KR20180132711A - 해양 dna 폴리머라제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사이크로바실러스 sp.로부터 DNA 폴리머라제에 기반된 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 본 발명은 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 제공하고, 상기 DNA 폴리머라제는 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 DNA 폴리머라제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편이 사용되는 뉴클레오타이드의 중합 방법 및 핵산의 증폭 방법을 제공한다.

Description

해양 DNA 폴리머라제
본 발명은 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사이크로바실러스 sp.로부터의 DNA 폴리머라제에 기반된 DNA 폴리머라제에 관한 것이다.
미생물 확인의 황금율은 여전히 원인균의 배양 및 후속적인 표현형 분화, 수행 및 분석하는데 며칠이 종종 걸리는 공정이 남아 있고, 이러한 지연은 감염성 질환의 이환율 및 사망률에서 주요 영향을 미칠 수 있다. 또한, 많은 유기체는 배양 배지에서 성장할 수 없고, 그러므로, 현존하는 배양 방법에 의해 미검출될 것이다. 많은 방식으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 분자 유전학 및 진단 분야를 혁신시켰다. PCR 기술에서 일꾼은 가닥 분리, 프라이머 어닐링 및 신장을 수득하기 위해 가열 및 냉각의 순환적 이벤트와 함께, 표적 DNA 서열의 증폭으로 이어지는 열안정성 고 충실도 DNA 폴리머라제이다. PCR 기술은 생물의학 및 생명 과학 연구 뿐만 아니라 분자 진단에서 현재 널리 이용된다.
현장 진단 (POC) 진단은 병원 셋팅 외부 환자의 공동체에서 질환 진단을 가능하게 하는 의료 도구 또는 디바이스로서 기재된다. 이상적 진단 시험은 "확실한" 기준을 충족시켜야 한다: 입수가능성, 감수성, 특이적, 사용자-친화적, 급속 및 강력, 설비-없음 그리고 그것을 필요로 하는 이들에게 전달됨. PCR 기술이 높은 잠재력을 가져도, 여전히 제한이 있고 설비를 운영하기 위한 숙련된 인원 그리고 반복된 가열 및 냉각 공정을 위하여 고 정확성 전기 동력 열 순환 설비의 사용을 요구한다. 어닐링 공정에서 가짜 프라이밍에 기인한 비-특이적 증폭은 문제있고, PCR은 또한 "미정제" 샘플에서 억제성 화합물이 되기 쉽다. 또한, PCR 디바이스의 큰 부피의 설계는 PCR을 POC 기술 플랫폼에 편입용 불완전 용액으로 만들고 PCR-기반 방법을 POC 진단에서 주요 기술 견인차로서 사용하기 어렵게 만든다.
최근, 비-PCR 기반 방법, 또는 등온 증폭 방법에서 증가된 집중이 부각되었다. 이들 방법에서, 핵산 증폭은 일정한 (중간 정도) 온도에서 발생하고 고 정확성 온도 순환 및 제어에 대하여 필요성이 없거나, 고온에서 안정적인 효소를 갖는다. 등온 증폭 방법은, 결과 및 더 쉬운 사용에 단시간을 허용하면서, PCR에 비교할만한 분석적 감수성 및 특이성 뿐만 아니라 억제성 화합물보다 더 높은 내성을 갖는 것으로 보고된다. 이들 특징은 등온 증폭 방법을 POC 분자 진단 플랫폼을 개발하는 것 그리고 "확실한" 기준을 충족시킴을 목적으로 하는 것에 아주 바람직하게 만든다. 수많은 방법은 지난 10년간 핵산 (양쪽 RNA 및 DNA)의 등온 증폭에 대하여 공개되어 왔다 (Gill, P. and A. Ghaemi (2008) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27(3): 224-243; Craw, P. and W. Balachandran (2012) Lab Chip 12(14): 2469-2486; de Paz, H. D. 등 (2014) Expert Rev Mol Diagn 14(7): 827-843; Yan, L. 등 (2014) Mol Biosyst 10(5): 970-1003에 의해 검토됨). 몇 개의 방법에서, 성공은 반응 배치에서 사용된 DNA 폴리머라제의 고유한 가닥 치환 활성에 의존한다. 용어 가닥 치환은 합성 동안 마주치는 다운스트림 DNA를 대체하기 위한 폴리머라제의 능력을 기재한다.
진단에 더하여 또한 다른 관심 영역은 DNA 폴리머라제에 의해 구동된 등온 증폭 기술로부터 이득을 본다. 이와 관련하여, 전체의 게놈 증폭 (다중 치환 증폭)은 특히 제한된 양의 DNA가 존재하는 경우 및/또는 단일 세포 접근법에서 게놈 연구에 중요하다. 또한 차세대 서열분석 접근법에서, 어느 한쪽 상업적으로 입수가능한 또는 개념증명 스테이지에서, 가닥-치환 폴리머라제는 Pacific Biosciences Single Molecule Real Time (SMRT) DNA 서열분석 기술 그리고 Ma 등에 의해 2013년에 공개된 차세대 서열분석 (Ma, Z. 등 Proc Natl Acad Sci U S A 110(35): 14320-14323)용 등온 증폭 방법에 의해 예시된 바와 같이 중요하다.
다양한 등온 기술에서 사용된 폴리머라제 효소의 현행 도구는, 그러나, 매우 제한된다. 전형적으로, 상이한 등온 방법은 반응에서 사용된 폴리머라제의 작업 범위에 의해 주로 결정되는 30-65℃ 사이 반응 온도를 요구한다.
