。

本发明人还令人惊讶地发现，在广泛的温度范围内，包括在显著高于其正常海洋环境的温度下，与许多其他DNA聚合酶相比，特别是与来自其他海洋生物如沙门氏菌(Salivicrio Salmonicida)的DNA聚合酶相比，这种嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I显示出良好的稳定性(温度稳定性)。在这种情况下，“稳定的”DNA聚合酶意味着DNA聚合酶在暴露于宽温度范围后不会显示出聚合酶活性的显著损失。从另一个角度看，良好的“稳定性”是指DNA聚合酶在暴露于宽温度范围后保留显著的聚合酶活性(即具有显著的残留活性)。

因此，在评估DNA聚合酶活性前，本发明的一些DNA聚合酶在广泛的温度范围内温育(预温育)后保留其最大聚合酶活性的显著比例。在这种情况下，最大聚合酶活性可以是在DNA聚合酶活性测定开始之前在冰上(约0℃)温育(预温育)DNA聚合酶时观察到的聚合酶活性。

优选地，温育(预温育)约15分钟(优选15分钟)。优选地，不考虑温育(预温育)温度温育，评估DNA聚合酶活性之前，在所述温育后(例如约5分钟)，将DNA聚合酶在冰上冷却。

在评估DNA聚合酶活性之前，在0℃至40℃(例如0℃至15℃，0℃至20℃，或0℃至25℃，或0℃至37℃)的温度范围内的任何温度下温育DNA聚合酶后，本发明的一些DNA聚合酶表现出其最大活性的至少40％。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下评估(优选25℃)。

在评估DNA聚合酶活性之前，在0℃至37℃的温度范围(例如，在0℃至15℃，0℃至20℃，或0℃至25℃，0℃至30℃，或0℃至35℃)内的任何温度下温育DNA聚合酶后，本发明的一些DNA聚合酶显示出其最大活性的至少60％(优选至少70％或至少80％)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下评估(优选25℃)。

在评估DNA聚合酶活性之前，在0℃至30℃的温度范围(例如，在0℃至15℃，0℃至20℃，或0℃至25℃)内的任何温度下温育DNA聚合酶后，本发明的一些DNA聚合酶显示出其最大活性的至少70％(优选至少80％，至少90％，至少95％或100％)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下评估(优选25℃)。

在一些实施方案中，在开始DNA聚合酶活性测定(例如单核苷酸延伸反应)之前，本发明的DNA聚合酶于37℃温育15分钟后，显示出在冰上(0℃)进行DNA聚合酶活性测定之前温育15分钟观察到的聚合酶活性的至少60％(优选至少70％，更优选至少80％)，即存在至少60％、至少70％或至少80％的“残留”活性。

在一些实施方案中，在开始DNA聚合酶活性测定(例如单核苷酸延伸反应)之前，本发明的DNA聚合酶于30℃温育15分钟后，显示出在冰上(0℃)进行DNA聚合酶活性测定之前温育15分钟观察到的聚合酶活性的至少70％(优选至少80％，更优选至少80％或至少90％，或100％)，即存在至少70％、至少80％、至少90％或100％的“残留”活性。

适用于分析DNA聚合酶的温度稳定性的实验是本领域已知的，可以使用这些中的任何一种。DNA聚合酶温度稳定性可以通过在进行测定以确定聚合酶活性之前于测试温度下(例如0℃(如在冰上)、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃或45℃)温育DNA聚合酶一段时间(例如，5分钟至25分钟，优选约15分钟)来评估。优选地，DNA聚合酶温度稳定性可以通过在进行测定以确定聚合酶活性之前于测试温度下(例如0℃(如在冰上)、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃或45℃)温育DNA聚合酶15分钟并随后在冰上冷却DNA聚合酶(例如5分钟)来评估。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下(优选25℃)评估。DNA聚合酶活性可优选使用单核苷酸掺入测定来评估，优选如本文其他地方所述的。特别优选地，DNA聚合酶活性根据实施例部分中描述的单核苷酸掺入测定法评估。

本发明的特别优选的DNA聚合酶在宽温度范围内具有良好的稳定性同时也具有良好的活性。

如通过分析DNA聚合酶的解链温度(T_m)所评估的，本发明的一些DNA聚合酶具有宽的pH(pH 6.0至pH 8.5)稳定性特征。本发明的一些DNA聚合酶在6.0至8.5的pH范围内具有约42℃-45℃、优选约43℃-44℃的解链温度。解链温度(T_m)可通过热氟实验(thermofluorexperiments)确定(Ericsson等，Anal.Biochem.，2006,357,289-298)。在实施例部分描述了特别优选的测定。

本发明的一些DNA聚合酶比一些市售的DNA聚合酶具有更高的DNA聚合酶活性(比活)。

本发明的一些DNA聚合酶在约25℃的温度下(优选25℃)具有比一些市售DNA聚合酶更高的DNA聚合酶活性(比活)。

可以使用任何合适的测定法分析DNA聚合酶活性(比活)，并且技术人员能够容易地选择合适的测定。可以使用等温扩增测定评估如本文所讨论的DNA聚合酶活性。可以使用等温分子信标测定来评估如本文所讨论的DNA聚合酶活性。在示例性分子信标测定中，分子信标模板包括通过富含GC的茎区连接的环区；分子信标模板有两个非常接近并因此淬灭的荧光团；当DNA聚合酶(DNA聚合酶I)延伸到与分子信标模板退火的引物后，打开茎，并通过恢复先前猝灭的荧光团的荧光来测量两个荧光团之间距离的增加。

因此，可以在具有以下步骤的测定中评估DNA聚合酶的活性：(i)提供模板DNA分子(分子信标模板)，其包含通过富含GC的茎区连接的环区并且包含两个由于彼此非常接近而淬灭的荧光团，(ii)使引物与所述模板DNA分子退火，(iii)将所述模板-引物复合物与DNA聚合酶温育(例如在约25℃，优选25℃)且(iv)测量先前猝灭的荧光团的荧光恢复，其中所述荧光表示DNA聚合酶活性。

在优选的实施方案中，DNA聚合酶活性如在约25℃(优选25℃)评估。可使用在约25℃(优选25℃)下进行的等温分子信标测定来评估DNA聚合酶活性。

优选的分子信标模板和引物如实施例中所述。

优选的DNA聚合酶活性测定为本文实施例部分中描述的聚合酶活性测定，其是等温分子信标测定。因此，在优选的实施方案中，DNA聚合酶活性如根据实施例部分中描述的聚合酶活性测定法来评估。

本发明的一些DNA聚合酶具有比大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶(在本文中也称为KF)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(在本文中也称为Bst)和/或市售的嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶Bst2.0的变体更高的聚合酶活性(比活)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下(优选25℃)评估。可使用等温分子信标测定(例如在25℃下进行)评估DNA聚合酶活性。更优选地，根据实施例部分描述的聚合酶活性测定来评估DNA聚合酶活性。

与大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶相比，本发明的一些DNA聚合酶具有高出至少50％、至少75％、至少100％或至少150％的聚合酶活性(比活)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃评估(优选25℃)。可使用等温分子信标测定(例如在25℃下进行)评估DNA聚合酶活性。更优选地，根据实施例部分描述的聚合酶活性测定来评估DNA聚合酶活性。

与嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶相比，本发明的一些DNA聚合酶具有高出至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％的聚合酶活性(比活)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃评估(优选25℃)。可使用等温分子信标测定(例如在25℃下进行)评估DNA聚合酶活性。更优选地，根据实施例部分描述的聚合酶活性测定来评估DNA聚合酶活性。

与市售的嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst2.0)的变体相比，本发明的一些DNA聚合酶具有高出至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％的聚合酶活性(比活)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃评估(优选25℃)。可使用等温分子信标测定(例如在25℃下进行)评估DNA聚合酶活性。更优选地，根据实施例部分描述的聚合酶活性测定来评估DNA聚合酶活性。

与其他海洋聚合酶(例如来自沙门氏嗜血杆菌(Aliivibrio Salmonicida)的DNA聚合酶)相比，本发明的一些DNA聚合酶具有更高的DNA聚合酶活性(比活)，特别是在约25℃的温度下(优选25℃)。本发明的一些DNA聚合酶具有比来自沙门氏嗜血杆菌的DNA聚合酶高出至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的聚合酶活性(比活)。优选地，DNA聚合酶活性在约25℃下(优选25℃)评估。可使用等温分子信标测定评估DNA聚合酶活性(例如在25℃下进行)。更优选地，根据实施例部分描述的聚合酶活性测定来评估DNA聚合酶活性。

当根据本文所述的DNA聚合酶活性测定在25℃分析时，优选根据本文实施例部分描述的DNA聚合酶活性测定进行分析时，本发明的一些DNA聚合酶具有至少200,000mRFU/min/μg、至少250,000mRFU/min/μg或至少300,000mRFU/min/μg的DNA聚合酶活性(比活)。

本发明的一些DNA聚合酶具有高的链置换活性。这是一个重要的性质，因为在许多等温扩增方法中，成功依赖于反应设置中使用的DNA聚合酶的固有链置换活性。术语“链置换”描述了合成期间聚合酶置换遇到的下游DNA的能力。

本发明的一些DNA聚合酶在约25℃(优选25℃)的温度下具有比其它市售DNA聚合酶更高的链置换活性。

适合用于评估DNA的链置换活性的测定法聚合酶是本领域已知的，并且技术人员能够容易地选择合适的测定法。在示例性链置换活性测定法中，“冷”引物和在其3'末端用荧光团(例如，TAMRA)标记的报告链与在其5'末端具有猝灭剂(例如，BHQ2)的模板链退火(因此荧光团通过猝灭剂的紧密接近而猝灭)，使得在退火的引物的3'末端和退火的报道链的5'末端之间存在一个核苷酸间隙；在DNA聚合酶的链置换活性后，荧光团标记的寡核苷酸(报道链)从模板链中转移，因而荧光团和猝灭剂不再紧密接近，并且可以测量荧光的增加。

可以在具有以下步骤的测定中评估链置换活性：(i)提供在其5'末端具有猝灭剂(荧光猝灭剂)的模板DNA分子，(ii)将所述模板DNA分子与冷引物(即非荧光寡核苷酸)和报道链(报告寡核苷酸)退火，该报告链的3'末端用荧光团标记，其中在退火的引物的3'末端和退火的报告链的5'末端之间存在一个核苷酸间隙，通过彼此紧密靠近而由猝灭剂猝灭荧光团，(iii)将所述模板-冷引物-报道链复合物与DNA聚合酶(例如，在约25℃，优选25℃)温育，且(iv)测量先前猝灭的荧光团的荧光，其中所述荧光表示链置换活性。

在优选的实施方案中，链置换是在25℃下进行的测定中评估的。

优选的引物、报告链和模板链如实施例中所描述。

在一个优选的实施方案中，链置换活性是根据在实施例部分中描述的链置换活性测定评估的。

本发明的一些DNA聚合酶具有比大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶高出至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％、至少1000％或至少2000％的链置换活性。优选地，链置换活性在约25℃下(优选25℃)评估。可以使用如本文所述的链置换测定法评估链置换活性(例如在25℃下进行)。更优选地，根据在实施例部分中描述的链置换测定评估链置换活性。

本发明的一些DNA聚合酶具有比嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶高出至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500、至少600％或至少700％的链置换活性。优选地，链置换活性在约25℃下(优选25℃)评估。可以使用如本文所述的链置换测定法评估链置换活性(例如在25℃下进行)。更优选地，根据在实施例部分中描述的链置换测定评估链置换活性。

本发明的一些DNA聚合酶具有比商业上可获得嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst2.0)的变体高出至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％或至少400％的链置换活性。优选地，链置换活性在约25℃下(优选25℃)评估。可以使用如本文所述的链置换测定法评估链置换活性(例如在25℃下进行)。更优选地，根据在实施例部分中描述的链置换测定评估链置换活性。

与其他海洋聚合酶(例如来自沙门氏嗜血杆菌(Aliivibrio Salmonicida)的DNA聚合酶)相比，本发明的一些DNA聚合酶具有更高的链置换活性。本发明的一些DNA聚合酶在约25℃的温度下(优选25℃)具有比其它海洋DNA聚合酶更高的链置换活性。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶具有比来自沙门氏嗜血杆菌的DNA聚合酶高出至少50％，至少75％，至少100％，至少150％，至少200％或至少500％的链置换活性。优选地，链置换活性在约25℃下(优选25℃)评估。可以使用如本文所述的链置换测定法评估链置换活性(例如在25℃下进行)。更优选地，根据在实施例部分中描述的链置换测定评估链置换活性。

当在25℃下根据本文所描述的链置换活性测定法分析时，优选根据本文实施例部分的链置换活性测定时，本发明的一些DNA聚合酶具有至少20,000mRFU/min/μg、至少25,000mRFU/min/μg或至少30,000mRFU/min/μg的链置换活性。

本发明优选的DNA聚合酶具有高的持续性。在DNA聚合酶的情况下，“持续性”是DNA聚合酶在解离前在合成(核苷酸掺入)期间保持与DNA模板链结合的能力，因此DNA合成的总效率可随着给定聚合酶的持续性增加而增加。即，持续性代表每个与模板链的结合事件的由DNA聚合酶添加的平均核苷酸数量的量度。如果需要合成更长的DNA片段，具有高持续性的DNA聚合酶可能特别重要。

本发明的一些DNA聚合酶具有比商业嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bstpoll，Bst2.0)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DNA聚合酶(在本文中也称为BSU)更高的持续性。在优选的实施方案中，较高的持续性显著较高。在一些优选的实施方案中，本发明的DNA聚合酶与市售的嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bstpoll，Bst2.0)和/或枯草芽孢杆菌DNA聚合酶(在此也称为BSU)相比，具有高出至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少1000％、至少1500％或至少2000％的持续性。

本发明的一些DNA聚合酶具有比商业嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bstpoll，Bst2.0)高出至少5000％、至少10,000％、至少15,000％、至少20,000％、至少25,000％或至少30,000％的持续性。

本发明的一些DNA聚合酶具有比枯草芽孢杆菌DNA聚合酶(在本文中也称为BSU)高出至少1000％、至少1500％或至少2000％的持续性。

适用于分析持续性的测定法是本领域熟知的。本文在实施例部分中描述了合适和特别优选的持续性测定法。

本发明优选的DNA聚合酶在一系列盐(NaCl)浓度范围内具有有用的聚合酶活性水平。即，本发明的DNA聚合酶在宽范围的盐浓度下显示出在观察到最大聚合酶活性的盐浓度下观察到的DNA聚合酶活性的显著比例。适用于确定DNA聚合酶活性的测定法在本文其他地方描述。用于测定DNA聚合酶活性的优选试验是等温分子信标试验，例如，如本文所描述的，优选如实施例部分中所描述的。

在一些实施方案中，DNA聚合酶显示其最大活性的NaCl浓度为约65mM至100mM(例如70、75、80、85或90mM)。

在一些实施方案中，在约0mM至210mM NaCl的浓度范围内，本发明的DNA聚合酶显示出其最大聚合酶活性的显著比例(例如至少30％)。

在一些实施方案中，在约20mM至150mM NaCl的浓度范围内，本发明的DNA聚合酶显示出其最大聚合酶活性的至少60％。

在一些实施方案中，在约60mM至120mM NaCl的浓度范围内，本发明的DNA聚合酶显示出其最大聚合酶活性的至少80％(优选至少90％或至少95％)。

优选地，当与适当的对照水平相比时，上述能力和性质在可测量或显著水平观察到，优选在统计学上的显著水平观察到。适当的显著性水平在本文其他地方讨论。更优选地，与现有技术的DNA聚合酶观察到的能力相比，一种或多种上述的能力和性质在可测量的更好或更优选地显著更好的水平被观察到。

另一方面，本发明提供分离的DNA聚合酶，其包含(或由其组成)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或包含(或由其组成)与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。其中所述DNA聚合酶缺乏5'-3'外切核酸酶结构域(例如缺少SEQ ID NO:5的部分或全部氨基酸序列)。本发明其他方面的其他特征和性质经必要的修正适用于本发明的这一方面。

又一方面，本发明提供一种分离的DNA聚合酶，其包含(或由其组成)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或包含(或由其组成)与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。其中所述DNA聚合酶不是来自嗜冷芽孢杆菌的野生型DNA聚合酶。本发明其他方面的其他特征和性质经必要的修正适用于本发明的这一方面。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的DNA聚合酶的分子(例如蛋白质)。

如在整个申请中所使用的，术语“一个”在意味着“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所引用的组件或步骤的意义上使用，除非在其后具体说明上限或排除。根据本公开的内容，本领域普通技术人员将知道组合的可操作的限制和参数，任何单一试剂的量也如此。

包含编码如本文定义的本发明的DNA聚合酶或其片段的核苷酸序列的核酸分子，或与其基本上同源的核酸分子，形成了本发明的其他方面。优选的核酸分子是编码SEQ IDNO:1的嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I序列的核酸，或与其基本上同源的序列。优选的核酸分子包含(或由其组成)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者与其基本上同源的序列。任选地，可省略SEQ ID NO:2的最后三个核苷酸。本发明的核酸序列包括具有至少70％或75％，优选至少80％，甚至更优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列或99.5％的与SEQ ID NO:2的序列同一性。因此，本发明的核酸序列包括对SEQ ID NO:2的序列的单碱基或多碱基改变(添加、取代、插入或缺失)。

特别优选的核酸分子包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

另一种优选的核酸分子由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

本发明还涉及包含(或由其组成)本文所述的核酸分子的简并形式的核苷酸序列的核酸分子，例如，包含(或由其组成)SEQ ID NO:2的核酸分子的简并形式。

本发明的核酸分子优选是“分离的”或“纯化的”。可以通过任何适当的方法评估同源性(例如序列同一性)。然而，为了确定序列之间的同源性程度(例如同一性)，进行序列多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson,Higgins,Gibson,NucleicAcids Res.,22:4673-4680,1994)。如果需要，Clustal W算法可与BLOSUM 62评分矩阵一起使用(Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)，空位罚分(gap opening penalty)为10，空位延伸罚分(gap extension penalty)为0.1，从而在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。可用于比对序列的其他方法是Needleman和Wunsch的比对方法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970)，其由Smith和Waterman修改以便在两个序列之间获得最高级匹配(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981)并确定两个序列之间的相同氨基酸的数量。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，包括例如Carillo和Lipton所描述的(Carillo和Lipton,SIAM J.Applied Math.,48:1073,1988)以及在计算分子生物学，Lesk,e.d.牛津大学出版社，纽约，1988年，生物计算：信息学和基因组学项目中所述描述。

通常，使用计算机程序进行这种计算。比较和对齐序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller，CABIOS,4:11-17,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448,1988；Pearson,Methods in Enzymology,183:63-98,1990)和gapped BLAST(Altschul等，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997)、BLASTP、BLASTN、或GCG(Devereux,Haeberli,Smithies,Nucleic Acids Res.,12:387,1984)也可用于此目的。而且，在欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对(Holm,Trendsin Biochemical Sciences,20:478-480,1995；Holm,J.Mol.Biol.,233:123-38,1993；Holm,Nucleic Acid Res.,26:316-9,1998)。

通过提供参考点的方法，根据本发明的具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性、序列同一性等的序列可使用具有默认参数的ALIGN程序来确定(例如，可从法国蒙彼利埃IGH的GENESTREAM网络服务器通过因特网获得)。

如本文所用，“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。

本发明的DNA聚合酶包含遗传编码的氨基酸，但也可含有一种或多种非遗传编码的氨基酸。

除具有DNA聚合酶活性外，本文所述的本发明DNA聚合酶的变体或酶活性片段优选具有本文所述的一种或多种其他性质，更优选地具有本文所述的所有其他性质。

如本文所用，关于核酸分子或序列和蛋白质或多肽(例如DNA聚合酶)所用的术语“分离的”或“纯化的”，是指当从其天然环境中分离、纯化的分子或基本上不含天然环境的分子，例如从微生物中分离或纯化的(如果它们确实天然存在)，或者是指当通过技术方法(即，包括重组和合成)产生分子。

因此，当与蛋白质或多肽分子(例如DNA聚合酶)结合使用时，术语“分离的”或“纯化的”通常是指基本上不含来自其来源的细胞材料或其他蛋白质的蛋白质。在一些实施方案中，此类分离或纯化的蛋白质是当通过重组技术产生时基本上不含培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。

可能的表达载体包括但不限于粘粒或质粒，只要载体与所用的宿主细胞相容即可。表达载体“适合转化宿主细胞”，意味着表达载体含有本发明的核酸分子和基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列，其可操作地连接于核酸分子。可操作地连接意指以允许核酸表达的方式将核酸与调节序列连接。