E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제는, 예를 들어, 단지 상대적으로 좁은 온도 범위에서 폴리머라제 활성의 유용한 수준을 나타내고 저-내지-중간 정도 온도에서 (예를 들어 25℃에서) 상대적으로 저 활성을 갖는다. 당해 분야에서 필요한 것은 넓은 범위의 온도에서, 특히 저-내지-중간 정도 온도에서, 그러나 바람직하게는 또한 더 높은 온도에서 폴리머라제 활성 및 양호한 안정성의 유용한 수준을 나타내는 DNA 폴리머라제이다. 그와 같은 폴리머라제는, 실온에서 또는 실온에 가까운 온도를 포함하는, 넓은 범위의 온도에서 수행된 등온 증폭 반응에 유용할 것이다. 본 발명자들은 이들 기준을 놀랍게도 충족시키는 사이크로바실러스 sp.로부터 DNA 폴리머라제를 확인하였다. 사이크로바실러스 sp.는 차갑게 적응되고 그것의 DNA 폴리머라제 I은 저온에서 활성이다. 그러나, 다른 해양 DNA 폴리머라제와 달리, 사이크로바실러스 sp. DNA 폴리머라제 I은 20-25℃ 위에서 빠르게 불활성화되지 않고 따라서 넓은 범위의 온도에서 매우 유용한 DNA 폴리머라제를 나타낸다. 또한, 사이크로바실러스 sp. DNA 폴리머라제 I은 일반적으로 다른 해양 폴리머라제보다 훨씬 더 활성이다.
따라서, 제1 측면에서 본 발명은 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 제공하고, 상기 DNA 폴리머라제는 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호:1의 DNA 폴리머라제는 노르웨이 북쪽에서 분리된 해양 박테리아인, 사이크로바실러스 종 (또한 본 명세서에서 일명 PB 또는 Pb 또는 PbI)로부터 DNA 폴리머라제 I의 아미노산 서열에 기반된다. 그러나, 서열번호:1은 야생형 사이크로바실러스 종 DNA 폴리머라제 I 서열에서 존재하는 5'-3'-엑소뉴클레아제 도메인이 부족하다. 바람직한 구현예에서, 5'-3'-엑소뉴클레아제 도메인은 증폭 혼합물에서 프라이머 및/또는 생성물을 분해시킬 수 있음에 따라 5'-3'-엑소뉴클레아제 활성이 전형적으로 원치않기 때문에 DNA 폴리머라제 효소에 없다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 제공하고, 상기 DNA 폴리머라제는 서열번호:1의 아미노산 서열로 구성되거나 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 서열번호:1에 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예를 들어 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5%, 동일한 아미노산 서열을 포함한다 (또는 상기로 구성된다).
일부 구현예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 서열번호:1에 비교된 단일 또는 다중 아미노산 변경 (첨가, 치환, 삽입 또는 결실)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (또는 상기로 구성된다). 상기 서열은 바람직하게는 최대 5, 예를 들어 단지 1, 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 1, 2 또는 3, 더 바람직하게는 1 또는 2 변경된 아미노산을 함유할 수 있다. 치환은 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 될 수 있다. 바람직하게는 상기 변경은 보존적 아미노산 치환이다.
바람직하게는, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, DNA 폴리머라제는 서열번호:1의 아미노산 서열로 구성된다.
일 구현예에서, DNA 폴리머라제는 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 상기로 구성된다). 본 발명은 또한 서열번호:3의 변이체 및 단편을 제공한다. 본 명세서에서 기재된 서열번호:1의 변이체 및 단편의 유형은, 필요한 부분만 약간 수정하여, 서열번호:3의 변이체 및 단편에 적용한다.
본 발명의 DNA 폴리머라제의 효소 활성 단편은 또한 제공된다. 효소 활성 단편은 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단편이다. 효소 활성 단편은 길이가 적어도 400, 적어도 450, 적어도 475, 적어도 500, 적어도 525, 적어도 550, 적어도 560, 적어도 570 또는 적어도 575 아미노산일 수 있다. 바람직한 단편은 길이가 적어도 525, 적어도 550, 적어도 560, 적어도 570 또는 적어도 575 아미노산이다. 단편은 서열번호:1의 상응하는 부분에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95% (예를 들어 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5%), 또는 100% 동일하다.
임의의 주어진 DNA 폴리머라제에 대하여 일반적으로 최대 폴리머라제 활성이 관측되는 온도가 있다. 많은 DNA 폴리머라제에 대하여, 온도가 최대 활성이 관측되는 온도로부터 벗어나는 (예를 들어 감소하거나 증가하는) 경우, 보통의 온도 편차에서조차, 폴리머라제 활성에서 현저한 감소가 있어, 일반적으로 많은 폴리머라제가 상당히 좁은 온도 범위에서 수행된 적용에서 사용하기에만 적합한 것을 의미한다.
본 발명자들은, 유익하게는, 저 내지 보통의 온도를 포함하는 넓은 범위의 온도에서, 사이크로바실러스 종의 DNA 폴리머라제 I이 최대 폴리머라제 활성이 관측되는 온도에서 DNA 폴리머라제 활성에 비해 실질적인 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 것을 알아내었다. 환언하면, 본 발명자들은 많은 DNA 폴리머라제와 달리, 이러한 사이크로바실러스 종의 DNA 폴리머라제 I이 최대 활성이 관측되는 온도와 상당히 상이한 온도에서 그것의 최대 폴리머라제 활성의 유용한 분율을 나타내는 것을 알아내었다.