因此，本发明的一个方面提供了含有本发明的核酸分子或其片段的表达载体(优选重组表达载体)，以及用于本发明的核酸编码的蛋白质序列的转录和翻译的必要调节序列。

合适的调节序列可以衍生自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因，并且是本领域熟知的。合适的调节序列的选择取决于如下讨论选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列(包括翻译起始信号)。另外，取决于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列(例如复制起点)、额外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。

本发明的重组表达载体还可含有选择标记基因，其有助于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。

重组表达载体还可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供重组蛋白的增加的表达；重组蛋白增加的溶解度；并且通过在亲和纯化中作为配体帮助靶重组蛋白的纯化(例如，可以存在适当的“标签”以实现纯化和/或鉴定，例如His标签或myc标签)。

可以将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“用......转化”、“用......转染”、“转化”和“转染”旨在包括通过本领域已知的许多可能技术中的一种将核酸(例如载体)引入细胞中。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等的1989版的教科书(Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989)和其他实验室教科书中找到。

合适的宿主细胞包括多种原核宿主细胞和真核细胞。优选地，本发明的蛋白质可以在细菌宿主细胞中表达，例如大肠杆菌。

N-末端或C-末端融合蛋白，其包含与其他分子如蛋白质(例如表位标签)缀合的本发明的DNA聚合酶和蛋白质，可通过重组技术融合制备。

又一方面提供了包含一种或多种本发明的表达构建体或表达载体的宿主细胞或病毒。还提供了包含一种或多种本发明核酸分子的宿主细胞或病毒。另一个方面为能够表达本发明的DNA聚合酶的宿主细胞或病毒。优选的宿主细胞包括Rosetta 2(DE3)细胞(Novagen)。

适当时，本发明的DNA聚合酶可以从天然来源分离，例如从嗜冷芽孢杆菌的提取物中分离，或在宿主细胞中重组产生并从中分离和纯化。因此，本发明的DNA聚合酶可以是重组酶，特别是分离的重组酶。在某些实施方案中，DNA聚合酶通过重组技术在宿主细胞中产生，所述宿主细胞不是或不来自与天然存在DNA聚合酶的微生物相同的微生物，即异源宿主细胞。

可以使用重组DNA技术产生本发明的DNA聚合酶。或者，无细胞表达系统可用于产生DNA聚合酶。或者，可以使用化学合成通过每次一个氨基酸逐步延伸产生DNA聚合酶产生本发明的DNA聚合酶。这种化学合成技术(例如固相合成)在蛋白质化学领域是众所周知的。

本发明的另一方面提供了产生本发明DNA聚合酶的方法，包括培养本发明宿主细胞的步骤。优选的方法包括以下步骤：(i)在适于表达编码的DNA聚合酶或蛋白质的条件下培养包含一种或多种重组表达载体或一种或多种本发明核酸分子的宿主细胞；任选地(ii)从宿主细胞或生长培养基/上清液中分离或获得DNA聚合酶或蛋白质。此类生产方法还可包括纯化DNA聚合酶或蛋白质产物和/或将DNA聚合酶或产物配制成包含至少一种另外组分(例如可接受的缓冲液或载体)的组合物的步骤。

可以使用本领域已知的和文献中广泛描述的任何蛋白质纯化技术或其任何组合从宿主细胞/培养基中分出或分离DNA聚合酶。这些技术可包括例如沉淀、超滤、透析、各种色谱技术(例如尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱)、电泳，离心等。如上所述，本发明的DNA聚合酶可以被修饰以携带氨基酸基序或其他蛋白质或非蛋白质标签，例如，多组氨酸标签(例如His₆标签)，以帮助分离、增溶和/或纯化或鉴定。

产生本发明DNA聚合酶的优选方法描述于本文的实施例部分。

另一方面，本发明提供了本发明的DNA聚合酶用于核苷酸(例如dNTP)聚合的用途。因此，本发明的DNA聚合酶可用于通过一个或多个核苷酸延伸核酸(DNA)链。

另一方面，本发明提供了本发明的DNA聚合酶在核酸(DNA)扩增或测序反应中的用途。

另一方面，本发明提供了本发明的DNA聚合酶在分子信标测定或链置换测定或单核苷酸掺入测定中的用途(例如，如本文所述的)。

优选地，在本发明的用途和方法中，本发明的DNA聚合酶在恒温下使用，即没有热循环。因此，使用本发明的DNA聚合酶进行等温反应是特别优选的。在等温扩增反应中使用本发明的DNA聚合酶是特别优选的。等温反应在恒温下进行。许多等温扩增技术是本领域已知的，包括环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引发扩增(CPA)。

另一方面，本发明提供了使用本发明的DNA聚合酶进行核苷酸聚合的方法。优选地，所述方法包括提供包含本发明的DNA聚合酶的反应混合物、模板核酸分子、能够与模板核酸分子的一部分退火的寡核苷酸引物和一种或多种核苷酸(例如，脱氧核苷三磷酸，dNTPS)和在寡核苷酸引物与模板核酸分子退火并且所述DNA聚合酶通过聚合一个或多个核苷酸而延伸所述寡核苷酸引物的条件下温育所述反应混合物。合适的条件是本领域熟知的。优选使用恒温，优选的温度在本文其他地方列出。任选地，检测多核苷酸产物的产生(例如通过凝胶电泳)。

另一方面，本发明提供了使用本发明的DNA聚合酶扩增核酸(DNA)的方法。通常，所述方法包括提供包含本发明的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够与模板核酸分子酸分子和核苷酸(例如脱氧核苷三磷酸，dNTPS)的一部分退火的寡核苷酸引物(例如2个或更多个引物，例如2、3、4、5或6个引物)的反应混合物，并在寡核苷酸引物与模板核酸分子和所述DNA聚合酶退火的条件下温育所述反应混合物通过聚合一个或多个核苷酸延伸所述寡核苷酸引物以产生多核苷酸。合适的条件是本领域熟知的。优选的核酸扩增方法是等温扩增方法。本发明的等温扩增方法在恒定温度下进行，优选的温度在本文其他地方列出。任选地，检测多核苷酸产物的产生(例如通过凝胶电泳)。

示例性的等温扩增方法包括环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引发扩增(CPA)。

优选地，在本发明的方法和用途中使用的恒温是低至中等温度，例如0℃至约42℃，优选约10℃至约40℃，或约20℃至约40℃，或约25℃至约40℃，或约30℃至约40℃，或约35℃至约40℃，或约37℃至约40℃。在一些实施方案中，恒定温度为约10℃至约15℃或约10℃至约20℃。在一些实施方案中，恒温为约10℃至约30℃。在一些实施方案中，恒定温度为约20℃至约30℃。在一些实施方案中，恒温为约10℃至约25℃。在一些实施方案中，恒定温度为约20℃至约25℃。优选恒温为约25℃。在一些实施方案中，恒温为25℃。

当没有采取有效步骤来改变反应过程中的温度时，如没有热循环，该温度可被认为是恒定的。“恒定”温度仍可允许该方法中的温度波动高达约5℃，通常不超过3℃或2℃。

本发明的DNA聚合酶可用于即时分子诊断平台。

本发明的DNA聚合酶可用于全基因组扩增。

本发明的DNA聚合酶可用于下一代测序方法。所谓的“下一代”或“第二代”测序方法(参考作为“第一代”方法的Sanger双脱氧核苷酸方法)已经变得普遍。这些较新的技术的特征在于高通量，例如为并行使用(如大规模平行测序反应)或通过较少的耗时步骤的结果。各种高通量测序方法提供单分子测序并采用诸如焦磷酸测序、可逆终止子测序、通过连接的可切割探针测序、通过连接的不可切割探针测序、DNA纳米球和实时单分子测序的技术。

还提供了使用本发明的DNA聚合酶的酶活性片段的用途和方法，并且本文对本发明的DNA聚合酶的引用包括这些活性片段，除非从上下文中额外指明。

通常在体外执行本发明的用途和方法。

本发明还提供了包含本发明的DNA聚合酶的组合物。此类组合物优选包含缓冲剂。任选地，本发明的组合物还包含一种或多种进行核酸扩增反应(例如等温扩增反应)的必需试剂，例如能够与待扩增的模板DNA区域和/或核苷酸(例如dNTP)退火的寡核苷酸引物。通常，组合物为含水的并用标准缓冲液如Tris、HEPES等缓冲。

本发明进一步包括试剂盒，其包含一种或多种本发明的DNA聚合酶，或一种或多种本发明的组合物，或一种或多种本发明的核酸分子，或一种或多种本发明的表达载体，或一种或多种本发明的宿主细胞或病毒。优选地，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如用于核酸扩增方法(例如等温扩增反应)。优选地，所述试剂盒包含使用试剂盒组分的说明书，例如用于核酸扩增。

本文公开的核苷酸和氨基酸序列及其序列标识符(SEQ ID NOs)

根据本技术领域的惯例，所有核苷酸序列在本文中以5'至3'列举。

SEQ ID NO:1——从嗜冷芽孢杆菌分离的截短DNA聚合酶I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1

TEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTK

SEQ ID NO:2——编码嗜冷芽孢杆菌DNA聚合酶I的SEQ ID NO:1序列的核酸序列

SEQIDNO:2

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SEQ ID NO:3——从嗜冷芽孢杆菌分离的全长DNA聚合酶I的氨基酸序列

SEQIDNO:3

MYLSTEKILLLDGNSLAYRAFFALPLLTNEHGIHTNAVYGFTMMLQKIMDEENPTHMLVAFDAGKTTFRHSTFGDYKGGRQKTPPELSEQFPYIRKLIDAYGIKRYELEMYEADDIIGTLSKRADEKGQQVVIVSGDKDLTQLATDKTTVYITRKGITDIEKYTPEHVQEKYGLTPLQIIDMKGLMGDASDNIPGVPGVGEKTAIKLLKEHGSVEDLYKALDTVSGVKLKEKLIANEEQAIMSKALATIETAAPIQISIDDLSYTGPNMEEVIEVWKELAFKTLLEKSDYISEESETTEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTK

SEQ ID NO:4——编码嗜冷芽孢杆菌DNA聚合酶I的SEQ ID NO:3序列的核酸序列

SEQIDNO:4

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ttagaaatgtatgatgggcaatatcatacaagcgaattattaggtattgctttatcagat

ggagaaaagggttattttgctcctgctgatatagcttttcaatcgaaggatttttgttct

tggttagaaaatgctacgaataaaaagtatttagcagactccaaagcaacacaagcagtg

agtagaaaacataatgtgaatgtacatggagtggaattcgaccttcttttagcagcgtat

atagtaaatcctgctatctcttcagaggatgttgctgctattgctaaagaatttggatat

tttaacttgctgacaaacgatagtgtttatgggaaaggtgccaaaaaaaccgcacctgaa

atcgagaaaattgcagaacatgccgtaagaaaagcaagggctatttgggacttgaaagaa

aagttagaagtaaaactggaagaaaatgaacaatatgcgttgtataaagaaatagagcta

ccgcttgcatctatccttggtacgatggaatcagatggggtgctggtggataaacaaatt

cttgtagaaatgggtcatgagcttaatattaagttacgagcgattgaacaagacatttat

gcgttagctggtgaaacgtttaatattaattcacctaaacaattaggtgtaatactattt

gaaaaaattggtcttacccctattaaaaagacaaaaacgggctattcaactgcagcagat

gttttggaaaaactagcaagtgaacatgaaataatagagcaaattttactatatcgtcaa

ttaggtaaactcaattccacatatatcgaaggattattaaaagagattcatgaagatgat

gggaagatccatacccgatatcaacaagccctaacttcaactgggcgtttgagttcgatc

aatccaaaccttcaaaatataccagttcgtttagaagaaggtagaaaaatacgtaaagcc

tttgttccttcacaaccgggatgggtaatgtttgcggcggattactctcaaattgaattg

cgtgttcttgcccatatgtctgaggatgaaaacctggtagaagcttttaataatgatctg

gatattcatactaaaacggctatggatgtattccatgtggagcaggaagcagtaacgtcc

gatatgcgccgtgctgctaaggcagttaactttgggattgtgtatggtattagtgattat

ggtttatcacaaaacctagatattactagaaaagaagcggcgacatttatcgagaattat

ttaaatagcttcccaggtgtaaaaggatatatggatgatatcgttcaagatgcgaaacaa

acaggctacgttacaacaattttgaatagacgaagatatttgcctgaaataacaagttct

aactttaatctccgcagttttgcagaacgtactgctatgaatacaccaattcaagggagt

gcagccgatattattaaaaaagcaatgatcgatatggcggaaagattaatatcagaaaat

atgcagaccaaaatgctactacaagtacatgatgaattaatttttgaggctccaccagag

gaaattgcaatgctagaaaaaatagtgccagaggtgatggaaaacgctattaaactgatt

gtacctttgaaagtggattatgcctttggttcatcttggtatgacacgaagtag

SEQ ID NO:5——含有从嗜冷芽孢杆菌中分离的DNA聚合酶I的5'-3'外切核酸酶功能结构域的序列

SEQIDNO:5

MYLSTEKILLLDGNSLAYRAFFALPLLTNEHGIHTNAVYGFTMMLQKIMDEENPTHMLVAFDAGKTTFRHSTFGDYKGGRQKTPPELSEQFPYIRKLIDAYGIKRYELEMYEADDIIGTLSKRADEKGQQVVIVSGDKDLTQLATDKTTVYITRKGITDIEKYTPEHVQEKYGLTPLQIIDMKGLMGDASDNIPGVPGVGEKTAIKLLKEHGSVEDLYKALDTVSGVKLKEKLIANEEQAIMSKALATIETAAPIQISIDDLSYTGPNMEEVIEVWKELAFKTLLEKSDYISEESET

SEQ ID NO:6——用于本文所述试验的沙门氏嗜血杆菌的截短DNA聚合酶的氨基酸序列。

SEQIDNO:6

VDRSKYETIFTKEAFSAWLEKVNNAEVTAFDTETDSLDYMVANLIGLSFSVEEGEAAYVPVAHDYLDAPEQLDRDWVLAQLKPYLEDETKAKVGQNLKYDASVLARYDIEMKGIKFDTMLESYVYNSVAGKHNMDSLALRYLQHNTISFEEIAGKGKKQLTFNQIALEEAAPYAAEDADITLRLHNVLHAKLVTDEKLNAVFTDIELPLISVLSRMERKGVYIDDMLLSAQSLEIGQRLDELETASFEVAGQEFNMNSPKQLQTILFEKMELPVIKKTPSGAASTNEEVLQELALEYELPKLILEYRGLAKLKSTYTDKLPKMINPSTGRVHTSYHQAVTATGRLSSTDPNLQNIPIRNKEGRRIRQAFVAPHGWKILAVDYSQIELRIMAHLSQDRALLEAFSAGKDIHAATAAEVKGVSIEEVTSEDRRRAKAINFGLIYGMSAFGLAKQIGISRGEAQDYMNVYFERYPGVMQYMEETRLLATEQGYVETLYGRRLYLPEINARNAIRRKAAERAAINAPMQGTAADIIKKAMILVDNWIEAEGTGRVNLLMQVHDELVFEVKEDELEAITKQVTALMEAAVSLDVPLIAESGFGDNWDEAH

用于与PB DNA聚合酶比较的商业酶，即KF、Bst、Bst2.0、BSU、T4和T7DNA聚合酶均购自New England Biolabs。

附图说明

现将通过非限制性实施例并参考以下附图的方式描述本发明，其中：

图1显示了源于嗜冷芽孢杆菌(PB)的重组产生的海洋聚合酶与其他聚合酶在25℃下的聚合酶活性(比活)的比较。商业上已知的聚合酶为KF(大肠杆菌Klenow片段)，Bst(嗜热脂肪地芽胞杆菌)，Bst 2.0(嗜热脂肪地芽胞杆菌)和BSU(枯草芽胞杆菌)。

图2显示了链置换活性测定装置的概述。F＝荧光团。Q＝猝灭剂。

图3显示了源于嗜冷芽孢杆菌(PB)的重组产生的海洋聚合酶与其他聚合酶在25℃下的链置换活性(比活)。商业上已知的聚合酶为KF(大肠杆菌Klenow片段)，Bst(嗜热脂肪地芽胞杆菌)，Bst 2.0(嗜热脂肪地芽胞杆菌)和BSU(枯草芽胞杆菌)。

图4显示了PB聚合酶和其他聚合酶在不同NaCl浓度下的聚合酶活性。商业上已知的聚合酶为KF(大肠杆菌Klenow片段)，Bst(嗜热脂肪地芽胞杆菌)，Bst 2.0(嗜热脂肪地芽胞杆菌)和BSU(枯草芽胞杆菌)。

图5显示了温度对PB聚合酶的聚合酶活性的影响。

图6显示了相较于KF，温度对PB聚合酶稳定性的影响。KF为Klenow Fragment(E.coli)。

图7显示了在不同pH下PB聚合酶I的解链温度(T_m(℃))分析。

图8显示了商业的耐热Bstpoll(Bst2.0)、常温Bsu和PB poll(Pb1)之间持续性(标记为Pr的泳道)的比较。T7是已知的高持续性酶，用作高持续性的阳性对照。标记为P的泳道表示聚合酶活性而Pr表示持续性。基于未标记的DNA捕获物的温育来分析持续性，如果酶从模板链解离并且在凝胶上可看到较少的最终产物产量(+80个核苷酸掺入)，则其将超过DNA聚合酶重新结合到标记的底物上。

具体实施方式

实施例

克隆，基因表达和蛋白质纯化

SEQ ID NO:1的PB聚合酶的生产

基于嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶I及其截短的“大片段”(PDB 1L3S)的结构知识，在表达构建体中除去了不需要的5'-3'外切核酸酶结构域，即正向引物是以PB聚合酶的PCR产物缺乏不需要的外切核酸酶结构域的方式设计。使用

技术(Thermo Fisher)将编码来自嗜冷芽孢杆菌的DNA聚合酶I的基因克隆到载体pET151/D-

中。聚合酶链式反应的起始原料是嗜冷芽孢杆菌的基因组DNA。通过使用正向引物(5'-CACCACAGAAGTAGCATTCGAGATTGTT-3'(SEQ ID NO:7))和反向引物(5'-TTACTTCGTGTCATACCAAGATGAACC-3'(SEQ ID NO:8))，该基因已被截短并且与所述聚合酶I的大片段类似。

在Rosetta 2(DE3)细胞

中进行重组蛋白质生产。细胞在TerrificBroth中生长，并且通过添加IPTG诱导基因表达。蛋白质生产在15℃下进行6小时。在第一个纯化步骤中，通过固定化的Ni²⁺亲和层析纯化His₆标记的蛋白质。第二步是通过在4℃夜间进行的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割标签。为了将蛋白质与His₆标签和His₆标记的TEV蛋白酶分离，在第三步中进行了第二次Ni²⁺亲和层析。第四步也是最后一步为蛋白质纯化在HiLoad 16/600Superdex 200pg(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱的蛋白质纯化。浓缩最终的蛋白质溶液并在-20℃下用50％甘油储存。

聚合酶活性测定

本实验使用分子信标测定在25℃下比较PB聚合酶与特定市售聚合酶的DNA聚合酶活性。

聚合酶活性测定基于分子信标探针(修改自Summerer,Methods Mol.Biol.,2008,429,225-235)。分子信标模板由23mer环组成，其通过富含GC的8mer茎区(序列以斜体表示)和一个43mer的延伸连接。由于环形成，荧光团Dabcyl和FAM非常接近并因此淬灭。在通过与分子信标模板退火的引物的DNA聚合酶I延伸时，打开茎，并通过恢复FAM荧光(激发485nm，发射518nm)测量两个荧光团的距离的增加。

分子信标模板

5′-GGCCCGT^DabcylAGGAGGAAAGGACATCTTCTAGCAT^FAMACGGGCCGTCAAGTTCATG

GCCAGTCAAGTCGTCAGAAATTTCGCACCAC-3’(SEQ ID NO:9)

引物

5′-GTGGTGCGAAATTTCTGAC-3’(SEQ ID NO:10)

通过在95℃的条件下将20μl的10μM分子信标模板和15μM引物在10mM Tris-HClpH8.0的100mM NaCl中温育5分钟来制备分子信标底物。然后使反应在室温下冷却2小时。将底物溶液储存在-20℃，终浓度为10μM。

由200nM底物和200μM dNTP(等摩尔量的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)组成50微升反应。对于PB聚合酶I，反应还包含5mM MgCl2(存在于pH 8.5的50mM BIS-TRIS丙烷中)、100mMNaCl、1mM DTT、0.2mg/ml BSA和2％甘油。对于商业上已知的聚合酶I，已经使用了NewEngland Biolabs提供的相应反应缓冲液。根据各聚合酶的最佳盐，将反应缓冲液中的最终盐浓度调节至100mM。活性测定在25℃下在黑色96孔荧光测定板