따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 실질적인 분율을 넓은 범위의 온도에 걸쳐 나타낸다.
바람직한 구현예에서, DNA 폴리머라제가 그것의 최대 활성을 나타내는 온도는 약 37℃ 내지 42℃, 바람직하게는 37℃-40℃ (예를 들어 37, 38, 39 또는 40℃)이다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 0℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 실질적인 분율을 나타낸다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 0℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 30%를 나타낸다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 10℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 40%를 나타낸다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 15℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 50%를 나타낸다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 20℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 60%를 나타낸다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 30℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 70% (바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90%)를 나타낸다.
일부 구현예에서, 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도에서 최대 약 10℃ (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 또는 10℃)만큼 벗어나는 (증가하거나 감소하는) 온도에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 30%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도에서 최대 약 5℃ (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5℃)만큼 벗어나는 (증가하거나 감소하는) 온도에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 60%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도보다 최대 약 35℃ 내지 40℃ 더 낮은 (예를 들어 40℃, 30℃, 20℃, 10℃, 또는 5℃ 더 낮은) 온도에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 30%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도보다 최대 약 12℃ 내지 15℃ 더 낮은 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 또는 15℃ 더 낮은) 온도에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 60%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도보다 최대 약 5℃ 내지 10℃ 더 낮은 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은) 온도에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 70% (바람직하게는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%)를 나타낸다.
DNA 폴리머라제 활성 분석을 위한 적합한 검정은 당해 기술에 공지되어 있다. 그와 같은 검정은 따라서 폴리머라제가 그것의 최대 활성을 나타내는 온도에서 나타나는 DNA 폴리머라제 활성에 비해 임의의 주어진 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 결정하는데 사용될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이 DNA 폴리머라제 활성은 단일-뉴클레오타이드 편입 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예시적인 단일-뉴클레오타이드 편입 검정에서, 그것의 5' 말단에서 형광단으로 표지되는, 19개의 뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머는 40 뉴클레오타이드로 구성되는 템플레이트 DNA 가닥에 어닐링되고; 반응 준비에서 존재하는 유일한 dNTP는 dATP이고 따라서 폴리머라제는 (템플레이트 가닥상에 상응하는 (상보적) 위치에서 하나의 T가 있음에 따라) 위치 20에서 하나의 뉴클레오타이드에 의해서만 5'-3' 방향으로 프라이머를 연장시킬 수 있고; 변성 폴리아크릴아미드 겔 (예를 들어 12 % 폴리아크릴아미드/7M 우레아)상의 후속적인 분석 및 형광단 표지된 올리고뉴클레오타이드에 대한 스캐닝은 19 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 아데닌에 의해 연장된 따라서 20 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머를 보여주고; 효소 활성 (즉 폴리머라제 활성)은 연장된 프라이머 (강도 1) 및 미연장된 프라이머 (강도 0)을 나타내는 밴드의 밀도계 측정에 의해 결정되고; 상대 편입 속도는 아래와 같이 계산된다: 편입 [%] = 강도 1/(강도 0 + 강도 1)*100.
따라서, DNA 폴리머라제 활성은 하기의 단계를 갖는 검정에서 평가될 수 있다: (i) 그것의 5' 말단에서 형광단으로 표지되는, 19개의 뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머를 제공하는 단계, (ii) 프라이머-템플레이트 복합체를 형성하기 위해 40 뉴클레오타이드로 구성되는 템플레이트 DNA 가닥에 상기 프라이머를 어닐링하는 단계, (iii) 프라이머의 3' 말단에 위치 20에서 프라이머 속으로 편입되는 유일한 dNTP (상기 dNTP는 어닐링된 템플레이트 DNA 가닥에서 관련된 뉴클레오타이드에 상보적이다)의 존재 하에 관련된 온도 (즉 조사중 온도)에서 DNA 폴리머라제와 상기 어닐링된 프라이머-템플레이트 복합체를 인큐베이팅하는 단계 및 (iv) 미연장된 프라이머 (19개의 뉴클레오타이드)와 비교된 연장된 프라이머 (20 뉴클레오타이드)의 양을 결정하는 단계 여기서 미연장된 프라이머에 비해 연장된 프라이머의 양은 폴리머라제 활성의 수준에 상응한다 (즉 연장된 프라이머의 더 높은 양은 더 높은 폴리머라제 활성을 나타낸다).
바람직한 프라이머 및 템플레이트 가닥은 실시예에서 기재된 바와 같다.
특히 바람직한 단일-뉴클레오타이드 편입 검정은 본 명세서에서 실시예 섹션에서 기재된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상대 DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 단일-뉴클레오타이드 편입 검정에 따라 평가된다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도, 그것의 정상 해양 환경보다 상당히 더 높은 온도를 포함하는, 넓은 범위의 온도에서, 본 사이크로바실러스 종의 DNA 폴리머라제 I이 많은 다른 DNA 폴리머라제와 비교하여, 특히 다른 해양 유기체 예컨대 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제와 비교하여 양호한 안정성 (온도 안정성)을 보여준다는 것을 알아내었다. 이러한 문맥에서, "안정적" DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제가 넓은 범위의 온도에 노출후 폴리머라제 활성의 실질적인 손실을 나타내지 않는 것을 의미한다. 대안적으로 보면, 양호한 "안정성"은 DNA 폴리머라제가 넓은 범위의 온도에 노출후 실질적인 폴리머라제 활성을 보유하는 (즉 실질적인 잔여 활성을 갖는) 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성 평가에 앞서 넓은 범위의 온도에서 인큐베이션 (전-인큐베이션)후 그것의 최대 폴리머라제 활성의 실질적인 분율을 보유한다. 이러한 문맥에서, 최대 폴리머라제 활성은 DNA 폴리머라제의 인큐베이션 (전-인큐베이션)이 DNA 폴리머라제 활성 검정의 개시에 앞서 얼음 (약 0℃)에서 실시되는 경우 관측된 폴리머라제 활성일 수 있다.
바람직하게는, 인큐베이션 (전-인큐베이션)은 약 15 분 동안이다 (15 분이 바람직하다). 바람직하게는, 인큐베이션 (전-인큐베이션)의 온도와 무관한, DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성 평가에 앞서 (예를 들어 약 5 분 동안) 상기 인큐베이션후 얼음에서 냉각된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성의 평가에 앞서 0℃ 내지 40℃ (예를 들어 0℃ 내지 15℃, 0℃ 내지 20℃, 또는 0℃ 내지 25℃, 또는 0℃ 내지 37℃)의 온도 범위에 걸쳐 임의의 온도에서 DNA 폴리머라제의 인큐베이션후 그것의 최대 활성의 적어도 40%를 나타낸다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다).
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성의 평가에 앞서 0℃ 내지 37℃ (예를 들어 0℃ 내지 15℃, 0℃ 내지 20℃, 또는 0℃ 내지 25℃, 0℃ 내지 30℃, 또는 0℃ 내지 35℃)의 온도 범위에 걸쳐 임의의 온도에서 DNA 폴리머라제의 인큐베이션후 그것의 최대 활성의 적어도 60% (바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%)를 나타낸다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다).
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성의 평가에 앞서 0℃ 내지 30℃ (예를 들어 0℃ 내지 15℃, 0℃ 내지 20℃, 또는 0℃ 내지 25℃)의 온도 범위에 걸쳐 임의의 온도에서 DNA 폴리머라제의 인큐베이션후 그것의 최대 활성의 적어도 70% (바람직하게는 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)를 나타낸다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다).
일부 구현예에서, DNA 폴리머라제 활성 검정 (예를 들어 단일-뉴클레오타이드 연장 반응)의 개시에 앞서 37℃에서 15 분 인큐베이션후, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성 검정의 개시에 앞서 15 분 인큐베이션이 얼음 (0℃)에서 실시된 경우 관측된 폴리머라제 활성의 적어도 60% (바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%)를 나타낸다, 즉 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80% "잔여" 활성이 있다.
일부 구현예에서, DNA 폴리머라제 활성 검정 (예를 들어 단일-뉴클레오타이드 연장 반응)의 개시에 앞서 30℃에서 15 분 인큐베이션후, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성 검정의 개시에 앞서 15 분 인큐베이션이 얼음 (0℃)에서 실시된 경우 관측된 폴리머라제 활성의 적어도 70% (바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90%, 또는 100%)를 나타낸다, 즉 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100% "잔여" 활성이 있다.
DNA 폴리머라제의 온도 안정성의 적합한 분석 실험은 당해 기술에 공지되어 있고 임의의 이들은 사용될 수 있다. DNA 폴리머라제 온도 안정성은 폴리머라제 활성을 결정하기 위한 검정 수행에 앞서 일정한 기간 (예를 들어 5 분 내지 25 분, 바람직하게는 약 15 분) 동안 시험 중 온도 (예를 들어 0℃ (예를 들어 얼음에서), 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃ 또는 45℃)에서 DNA 폴리머라제 인큐베이팅에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 안정성은 폴리머라제 활성을 결정하기 위한 검정 수행에 앞서 15 분 동안 시험 중 온도 (예를 들어 0℃ (예를 들어 얼음에서), 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃ 또는 45℃)에서 DNA 폴리머라제 인큐베이팅 및 후속적으로 (예를 들어 5 분 동안) 얼음에서 DNA 폴리머라제 냉각에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은, 바람직하게는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 단일-뉴클레오타이드 편입 검정을 이용하여 바람직하게는 평가될 수 있다. 특히 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 단일-뉴클레오타이드 편입 검정에 따라 평가된 바와 같다.
본 발명의 특히 바람직한 DNA 폴리머라제는 넓은 범위의 온도에 대해 양호한 안정성 및 또한 양호한 활성을 갖는다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 용융 온도 (T m ) 분석에 의해 평가된 바와 같이 넓은 pH 안정성 프로파일 (pH 6.0 내지 pH 8.5)를 갖는다. 본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 pH 범위 6.0 내지 8.5에서 약 42℃-45℃, 바람직하게는 약 43℃-44℃의 용융 온도를 갖는다. 용융 온도 (T m )는 써모플루오르 실험 (Ericsson 등, Anal. Biochem., 2006, 357, 289-298)에 의해 결정될 수 있다. 특히 바람직한 검정은 실시예 섹션에서 기재된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 일부 상업적으로 입수가능한 DNA 폴리머라제보다 더 높은 DNA 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 약 25℃의 온도 (25℃가 바람직하다)에서 일부 상업적으로 입수가능한 DNA 폴리머라제보다 더 높은 DNA 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다.