中进行。通过加入蛋白质溶液(即加入聚合酶)引发反应。通过在485nm激发和在518nm发射，以适当的时间间隔测量FAM荧光的增加作为相对荧光单位。测量在

Gemini MicroplateReader(Molecular Devices)上进行。

该聚合酶活性测定的结果显示在图1中。PB聚合酶显示出比商业(New EnglandBiolabs)可获得的聚合酶KF(大肠杆菌Klenow片段)、Bst(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的聚合酶)、Bst 2.0(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的聚合酶)更高的聚合酶活性。只有来自枯草芽孢杆菌的BSU聚合酶在该温度下显示出更高的聚合酶活性。

还进行了相同类型的聚合酶活性测定，以比较PB聚合酶与来自海洋来源的其他DNA聚合酶的DNA聚合酶活性(数据未显示)。与测试的其他海洋聚合酶(例如，Aliivibriosalmonicida的DNA聚合酶)相比，PB聚合酶具有显著更高的聚合酶活性。

链置换活性测定

本实验使用链置换活性测定法在25℃下比较PB DNA聚合酶与某些市售聚合酶的链置换活性。聚合酶置换链的能力，称为链置换，对于许多等温扩增方法来说是重要的。

评估链置换性质的重要性在于设计是一种稳定的测定。分析设置的概述如图2所示。该测定基于在猝灭的报道链置换时测量的荧光信号的增加，这只能通过DNA聚合酶的链置换活性实现。作为对照，使用链置换阴性聚合酶T4，并且在测定中未显示活性(结果未显示)。

用于链置换活性测定的底物由19个寡核苷酸(SEQ ID NO:11)的“冷”引物和由20个寡核苷酸组成的报道链组成，所述寡核苷酸在其3'末端(SEQ ID NO:12)用TAMRA荧光团(F)标记。模板链由40个寡核苷酸组成，并在其5'末端用Black Hole Quencher 2(BHQ2)标记(SEQ ID NO:13)。将引物与模板链退火，在模板链上的第20位留下一个核苷酸间隙。此外，由于标签非常接近，因此荧光团TAMRA被BHQ2淬灭。在DNA聚合酶I的链置换活性后，TAMRA标记的寡核苷酸从模板链置换。因而荧光团和猝灭剂不再紧密接近，并且可以测量TAMRA荧光的增加(激发525nm，发射598nm)。

5’-TATCCACCAATACTACCCT CGATACTTTGTCCACTCAAT[TAMRA]-3’

3’-ATAGGTGGTTATGATGGGATGCTATGAAACAGGTGAGTTA[BHQ2]-5’

使用上述链置换活性测定法分析以mRFU/min/μg表示的PB聚合酶的链置换活性。用于链置换活性测定的底物通过将20μl的10μM浓度的“冷”引物、10μM报道链和10μM模板链在10mM的Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl中于95℃温育5分钟来产生。然后使反应在室温下冷却2小时。将底物溶液储存在-20℃，终浓度为10μM。

中进行。通过加入蛋白质溶液(即加入聚合酶)引发反应。通过在525nm激发和在598nm发射，以适当的时间间隔测量FAM荧光的增加作为相对荧光单位。测量在

Gemini MicroplateReader(Molecular Devices)上进行。

该链置换活性测定的结果显示在图3中。结果表明来自嗜冷芽孢杆菌(PB)的聚合酶具有优于市售聚合酶KF(大肠杆菌Klenow片段)、Bst(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的聚合酶)、Bst 2.0(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的聚合酶)的链置换活性。嗜冷芽孢杆菌(PB)的DNA聚合酶显示出与市售BSU(枯草芽孢杆菌)聚合酶相当的链置换活性。

还进行了相同类型的链置换活性测定，以比较PB聚合酶与来自海洋来源的其他DNA聚合酶的DNA聚合酶活性(数据未显示)。与测试的其他海洋聚合酶(例如，沙门氏嗜血杆菌的DNA聚合酶)相比，PB聚合酶具有显著更高的链置换活性。

盐浓度对聚合酶活性的影响分析

在例如血液的粗制样品中，可能存在几种能够抑制聚合酶反应的化合物。这样的化合物的一种是盐(高盐含量)。如下描述进行评估盐浓度对聚合酶活性的影响的实验。

已经使用所述聚合酶活性测定法通过改变了反应缓冲液中存在的盐的量分析了PB DNA聚合酶的最佳NaCl浓度。百分之百的活性是指盐浓度产生最高的聚合酶活性。即，对于每种测试的DNA聚合酶，观察到的最大聚合酶活性设定为100％的活性值。每条曲线中的其他值(数据点)与各聚合酶的100％的活性相对。

由200nM底物和200μM dNTP(等摩尔量的dATP、dGTP、dCTP和dTTP)组成50微升反应。对于PB聚合酶I，反应还包含5mM MgCl2(存在于pH 8.5的50mM BIS-TRIS丙烷中)、1mMDTT、0.2mg/ml BSA和2％甘油。对于商业上已知的聚合酶I，已经使用了New EnglandBiolabs提供的省略盐的相应缓冲液。在该实验中测试的各NaCl浓度已经单独添加到每个反应中。活性测定在25℃下在黑色96孔荧光测定板

中进行。通过加入蛋白质溶液引发反应，其中，PB为1μg/ml，Bst为16单位/ml，Bst 2.0为16单位/ml，BSU为2.5单位/ml，或KF为2单位/ml。通过在485nm激发和在518nm发射，以适当的时间间隔测量FAM荧光的增加作为相对荧光单位。测量在

Gemini Microplate Reader(Molecular Devices)上进行。

该实验的结果如图4所示。从图4中可以明显看出，PB DNA聚合酶对不同盐浓度的范围表现出耐受性。

温度对PB聚合酶聚合酶活性的影响

已经用单核苷酸掺入测定法研究了温度对PB聚合酶I的聚合酶活性的影响。

单核苷酸掺入测定

将由19个寡核苷酸(SEQ ID NO:15)组成的引物与由40个寡核苷酸(SEQ ID NO:14)组成的模板链退火。引物在其5'末端用FAM荧光团标记。在反应设置中，将仅提供dATP，因此聚合酶可以仅在5'-3'方向上将引物延伸至第20位的一个核苷酸。随后在聚丙烯酰胺凝胶(12％聚丙烯酰胺/7M尿素)上并扫描FAM标记的寡核苷酸的分析显示引物由19个寡核苷酸组成，引物由核苷酸腺嘌呤延伸并因此由20个寡核苷酸组成。酶活性通过表示延伸引物(强度1)和未延伸引物(强度0)的条带的密度测量来确定。相对掺入率计算如下：

掺入[％]＝强度1/(强度0+强度1)*100

5’-ATTGAGTGGAGATAGTATCGTAGGGTAGTATTGGTGGATA–3'40mer

3’-TCCCATCATAACCACCTAT[FAM]–5'19mer

通过将20μl的0.5μM荧光团标记的引物和0.5μM模板DNA在10mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl中于75℃温育5分钟来产生用于单核苷酸掺入测定的底物。然后使反应在室温下冷却2小时。将底物溶液储存在-20℃，终浓度为0.5μM。

10微升反应含有30nM底物和10μM dATP。对于PB聚合酶I，反应还包含5mM MgCl2(存在于pH 8.5的50mM TRIS中)、100nM NaCl、1mM DTT、0.2mg/ml BSA和2％甘油。在各温育温度下将反应缓冲液在室温下的pH调节至pH 8.5。通过添加0.018ng/μl蛋白质PB聚合酶I引发反应，并在各自的温度(即对应于图5中的数据点的温度)下温育15分钟。作为阴性对照的蛋白质稀释缓冲液已被用于代替蛋白质溶液。

通过加入2.5μl变性凝胶上样缓冲液(95％甲酰胺，10mM EDTA，0.1％二甲苯蓝)终止反应，并在95℃温育5分钟。6μl的样品体积加载到凝胶上用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％聚丙烯酰胺/7M尿素)。凝胶电泳在0.5×TBE缓冲液(44.5mM Tris，44.5mM硼酸，1mMEDTA)中在50W下进行1小时15分钟，随后用PharosFX Plus Imager(Bio-Rad)扫描凝胶。

该实验的结果如图5所示。百分之百的活性是指具有最高活性的温度值。即，对于测试的PB DNA聚合酶，观察到的最大聚合酶活性设定为100％活性值。每条曲线中的其他值(数据点)为针对各聚合酶的100％活性。举例来说，在20℃的温育温度下，PB聚合酶的聚合酶活性是观察到的最大PB聚合酶活性的约60％，即存在约60％的“相对”活性。

图5中的结果显示PB聚合酶在宽温度范围内具有显著的聚合酶活性。

相较于KF(Klenow Fragment)，温度对PB聚合酶稳定性的影响。

已用单核苷酸掺入测定法研究了温度对PB聚合酶I稳定性的影响。

单核苷酸掺入测定

将由19个寡核苷酸(SEQ ID NO:15)组成的引物与由40个寡核苷酸(SEQ ID NO:14)组成的模板链退火。引物在其5'末端用FAM荧光团标记。在反应设置中仅提供dATP，因此聚合酶可以仅在5'-3'方向上的第20位将引物延伸一个核苷酸。随后在聚丙烯酰胺凝胶(12％聚丙烯酰胺/7M尿素)上并扫描FAM标记的寡核苷酸的分析显示引物由19个寡核苷酸组成，引物由核苷酸腺嘌呤延伸并因此由20个寡核苷酸组成。酶活性通过表示延伸引物(强度1)和未延伸引物(强度0)的条带的密度测量来确定。相对掺入率计算如下：

掺入[％]＝强度1/(强度0+强度1)*100

5’-ATTGAGTGGAGATAGTATCGTAGGGTAGTATTGGTGGATA–3'40mer

3’-TCCCATCATAACCACCTAT[FAM]–5'19mer

对于PB聚合酶I，在pH 8.5的50mM BIS-TRIS丙烷、100mM NaCl、5mM MgCl 2、1mMDTT、0.2mg/ml BSA和2％甘油中进行10μl反应。为了测试灭活温度，将0.018ng/μl的PB聚合酶I加入到反应缓冲液中，在各自的温度(即对应于图6中的数据点的温度)下温育15分钟，然后在冰上冷却5分钟。对于KF，根据New England Biolabs提供的相应缓冲液的组成在25℃制备最佳pH值的反应缓冲液。将蛋白质以0.67单位/ml加入反应缓冲液中，并进行如PB聚合酶I所描述温育反应。作为阴性对照蛋白质，使用稀释缓冲液代替蛋白质溶液。