DNA 폴리머라제 활성 (특이 활성)은 임의의 적합한 검정을 이용하여 분석될 수 있고 숙련된 사람은 적합한 검정을 쉽게 선택할 수 있다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이 DNA 폴리머라제 활성은 등온 증폭 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이 DNA 폴리머라제 활성은 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예시적인 분자 비콘 검정에서, 분자 비콘 템플레이트는 GC-풍부 줄기 영역에 의해 연결되는 루프 영역을 포함하고; 분자 비콘 템플레이트는 가깝게 근접하고 따라서 켄칭되는 2개의 형광단을 갖고; 분자 비콘 템플레이트에 어닐링되는 프라이머의 DNA 폴리머라제 (DNA 폴리머라제 I)의 연장시 줄기는 개방되고 2개의 형광단 사이 거리에서 증가는 이전에 켄칭된 형광단의 형광의 회복에 의해 측정된다.
따라서, DNA 폴리머라제 활성은 하기의 단계를 갖는 검정에서 평가될 수 있다: (i) GC-풍부 줄기 영역에 의해 연결되는 루프 영역을 포함하는 그리고 서로에 대해서 그들의 가까운 근접 덕택에 켄칭되는 2개의 형광단을 포함하는 템플레이트 DNA 분자 (분자 비콘 템플레이트)를 제공하는 단계, (ii) 상기 템플레이트 DNA 분자에 프라이머를 어닐링하는 단계, (iii) (예를 들어 약 25℃, 바람직하게는 25℃에서) DNA 폴리머라제와 상기 템플레이트-프라이머를 인큐베이팅하는 단계 및 (iv) 이전에 켄칭된 형광단의 형광에서 회복을 측정하는 단계, 여기서 상기 형광은 DNA 폴리머라제 활성을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃ (25℃가 바람직하다)에서 수행되는 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다.
바람직한 분자 비콘 템플레이트 및 프라이머는 실시예에서 기재된 바와 같다.
바람직한 DNA 폴리머라제 활성 검정은, 등온 분자 비콘 검정인, 본 명세서에서 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정이다. 따라서, 바람직한 구현예에서 DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된 바와 같다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제 (또한 본 명세서에서 일명 KF), 지오바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (또한 본 명세서에서 일명 Bst) 및/또는 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 Bst2.0의 상업적으로 입수가능한 변이체보다 더 높은 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100% 또는 적어도 150% 더 높은 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500% 또는 적어도 1000% 더 높은 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (Bst2.0)의 상업적으로 입수가능한 변이체보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 더 높은 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는, 특히 약 25℃의 온도 (25℃가 바람직하다)에서 다른 해양 폴리머라제 (예를 들어 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제)와 비교된 더 높은 DNA 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 더 높은 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). DNA 폴리머라제 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 등온 분자 비콘 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, DNA 폴리머라제 활성은 실시예 섹션에서 기재된 폴리머라제 활성 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 본 명세서에서 기재된 DNA 폴리머라제 활성 검정에 따라 25℃에서 분석된 경우, 바람직하게는 본 명세서에서 실시예 섹션에서 기재된 DNA 폴리머라제 활성 검정에 따라 분석된 경우 적어도 200,000 mRFU/min/μg, 적어도 250,000 mRFU/min/μg 또는 적어도 300,000 mRFU/min/μg의 DNA 폴리머라제 활성 (특이 활성)을 갖는다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 이것은 많은 등온 증폭 방법에서 반응 배치에서 사용된 DNA 폴리머라제의 고유한 가닥 치환 활성에서 성공이 의존함에 따라 중요한 특성이다. 용어 "가닥 치환"는 합성 동안 마주치는 다운스트림 DNA를 치환시키는 폴리머라제의 능력을 기재한다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 약 25℃의 온도 (25℃가 바람직하다)에서 다른 상업적으로 입수가능한 DNA 폴리머라제보다 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다.
DNA 폴리머라제의 가닥 치환 활성을 평가하기 위한 적합한 검정은 당해 기술에 공지되어 있고 숙련된 사람은 적합한 검정을 쉽게 선택할 수 있다. 예시적인 가닥 치환 활성 검정에서, "차가운" 프라이머 및 그것의 3' 말단에서 형광단 (예를 들어 TAMRA)로 표지되는 리포터 가닥은 그것의 5' 말단에서 켄쳐 (예를 들어 BHQ2)를 갖는 템플레이트 가닥에 어닐링되어 (형광단은 따라서 켄쳐에 가깝게 근접하여 켄칭된다) 이로써 어닐링된 프라이머의 3' 말단과 어닐링된 리포터 가닥의 5' 말단 사이 하나의 뉴클레오타이드 갭이 있고; DNA 폴리머라제의 가닥 치환 활성시 형광단 표지된 올리고뉴클레오타이드 (리포터 가닥)은 템플레이트 가닥으로부터 치환되고 그 결과 형광단 및 켄쳐는 더 이상 가깝게 근접하지 않고 형광에서 증가는 측정될 수 있다.
가닥 치환 활성은 하기의 단계를 갖는 검정에서 평가될 수 있다: (i) 그것의 5' 말단에서 켄쳐 (형광 켄쳐)를 갖는 템플레이트 DNA 분자를 제공하는 단계, (ii) 상기 템플레이트 DNA 분자에 차가운 프라이머 (즉 비-형광 올리고뉴클레오타이드) 및 그것의 3' 말단에서 형광단으로 표지되는 리포터 가닥 (리포터 올리고뉴클레오타이드)를 어닐링하는 단계 여기서 어닐링된 프라이머의 3' 말단과 어닐링된 리포터 가닥의 5' 말단 사이 하나의 뉴클레오타이드 갭이 있고, 이로써 켄쳐는 서로에 대해서 그것의 가까운 근접 덕택에 형광단을 켄칭함, (iii) (예를 들어 약 25℃, 바람직하게는 25℃에서) DNA 폴리머라제와 상기 템플레이트-차가운 프라이머-리포터 가닥 복합체를 인큐베이팅하는 단계 및 (iv) 이전에 켄칭된 형광단의 형광을 측정하는 단계, 여기서 상기 형광은 가닥 치환 활성을 나타냄.