通过添加30nM底物和10μM的dATP引发单核苷酸延伸反应，并将混合物在25℃温育15分钟。通过加入2.5μl变性凝胶上样缓冲液(95％甲酰胺，10mM EDTA，0.1％二甲苯蓝)终止反应，并在95℃温育5分钟。6μl的样品体积加载到凝胶上用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％聚丙烯酰胺/7M尿素)。凝胶电泳在0.5×TBE缓冲液(44.5mM Tris，44.5mM硼酸，1mMEDTA)中在50W下进行1小时15分钟，随后用PharosFX Plus Imager(Bio-Rad)扫描凝胶。

该实验的结果如图6所示。百分之百活性是指在冰上温育的酶样品(0℃)。即，对于每种测试的DNA聚合酶(PB和来自大肠杆菌(KF)Klenow Fragment)，在单核苷酸延伸反应设定为100％活性值之前，当聚合酶在冰上(0℃)温育15分钟时观察到聚合酶活性。每条曲线中的其他值(数据点)为相对于各聚合酶的100％活性。举例来说，开始单核苷酸延伸反应之前，在37℃温育15分钟后，PB聚合酶的聚合酶活性是开始进行单核苷酸延伸反应之前在冰上(0℃)温育15分钟时观察到的PB聚合酶活性的约80％，即存在约80％的“残留”活性。

图6中的结果显示，与KF相比，PB聚合酶在一系列温度下预先温育后保留了更高的聚合酶活性。即，PB聚合酶比KF聚合酶更温度稳定。例如，在开始单核苷酸延伸反应之前在30℃温育15分钟，PB聚合酶保留与开始单核苷酸延伸反应之前在冰上(0℃)温育时相同的聚合酶活性。(即在30℃温育时有100％的残余活性)。相反，在开始单核苷酸延伸反应之前在30℃温育15分钟时，KF聚合酶仅有60％的在单核苷酸延伸反应之前在冰上进行(0℃)温育时观察到的聚合酶活性。(即，在30℃温育下存在约60％的残余活性)。

还进行了相同类型的测定以比较PB聚合酶与来自海洋来源的其他DNA聚合酶的DNA聚合酶活性(数据未显示)。与测试的其他海洋聚合酶(例如，Aliivibrio salmonicida的DNA聚合酶)相比，PB聚合酶具有显著更高的稳定性。

显示PB聚合酶在不同pH缓冲液中的解链温度的生物物理数据

根据Ericsson等(Anal.Biochem.,2006,357,289–298)，通过热氟实验测定蛋白质的熔化温度(Tm)。已测试了多种浓度为50mM的pH 6.0至pH 9.5的缓冲液。相应的缓冲液，

Orange(Sigma Aldrich)，最终稀释度为6x和12.5μg蛋白质(即，将PB聚合酶)在薄壁PCR板(Biorad)的孔中彻底混合。用光学质量的密封带(Biorad)密封孔。最终反应的体积为25μl。在thermofluor实验中扫描了10-90℃的温度范围，且以3秒的间隔增加0.3℃。

该实验的结果如图7所示。PB聚合酶I在pH 6-8.5的范围内显示宽的pH稳定性性质，解链温度平均为约43-44℃，进一步证明其相对宽的温度应用范围。

持续性

持续性是DNA聚合酶在解离前合成(核苷酸掺入)期间保持与DNA模板链结合的能力，因此DNA合成的总效率可随着给定聚合酶的持续性的增加而增加。该特征是重要的，特别是如果需要合成更长的DNA片段。因此，持续性试验设计用于测量单一结合事件后的聚合程度。为了使延伸产物反映聚合酶的持续性，在这种情况下加入过量的捕获DNA以确保每个引物模板仅延伸一次。

100-mer模板

3'ATGTTGGTTCTCGTATGCTGCCGGTCACGGCTTAAGTGTGCCACAACACACAACCAAC

ACCACCACAACACACCAACAACCACAACACACACAACCACAC-5'(SEQ ID NO:16)

Fam标记的20-mer引物

5'FAM-TACAACCAAGAGCATACGAC(SEQ ID NO:17)

为了制备引物-模板DNA底物，将100mer模板(0.5μM)与20mer FAM标记的引物(0.5μM)在50mM NaCl和50mM tris/HCl pH 7.5的存在下于75℃温育5分钟，然后冷却至室温至少2小时。将本文测试的PB聚合酶I和商业聚合酶(New England Biolabs)与DNA底物(25nM)和50mM Tris-HCl中的dNTP(10μM)(对于PB聚合酶I和T7DNA聚合酶的pH为8.5，对于Bst 2.0和BSU的pH为7.5)、50mM KCl(PB聚合酶I，Bst 2.0，T7DNA聚合酶)或50mM NaCl(BSU)、0.2mg/ml BSA、1mM DTT和2％甘油在25℃预温育10分钟。

通过加入5mM MgCl₂和1.1mg/ml Herring精子DNA作为捕获剂开始反应(Pr)，并在2分钟后通过加入终止溶液(95％甲酰胺10mM EDTA，0.05％溴酚蓝)终止反应。为了显示捕获剂的有效性，在平行反应中用MgCl₂(R0)开始反应之前将相同量的PbI与1.1mg/ml的捕获剂和DNA底物预温育。作为引发底物的完全聚合的对照，在相同的反应条件下进行另一反应(P)而不添加任何捕获剂。在P反应中提供等效聚合酶活性的酶量用作持续性分析的起点。因此，使用以下量的酶用于持续性分析：PB聚合酶I 0.013μg，Bst 2.0 0.14μg和BSU0.016μg。

在95℃下加热5分钟进行反应，并将产物在含有8M尿素的10％TBE-聚丙烯酰胺凝胶上分离。然后通过Pharose FX Plus成像仪(BioRad)使图像可视化。

该实验的结果如图8所示。这些结果表明，与Bsu和Bst 2.0相比，PB聚合酶具有显著更高的持续性，其中其表现顺序为PB>Bsu>Bst 2.0。

序列表

<110> 特罗姆瑟大学- 挪威北极圈大学

<120> 海洋DNA聚合物

<130> 59.15.123840/02

<150> GB1604876.1

<151> 2016-03-22

<160> 17

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 截短的PB聚合酶

<400> 1

Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu

1 5 10 15

Asp Lys Val Met Ser Val His Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His

20 25 30

Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr

35 40 45

Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp

50 55 60

Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr

65 70 75 80

Gln Ala Val Ser Arg Lys His Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe

85 90 95

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu

100 105 110

Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr

115 120 125

Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile

130 135 140

Glu Lys Ile Ala Glu His Ala Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp

145 150 155 160

Leu Lys Glu Lys Leu Glu Val Lys Leu Glu Glu Asn Glu Gln Tyr Ala

165 170 175

Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Leu Gly Thr Met

180 185 190

Glu Ser Asp Gly Val Leu Val Asp Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Gly

195 200 205

His Glu Leu Asn Ile Lys Leu Arg Ala Ile Glu Gln Asp Ile Tyr Ala

210 215 220

Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val

225 230 235 240

Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly Leu Thr Pro Ile Lys Lys Thr Lys Thr

245 250 255

Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Ser Glu His

260 265 270

Glu Ile Ile Glu Gln Ile Leu Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Asn

275 280 285

Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Glu Ile His Glu Asp Asp Gly

290 295 300

Lys Ile His Thr Arg Tyr Gln Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu

305 310 315 320

Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Leu Glu Glu

325 330 335

Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala Phe Val Pro Ser Gln Pro Gly Trp Val

340 345 350

Met Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His

355 360 365

Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp

370 375 380

Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala

385 390 395 400

Val Thr Ser Asp Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile

405 410 415

Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr

420 425 430

Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro

435 440 445

Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr

450 455 460

Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile

465 470 475 480

Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met

485 490 495

Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met

500 505 510

Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu Ile Ser Glu Asn Met Gln Thr Lys Met

515 520 525

Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu

530 535 540

Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile

545 550 555 560

Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp

565 570 575

Tyr Asp Thr Lys

580

<210> 2

<211> 1743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 截短的PB聚合酶

<400> 2

acagaagtag cattcgagat tgttgaagaa attgactcta caatattaga taaagtaatg 60

tcagtccatt tagaaatgta tgatgggcaa tatcatacaa gcgaattatt aggtattgct 120

ttatcagatg gagaaaaggg ttattttgct cctgctgata tagcttttca atcgaaggat 180

ttttgttctt ggttagaaaa tgctacgaat aaaaagtatt tagcagactc caaagcaaca 240

caagcagtga gtagaaaaca taatgtgaat gtacatggag tggaattcga ccttctttta 300

gcagcgtata tagtaaatcc tgctatctct tcagaggatg ttgctgctat tgctaaagaa 360

tttggatatt ttaacttgct gacaaacgat agtgtttatg ggaaaggtgc caaaaaaacc 420

gcacctgaaa tcgagaaaat tgcagaacat gccgtaagaa aagcaagggc tatttgggac 480

ttgaaagaaa agttagaagt aaaactggaa gaaaatgaac aatatgcgtt gtataaagaa 540

atagagctac cgcttgcatc tatccttggt acgatggaat cagatggggt gctggtggat 600

aaacaaattc ttgtagaaat gggtcatgag cttaatatta agttacgagc gattgaacaa 660

gacatttatg cgttagctgg tgaaacgttt aatattaatt cacctaaaca attaggtgta 720

atactatttg aaaaaattgg tcttacccct attaaaaaga caaaaacggg ctattcaact 780

gcagcagatg ttttggaaaa actagcaagt gaacatgaaa taatagagca aattttacta 840

tatcgtcaat taggtaaact caattccaca tatatcgaag gattattaaa agagattcat 900

gaagatgatg ggaagatcca tacccgatat caacaagccc taacttcaac tgggcgtttg 960

agttcgatca atccaaacct tcaaaatata ccagttcgtt tagaagaagg tagaaaaata 1020

cgtaaagcct ttgttccttc acaaccggga tgggtaatgt ttgcggcgga ttactctcaa 1080

attgaattgc gtgttcttgc ccatatgtct gaggatgaaa acctggtaga agcttttaat 1140

aatgatctgg atattcatac taaaacggct atggatgtat tccatgtgga gcaggaagca 1200

gtaacgtccg atatgcgccg tgctgctaag gcagttaact ttgggattgt gtatggtatt 1260

agtgattatg gtttatcaca aaacctagat attactagaa aagaagcggc gacatttatc 1320

gagaattatt taaatagctt cccaggtgta aaaggatata tggatgatat cgttcaagat 1380

gcgaaacaaa caggctacgt tacaacaatt ttgaatagac gaagatattt gcctgaaata 1440

acaagttcta actttaatct ccgcagtttt gcagaacgta ctgctatgaa tacaccaatt 1500

caagggagtg cagccgatat tattaaaaaa gcaatgatcg atatggcgga aagattaata 1560

tcagaaaata tgcagaccaa aatgctacta caagtacatg atgaattaat ttttgaggct 1620

ccaccagagg aaattgcaat gctagaaaaa atagtgccag aggtgatgga aaacgctatt 1680

aaactgattg tacctttgaa agtggattat gcctttggtt catcttggta tgacacgaag 1740

tag 1743

<210> 3

<211> 877

<212> PRT

<213> 嗜冷芽孢杆菌(Psychrobacillus sp.)

<400> 3

Met Tyr Leu Ser Thr Glu Lys Ile Leu Leu Leu Asp Gly Asn Ser Leu

1 5 10 15

Ala Tyr Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu Thr Asn Glu His Gly

20 25 30

Ile His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Gln Lys Ile

35 40 45

Met Asp Glu Glu Asn Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly

50 55 60

Lys Thr Thr Phe Arg His Ser Thr Phe Gly Asp Tyr Lys Gly Gly Arg

65 70 75 80

Gln Lys Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Tyr Ile Arg Lys

85 90 95

Leu Ile Asp Ala Tyr Gly Ile Lys Arg Tyr Glu Leu Glu Met Tyr Glu

100 105 110

Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ser Lys Arg Ala Asp Glu Lys Gly

115 120 125

Gln Gln Val Val Ile Val Ser Gly Asp Lys Asp Leu Thr Gln Leu Ala

130 135 140

Thr Asp Lys Thr Thr Val Tyr Ile Thr Arg Lys Gly Ile Thr Asp Ile

145 150 155 160

Glu Lys Tyr Thr Pro Glu His Val Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro

165 170 175

Leu Gln Ile Ile Asp Met Lys Gly Leu Met Gly Asp Ala Ser Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu

195 200 205

Lys Glu His Gly Ser Val Glu Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Asp Thr Val

210 215 220

Ser Gly Val Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn Glu Glu Gln Ala

225 230 235 240

Ile Met Ser Lys Ala Leu Ala Thr Ile Glu Thr Ala Ala Pro Ile Gln

245 250 255

Ile Ser Ile Asp Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Pro Asn Met Glu Glu Val

260 265 270

Ile Glu Val Trp Lys Glu Leu Ala Phe Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser

275 280 285

Asp Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Glu Thr Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile

290 295 300

Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu Asp Lys Val Met Ser Val His

305 310 315 320

Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile

325 330 335

Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala

340 345 350

Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys

355 360 365

Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr Gln Ala Val Ser Arg Lys His

370 375 380

Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr

385 390 395 400

Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys

405 410 415

Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys

420 425 430

Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile Glu Lys Ile Ala Glu His Ala

435 440 445

Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp Leu Lys Glu Lys Leu Glu Val

450 455 460

Lys Leu Glu Glu Asn Glu Gln Tyr Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Leu

465 470 475 480

Pro Leu Ala Ser Ile Leu Gly Thr Met Glu Ser Asp Gly Val Leu Val

485 490 495

Asp Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Gly His Glu Leu Asn Ile Lys Leu

500 505 510

Arg Ala Ile Glu Gln Asp Ile Tyr Ala Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn

515 520 525

Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly

530 535 540

Leu Thr Pro Ile Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp

545 550 555 560

Val Leu Glu Lys Leu Ala Ser Glu His Glu Ile Ile Glu Gln Ile Leu

565 570 575

Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Asn Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu

580 585 590

Leu Lys Glu Ile His Glu Asp Asp Gly Lys Ile His Thr Arg Tyr Gln

595 600 605

Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu

610 615 620

Gln Asn Ile Pro Val Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala

625 630 635 640

Phe Val Pro Ser Gln Pro Gly Trp Val Met Phe Ala Ala Asp Tyr Ser

645 650 655

Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu

660 665 670

Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met

675 680 685

Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala Val Thr Ser Asp Met Arg Arg

690 695 700

Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr

705 710 715 720

Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe

725 730 735

Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp

740 745 750

Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu

755 760 765

Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu

770 775 780

Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser

785 790 795 800

Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu

805 810 815

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820 825 830

Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile

835 840 845

Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys

850 855 860

Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp Tyr Asp Thr Lys

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<210> 4

<211> 2634

<212> DNA

<213> 嗜冷芽孢杆菌(Psychrobacillus sp.)

<400> 4

atgtatttgt caaccgagaa aatcctatta ttagacggca atagtttggc ataccgagct 60

ttttttgccc tacctttatt aacaaatgaa catggaatac atacaaacgc agtatatggc 120

tttacaatga tgctacaaaa aattatggat gaagaaaatc ctactcatat gctcgtggca 180

tttgatgccg ggaaaacgac cttccgtcac tctacttttg gggattataa aggtggaaga 240

caaaaaacac caccagaact atcggaacaa ttcccttata tacgcaagtt aatcgatgct 300

tatggtatta agcgatacga actggaaatg tacgaagcag acgatattat cggtacttta 360

agcaagcgtg cagacgaaaa agggcagcaa gttgtaattg tctcaggtga taaagattta 420

acacaactag ctacagataa aacaactgtg tatatcacaa gaaaaggcat aaccgatatt 480

gaaaaatata cacctgaaca tgtacaagaa aagtatggct taactccatt acagattata 540

gacatgaaag gtttaatggg agatgcttct gataatattc caggagttcc tggtgtcgga 600

gaaaaaacag ctattaagct tttaaaagaa catggttcgg tagaggattt atataaagca 660

cttgatacag ttagtggtgt taaactaaag gaaaaactca tcgccaacga agagcaggca 720

attatgagta aggcattagc tacgattgaa acagctgcac cgatacagat ttctatagac 780

gatctttcat atactggtcc taatatggaa gaagtaattg aagtttggaa ggaactagct 840

tttaaaactc ttcttgagaa atctgactat atttctgagg aatccgaaac tacagaagta 900

gcattcgaga ttgttgaaga aattgactct acaatattag ataaagtaat gtcagtccat 960

ttagaaatgt atgatgggca atatcataca agcgaattat taggtattgc tttatcagat 1020

ggagaaaagg gttattttgc tcctgctgat atagcttttc aatcgaagga tttttgttct 1080

tggttagaaa atgctacgaa taaaaagtat ttagcagact ccaaagcaac acaagcagtg 1140

agtagaaaac ataatgtgaa tgtacatgga gtggaattcg accttctttt agcagcgtat 1200

atagtaaatc ctgctatctc ttcagaggat gttgctgcta ttgctaaaga atttggatat 1260

tttaacttgc tgacaaacga tagtgtttat gggaaaggtg ccaaaaaaac cgcacctgaa 1320

atcgagaaaa ttgcagaaca tgccgtaaga aaagcaaggg ctatttggga cttgaaagaa 1380

aagttagaag taaaactgga agaaaatgaa caatatgcgt tgtataaaga aatagagcta 1440

ccgcttgcat ctatccttgg tacgatggaa tcagatgggg tgctggtgga taaacaaatt 1500

cttgtagaaa tgggtcatga gcttaatatt aagttacgag cgattgaaca agacatttat 1560

gcgttagctg gtgaaacgtt taatattaat tcacctaaac aattaggtgt aatactattt 1620

gaaaaaattg gtcttacccc tattaaaaag acaaaaacgg gctattcaac tgcagcagat 1680

gttttggaaa aactagcaag tgaacatgaa ataatagagc aaattttact atatcgtcaa 1740

ttaggtaaac tcaattccac atatatcgaa ggattattaa aagagattca tgaagatgat 1800

gggaagatcc atacccgata tcaacaagcc ctaacttcaa ctgggcgttt gagttcgatc 1860

aatccaaacc ttcaaaatat accagttcgt ttagaagaag gtagaaaaat acgtaaagcc 1920

tttgttcctt cacaaccggg atgggtaatg tttgcggcgg attactctca aattgaattg 1980

cgtgttcttg cccatatgtc tgaggatgaa aacctggtag aagcttttaa taatgatctg 2040

gatattcata ctaaaacggc tatggatgta ttccatgtgg agcaggaagc agtaacgtcc 2100

gatatgcgcc gtgctgctaa ggcagttaac tttgggattg tgtatggtat tagtgattat 2160

ggtttatcac aaaacctaga tattactaga aaagaagcgg cgacatttat cgagaattat 2220

ttaaatagct tcccaggtgt aaaaggatat atggatgata tcgttcaaga tgcgaaacaa 2280

acaggctacg ttacaacaat tttgaataga cgaagatatt tgcctgaaat aacaagttct 2340

aactttaatc tccgcagttt tgcagaacgt actgctatga atacaccaat tcaagggagt 2400

gcagccgata ttattaaaaa agcaatgatc gatatggcgg aaagattaat atcagaaaat 2460

atgcagacca aaatgctact acaagtacat gatgaattaa tttttgaggc tccaccagag 2520

gaaattgcaa tgctagaaaa aatagtgcca gaggtgatgg aaaacgctat taaactgatt 2580

gtacctttga aagtggatta tgcctttggt tcatcttggt atgacacgaa gtag 2634

<210> 5

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 包含从嗜冷芽孢杆菌分离的DNA聚合酶I的5'-3'外切核酸酶功能结构域的序列

<400> 5

Met Tyr Leu Ser Thr Glu Lys Ile Leu Leu Leu Asp Gly Asn Ser Leu

1 5 10 15

Ala Tyr Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu Thr Asn Glu His Gly

20 25 30

Ile His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Gln Lys Ile

35 40 45

Met Asp Glu Glu Asn Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly

50 55 60

Lys Thr Thr Phe Arg His Ser Thr Phe Gly Asp Tyr Lys Gly Gly Arg

65 70 75 80

Gln Lys Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Tyr Ile Arg Lys

85 90 95

Leu Ile Asp Ala Tyr Gly Ile Lys Arg Tyr Glu Leu Glu Met Tyr Glu

100 105 110

Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ser Lys Arg Ala Asp Glu Lys Gly