바람직한 구현예에서, 가닥 치환은 25℃에서 수행되는 검정에서 평가된다.
바람직한 프라이머, 리포터 가닥 및 템플레이트 가닥은 실시예에서 기재된 바와 같다.
바람직한 구현예에서 가닥 치환 활성은 실시예 섹션에서 기재된 가닥 치환 활성 검정에 따라 평가된 바와 같다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000% 또는 적어도 2000% 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). 가닥 치환 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 가닥 치환 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 실시예 섹션에서 기재된 가닥 치환 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500, 적어도 600% 또는 적어도 700% 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). 가닥 치환 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 가닥 치환 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 실시예 섹션에서 기재된 가닥 치환 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (Bst2.0)의 상업적으로 입수가능한 변이체보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 400% 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). 가닥 치환 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 가닥 치환 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 실시예 섹션에서 기재된 가닥 치환 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 다른 해양 폴리머라제 (예를 들어 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제)와 비교된 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 약 25℃의 온도 (25℃가 바람직하다)에서 다른 해양 DNA 폴리머라제보다 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 500% 더 높은 가닥 치환을 갖는다. 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 약 25℃에서 평가된 바와 같다 (25℃가 바람직하다). 가닥 치환 활성은 (예를 들어 25℃에서 수행된) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 가닥 치환 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 더 바람직하게는, 가닥 치환 활성은 실시예 섹션에서 기재된 가닥 치환 검정에 따라 평가된다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 본 명세서에서 기재된 가닥 치환 활성 검정에 따라, 바람직하게는 본 명세서에서 실시예 섹션에서 가닥 치환 활성 검정에 따라 25℃에서 분석된 경우 적어도 20,000 mRFU/min/μg, 적어도 25,000 mRFU/min/μg 또는 적어도 30,000 mRFU/min/μg의 가닥 치환 활성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 DNA 폴리머라제는 높은 진행성을 갖는다. DNA 폴리머라제의 문맥에서 "진행성"은 해리전 합성 (뉴클레오타이드 편입) 동안 DNA 템플레이트 가닥에 결합된 채 유지하는 DNA 폴리머라제의 능력이고, DNA 합성의 전반적인 효율은 주어진 폴리머라제의 증가하는 진행성과 함께 따라서 증가할 수 있다. 환언하면, 진행성은, 템플레이트 가닥과 회합 이벤트에 따라, DNA 폴리머라제에 의해 첨가된 뉴클레오타이드의 평균 수의 측정을 나타낸다. 높은 진행성을 가진 DNA 폴리머라제는 DNA의 더 긴 스트레치가 합성될 필요가 있다면 특별히 중요할 수 있다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 상업적 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (BstpolI, Bst2.0) 및 바실러스 서브틸리스 DNA 폴리머라제 (또한 본 명세서에서 일명 BSU)보다 더 높은 진행성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 더 높은 진행성은 상당히 더 높다. 일부 바람직한 구현예에서 본 발명의 DNA 폴리머라제는 상업적 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (BstpolI, Bst2.0) 및/또는 B.서브틸리스 DNA 폴리머라제 (또한 본 명세서에서 일명 BSU)보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 1500% 또는 적어도 2000% 더 높은 진행성을 갖는다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 상업적 G. 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 (BstpolI, Bst2.0)보다 적어도 5000%, 적어도 10,000%, 적어도 15,000%, 적어도 20,000%, 적어도 25,000% 또는 적어도 30,000% 더 높은 진행성을 갖는다.
본 발명의 일부 DNA 폴리머라제는 B.서브틸리스 DNA 폴리머라제 (또한 본 명세서에서 일명 BSU)보다 적어도 1000%, 적어도 1500% 또는 적어도 2000% 더 높은 진행성을 갖는다.
진행성 분석을 위한 적합한 검정은 당해 기술에 공지되어 있다. 적합한 및 특히 바람직한 진행성 검정은 실시예 섹션에서 본 명세서에서 기재된다.
본 발명의 바람직한 DNA 폴리머라제는 염 (NaCl) 농도의 범위에 걸쳐 폴리머라제 활성의 유용한 수준을 갖는다. 환언하면, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 최대 폴리머라제 활성이 관측되는 염 농도에서 관측된 DNA 폴리머라제 활성의 실질적인 분율을 넓은 범위의 염 농도에 걸쳐 나타낸다. DNA 폴리머라제 활성 결정을 위한 적합한 검정은 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다. DNA 폴리머라제 활성 결정을 위한 바람직한 검정은 예를 들어 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 바람직하게는 실시예 섹션에서 기재된 바와 같이 등온 분자 비콘 검정이다.
일부 구현예에서, DNA 폴리머라제가 그것의 최대 활성을 나타내는 NaCl 농도는 약 65mM 내지 100mM (예를 들어 70, 75, 80, 85 또는 90mM)이다.
일부 구현예에서, 농도 범위 약 0mM 내지 210mM NaCl에 걸쳐, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 실질적인 분율 (예를 들어 적어도 30%)를 나타낸다.