115 120 125

Gln Gln Val Val Ile Val Ser Gly Asp Lys Asp Leu Thr Gln Leu Ala

130 135 140

Thr Asp Lys Thr Thr Val Tyr Ile Thr Arg Lys Gly Ile Thr Asp Ile

145 150 155 160

Glu Lys Tyr Thr Pro Glu His Val Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro

165 170 175

Leu Gln Ile Ile Asp Met Lys Gly Leu Met Gly Asp Ala Ser Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu

195 200 205

Lys Glu His Gly Ser Val Glu Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Asp Thr Val

210 215 220

Ser Gly Val Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn Glu Glu Gln Ala

225 230 235 240

Ile Met Ser Lys Ala Leu Ala Thr Ile Glu Thr Ala Ala Pro Ile Gln

245 250 255

Ile Ser Ile Asp Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Pro Asn Met Glu Glu Val

260 265 270

Ile Glu Val Trp Lys Glu Leu Ala Phe Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser

275 280 285

Asp Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Glu Thr

290 295

<210> 6

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 截短的沙门氏嗜血杆菌的DNA聚合酶

<400> 6

Val Asp Arg Ser Lys Tyr Glu Thr Ile Phe Thr Lys Glu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Trp Leu Glu Lys Val Asn Asn Ala Glu Val Thr Ala Phe Asp Thr

20 25 30

Glu Thr Asp Ser Leu Asp Tyr Met Val Ala Asn Leu Ile Gly Leu Ser

35 40 45

Phe Ser Val Glu Glu Gly Glu Ala Ala Tyr Val Pro Val Ala His Asp

50 55 60

Tyr Leu Asp Ala Pro Glu Gln Leu Asp Arg Asp Trp Val Leu Ala Gln

65 70 75 80

Leu Lys Pro Tyr Leu Glu Asp Glu Thr Lys Ala Lys Val Gly Gln Asn

85 90 95

Leu Lys Tyr Asp Ala Ser Val Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Glu Met Lys

100 105 110

Gly Ile Lys Phe Asp Thr Met Leu Glu Ser Tyr Val Tyr Asn Ser Val

115 120 125

Ala Gly Lys His Asn Met Asp Ser Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Gln His

130 135 140

Asn Thr Ile Ser Phe Glu Glu Ile Ala Gly Lys Gly Lys Lys Gln Leu

145 150 155 160

Thr Phe Asn Gln Ile Ala Leu Glu Glu Ala Ala Pro Tyr Ala Ala Glu

165 170 175

Asp Ala Asp Ile Thr Leu Arg Leu His Asn Val Leu His Ala Lys Leu

180 185 190

Val Thr Asp Glu Lys Leu Asn Ala Val Phe Thr Asp Ile Glu Leu Pro

195 200 205

Leu Ile Ser Val Leu Ser Arg Met Glu Arg Lys Gly Val Tyr Ile Asp

210 215 220

Asp Met Leu Leu Ser Ala Gln Ser Leu Glu Ile Gly Gln Arg Leu Asp

225 230 235 240

Glu Leu Glu Thr Ala Ser Phe Glu Val Ala Gly Gln Glu Phe Asn Met

245 250 255

Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gln Thr Ile Leu Phe Glu Lys Met Glu Leu

260 265 270

Pro Val Ile Lys Lys Thr Pro Ser Gly Ala Ala Ser Thr Asn Glu Glu

275 280 285

Val Leu Gln Glu Leu Ala Leu Glu Tyr Glu Leu Pro Lys Leu Ile Leu

290 295 300

Glu Tyr Arg Gly Leu Ala Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Thr Asp Lys Leu

305 310 315 320

Pro Lys Met Ile Asn Pro Ser Thr Gly Arg Val His Thr Ser Tyr His

325 330 335

Gln Ala Val Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Asp Pro Asn Leu

340 345 350

Gln Asn Ile Pro Ile Arg Asn Lys Glu Gly Arg Arg Ile Arg Gln Ala

355 360 365

Phe Val Ala Pro His Gly Trp Lys Ile Leu Ala Val Asp Tyr Ser Gln

370 375 380

Ile Glu Leu Arg Ile Met Ala His Leu Ser Gln Asp Arg Ala Leu Leu

385 390 395 400

Glu Ala Phe Ser Ala Gly Lys Asp Ile His Ala Ala Thr Ala Ala Glu

405 410 415

Val Lys Gly Val Ser Ile Glu Glu Val Thr Ser Glu Asp Arg Arg Arg

420 425 430

Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly Met Ser Ala Phe Gly

435 440 445

Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gln Asp Tyr Met

450 455 460

Asn Val Tyr Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Val Met Gln Tyr Met Glu Glu

465 470 475 480

Thr Arg Leu Leu Ala Thr Glu Gln Gly Tyr Val Glu Thr Leu Tyr Gly

485 490 495

Arg Arg Leu Tyr Leu Pro Glu Ile Asn Ala Arg Asn Ala Ile Arg Arg

500 505 510

Lys Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ile Asn Ala Pro Met Gln Gly Thr Ala

515 520 525

Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Leu Val Asp Asn Trp Ile Glu

530 535 540

Ala Glu Gly Thr Gly Arg Val Asn Leu Leu Met Gln Val His Asp Glu

545 550 555 560

Leu Val Phe Glu Val Lys Glu Asp Glu Leu Glu Ala Ile Thr Lys Gln

565 570 575

Val Thr Ala Leu Met Glu Ala Ala Val Ser Leu Asp Val Pro Leu Ile

580 585 590

Ala Glu Ser Gly Phe Gly Asp Asn Trp Asp Glu Ala His

595 600 605

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 7

caccacagaa gtagcattcg agattgtt 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 8

ttacttcgtg tcataccaag atgaacc 27

<210> 9

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 分子信标模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> 用Dabcyl荧光团标记

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> 用FAM荧光团标记

<400> 9

ggcccgtagg aggaaaggac atcttctagc atacgggccg tcaagttcat ggccagtcaa 60

gtcgtcagaa atttcgcacc ac 82

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 10

gtggtgcgaa atttctgac 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 冷引物

<400> 11

tatccaccaa tactaccct 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 报告链

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> 在3'端用TAMRA荧光团标记

<400> 12

cgatactttg tccactcaat 20

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 模板链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 在5'端用BHQ2标记

<400> 13

attgagtgga caaagtatcg tagggtagta ttggtggata 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 模板链

<400> 14

attgagtgga gatagtatcg tagggtagta ttggtggata 40

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 在5'端用FAM荧光团标记

<400> 15

tatccaccaa tactaccct 19

<210> 16

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 模板

<400> 16

cacaccaaca cacacaacac caacaaccac acaacaccac cacaaccaac acacaacacc 60

gtgtgaattc ggcactggcc gtcgtatgct cttggttgta 100

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> FAM 在5'末端用FAM荧光团标记

<400> 17

tacaaccaag agcatacgac 20

Claims

1.一种分离的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，其中所述DNA聚合酶来源于嗜冷芽孢杆菌，其中所述DNA聚合酶不含5'-3'-外切核酸酶结构域，并且其中所述DNA聚合酶在20℃至35℃的温度范围内表现出其最大聚合酶活性的至少60％。

2.根据权利要求1所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含至多5个选自添加、取代、插入或缺失的氨基酸改变。

3.根据权利要求2所述的分离的DNA聚合酶，其中所述改变为取代。

4.根据权利要求3所述的分离的DNA聚合酶，其中所述取代为保守氨基酸取代。

5.根据权利要求1所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

6.一种分离的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述DNA聚合酶来源于嗜冷芽孢杆菌，其中所述DNA聚合酶不含5'-3'-外切核酸酶结构域，并且其中所述DNA聚合酶在20℃至35℃的温度范围内表现出其最大聚合酶活性的至少60％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶在pH 6.0至8.5的范围内具有约42℃-45℃的解链温度。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶具有比大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶和/或来自沙门氏嗜血杆菌(Aliivibrio Salmonicida)的DNA聚合酶更高的聚合酶活性，其中所述DNA聚合酶活性在约25℃下评估。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶具有比大肠杆菌Klenow片段DNA聚合酶，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶和/或来自沙门氏嗜血杆菌(Aliivibrio Salmonicida)的DNA聚合酶至少高出50％的链置换活性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶具有比枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DNA聚合酶更高的持续性。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的DNA聚合酶，其中在0mM至210mM NaCl的浓度范围内，所述DNA聚合酶表现出其最大聚合酶活性的至少30％。

12.一种组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶和缓冲液。

13.核酸分子，其是编码权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶的核苷酸序列。

14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述核酸分子是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者是与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

15.表达载体，其含有根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子以及用于由所述核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译的必要调节序列。

16.宿主细胞，其包含一种或多种根据权利要求15所述的表达载体或一种或多种根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子。

17.一种生产根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶的方法，包括以下步骤：

(i)在适于表达编码的DNA聚合酶的条件下，在生长培养基中培养包含一种或多种根据权利要求15所述的重组表达载体或一种或多种根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子的宿主细胞；且

(ii)从宿主细胞或从生长培养基或从宿主细胞或生长培养基获得的上清液中分离或获得所述DNA聚合酶。

18.根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶在制备用于核苷酸聚合的试剂中的用途。

19.根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶在制备用于核酸扩增或测序反应的试剂中的用途。

20.根据权利要求18所述的用途，其中所述DNA聚合酶在恒温下使用。

21.根据权利要求19所述的用途，其中所述DNA聚合酶在恒温下使用。

22.根据权利要求19所述的用途，其中所述反应是等温核酸扩增反应。

23.一种使用根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶进行核苷酸聚合的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供反应混合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够与模板核酸分子的一部分退火的寡核苷酸引物以及一种或多种核苷酸；且

(ii)在所述寡核苷酸引物与所述模板核酸分子退火并且所述DNA聚合酶通过聚合一个或多个核苷酸而延伸所述寡核苷酸引物的条件下温育所述反应混合物，其中所述反应温度为0℃至42℃；

其中所述方法不用于诊断或治疗目的。

24.一种使用根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供反应混合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够与模板核酸分子的一部分退火的寡核苷酸引物以及核酸；且

(ii)在所述寡核苷酸引物与所述模板核酸分子退火并且所述DNA聚合酶通过聚合一个或多个核苷酸而延伸所述寡核苷酸引物的条件下温育所述反应混合物以产生多核苷酸，其中所述反应温度为0℃至42℃；

其中所述方法不用于诊断或治疗目的。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述方法在恒温下进行。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述恒温为10℃至25℃。