일부 구현예에서, 농도 범위 약 20mM 내지 150mM NaCl에 걸쳐, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 60%를 나타낸다.
일부 구현예에서, 농도 범위 약 60mM 내지 120mM NaCl에 걸쳐, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 80% (바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95%)를 나타낸다.
바람직하게는, 상기에 기재된 능력 및 특성은, 적절한 대조군 수준에 비교된 경우, 측정가능한 또는 상당한 수준에서 그리고 더 바람직하게는 통계적으로 상당한 수준에서 관측된다. 적절한 유의 수준은 본 명세서에서 다른 곳에 논의된다. 더 바람직하게는, 상기에 기재된 능력 및 특성중 하나 이상은, 선행기술 DNA 폴리머라제에 대하여 관측된 능력에 비교된 경우, 측정가능하게 더 나은, 또는 더 바람직하게는 상당히 더 나은 수준에서 관측된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 또는 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 단리된 DNA 폴리머라제를 제공하고, 여기서 상기 DNA 폴리머라제는 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인이 부족하다 (예를 들어 서열번호:5의 아미노산 서열의 일부 또는 전부가 부족하다). 본 발명의 다른 측면의 다른 특징 및 특성은, 필요한 부분만 약간 수정하여, 본 발명의 이러한 측면에 적용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 또는 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 단리된 DNA 폴리머라제를 제공하고, 여기서 상기 DNA 폴리머라제는 사이크로바실러스 sp.로부터 야생형 DNA 폴리머라제가 아니다. 본 발명의 다른 측면의 다른 특징 및 특성은, 필요한 부분만 약간 수정하여, 본 발명의 이러한 측면에 적용한다.
추가 측면에서 본 발명은 본 발명의 DNA 폴리머라제를 포함하는 분자 (예를 들어 단백질)을 제공한다.
전체 본원 내내 사용된 바와 같이, 용어들 "한" 및 "하나"는, 상한 또는 제외가 그 후에 구체적으로 언급되는 사례를 제외하고, 이들이 "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상의" 또는 "복수"의 언급된 성분 또는 단계를 의미한다는 측면에서 사용된다. 임의의 단일 제제의 양과 같이, 조합의 작동가능한 한계 및 파라미터는 본 개시내용에 비추어 당해 분야의 숙련가에 공지될 것이다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이 본 발명의 DNA 폴리머라제 또는 이의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 거기에 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 본 발명의 더욱 추가 측면을 형성한다. 바람직한 핵산 분자는 서열번호:1의 사이크로바실러스 종 DNA 폴리머라제 I 서열, 또는 거기에 실질적으로 상동성인 서열을 인코딩하는 핵산이다. 바람직한 핵산 분자는 서열번호:2에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 (또는 상기로 구성되거나), 거기에 실질적으로 상동성인 서열이다. 선택적으로, 서열번호:2의 최종 3 뉴클레오타이드는 생략될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 서열번호:2에 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 및 더욱더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%, 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 따라서 서열번호:2의 서열에 단일 또는 다중 염기 변경 (첨가, 치환, 삽입 또는 결실)을 포함한다.
특히 바람직한 핵산 분자는 서열번호:2에서 제시된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 핵산 분자는 서열번호:2에서 제시된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 핵산 분자의 축퇴 버전, 예를 들어 서열번호:2를 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 핵산 분자의 축퇴 버전인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 (또는 상기로 구성되는) 핵산 분자로 연장한다.
본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 "단리된" 또는 "정제된"다.
상동성 (예를 들어 서열 동일성)은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열 사이 상동성 (예를 들어 동일성)의 정도를 결정하기 위하여, 서열의 다중 정렬을 만드는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Clustal W (Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680, 1994)는 유용하다. 요망하는 경우, Clustal W 알고리즘은 BLOSUM 62 평점 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992) 및 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 연장 패널티와 함께 사용될 수 있어서, 이로써 최고차 매치는 서열 중 하나의 총 길이의 적어도 50%가 정렬에서 관여되는 2 서열 사이 수득된다. 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 Smith 및 Waterman (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981)에 의해 개정된 대로 Needleman 및 Wunsch의 정렬 방법 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970)이어서 이로써 최고차 매치는 2 서열 사이 수득되고 동일한 아미노산의 수는 2 서열 사이 결정된다. 2 아미노산 서열 사이 백분율 동일성을 계산하기 위한 다른 방법은 일반적으로 기술 인식되고, 예를 들어, Carillo 및 Lipton에 의해 기재된 것 (Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073, 1988) 그리고 Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects에서 기재된 것을 포함한다.
일반적으로, 컴퓨터 프로그램은 그와 같은 계산에 이용될 것이다. ALIGN (Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) 및 갭핑된 BLAST (Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), BLASTP, BLASTN, 또는 GCG (Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12:387, 1984) 같은, 서열의 쌍을 비교 및 정렬하는 프로그램은 이러한 목적을 위해 또한 유용하다. 게다가, 유럽 생물정보학 기관에서 Dali 서버는 단백질 서열의 구조-기반 정렬을 제공한다 (Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20:478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233:123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26:316-9, 1998).
참조점 제공의 방식으로, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 본 발명에 따른 서열, 서열 동일성 등은 (예를 들어 GENESTREAM 네트워크 서버, IGH, Montpellier, France에서 인터넷으로 이용가능한) 디폴트 파라미터를 가진 ALIGN 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에서 정의되어 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라제는 유전자적으로 인코딩된 아미노산을 포함하지만, 또한, 하나 이상의 비-유전자적으로 인코딩된 아미노산을 함유할 수 있다.
DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것에 더하여, 본 명세서에서 기재된 본 발명의 DNA 폴리머라제의 변이체 또는 효소 활성 단편은 바람직하게는 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 다른 특성, 더 바람직하게는 본 명세서에서 기재된 모든 다른 특성을 갖는다.
핵산 분자 또는 서열 및 단백질 또는 폴리펩타이드, 예를 들어, DNA 폴리머라제에 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 그것의 천연 환경으로부터 단리된, 정제된, 또는 실질적으로 없는, 예를 들어, (사실상 이들이 자연적으로 발생하면) 유기체로부터 단리된 또는 정제된 경우 그와 같은 분자를 지칭하거나, 기술 공정에 의해 생산된 경우 그와 같은 분자를 지칭한다, 즉, 재조합 및 합성으로 생산된 분자를 포함한다.
따라서, 단백질 또는 폴리펩타이드 분자 예컨대 DNA 폴리머라제에 관련하여 사용될 때, 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 전형적으로 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질 또는 유래되는 공급원으로부터 다른 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 그와 같은 단리된 또는 정제된 단백질은 재조합 기술에 의해 생산된 경우 배양 배지가, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.
벡터가 사용된 숙주세포와 양립가능한 한, 가능한 발현 벡터는 비제한적으로 코스미드 또는 플라스미드를 포함한다. 발현 벡터는, 핵산 분자에 작동가능하게 연결되는, 발현용으로 사용되는 숙주세포를 기준으로 선택된 조절 서열 및 본 발명의 핵산 분자를 발현 벡터가 함유하는 것을 의미하는, "숙주세포의 형질전환에 적합"하다. 작동가능하게 연결된은 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 핵산이 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.
일 측면에서 본 발명은 따라서 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터 (바람직하게는 재조합 발현 벡터), 또는 이의 단편, 그리고 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질 서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 제공한다.
적합한 조절 서열은, 박테리아, 진균, 바이러스성, 포유동물, 또는 곤충 유전자를 포함하는, 다양한 공급원에서 유래될 수 있고 당해 기술에 공지되어 있다. 적절한 조절 서열의 선택은 아래에 논의된 바와 같이 선택된 숙주세포에 의존적이고, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 그와 같은 조절 서열의 예는 하기를 포함한다: 번역 개시 신호를 포함하는, 리보솜 결합 서열, RNA 폴리머라제 결합 서열 또는 전사 프로모터 및 인핸서. 추가로, 선택된 숙주세포 및 이용된 벡터에 의존하여, 다른 서열, 예컨대 복제의 기원, 추가의 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사의 서열 부여 유도가능성은 발현 벡터에 편입될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 또한 본 발명의 재조합 분자로 형질전환된 또는 형질감염된 숙주세포의 선택을 용이하게 하는 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 재조합 단백질의 증가된 발현을 제공하는 융합 모이어티를 인코딩하는 유전자; 재조합 단백질의 증가된 용해도; 및 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 상기 표적 재조합 단백질의 정제에서 도움 (예를 들어 존재할 수 있는 정제 및/또는 확인을 가능하게 하기 위한 적절한 "태그", 예를 들어, His 태그 또는 myc 태그)를 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 재조합 단백질의 증가된 발현; 재조합 단백질의 증가된 용해도를 제공하는 융합 모이어티를 인코딩하고; 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 상기 표적 재조합 단백질의 정제에서 돕는 (예를 들어 존재할 수 있는 정제 및/또는 확인을 가능하게 하기 위한 적절한 "태그", 예를 들어, His 태그 또는 myc 태그) 유전자도 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 생산하기 위해 숙주세포에 도입될 수 있다. 용어들 "으로 형질전환된", "으로 형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"은 당해 분야에서 공지된 많은 가능한 기술 중 하나에 의해 세포 속에 핵산 (예를 들어, 벡터)의 도입을 포함하도록 의도된다. 숙주세포의 형질전환 및 형질감염에 적합한 방법은 Sambrook 등, 1989 (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 및 다른 실험실 교과서에서 발견될 수 있다.
적합한 숙주세포는 다양한 원핵 숙주세포 및 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 박테리아 숙주 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이에서 발현될 수 있다.
DNA 폴리머라제를 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질 그리고 다른 분자, 예컨대 단백질 (예를 들어 에피토프 태그)에 접합된 본 발명의 단백질은 재조합 기술을 통한 융합에 의해 제조될 수 있다.
더욱 추가 측면은 본 발명의 하나 이상의 발현 작제물 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포 또는 바이러스를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 숙주세포 또는 바이러스가 또한 제공된다. 본 발명의 DNA 폴리머라제를 발현시킬 수 있는 숙주세포 또는 바이러스는 더욱 추가 측면을 형성한다. 바람직한 숙주세포는 Rosetta 2 (DE3) 세포 (Novagen)을 포함한다.
적절한 경우, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 천연 공급원으로부터 단리, 예를 들어 사이크로바실러스의 추출물로부터 단리될 수 있거나, 숙주세포에서 재조합으로 생산될 수 있고 거기로부터 단리 및 정제될 수 있다. 본 발명의 DNA 폴리머라제는 따라서 재조합 효소, 특히 단리된 재조합 효소일 수 있다. 특정 구현예에서 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제가 자연적으로 발견되는 것과 동일한 유기체가 아니거나, 상기 출신이 아닌 숙주세포, 즉 이종성 숙주세포에서 재조합 기술에 의해 생산된다.
본 발명의 DNA 폴리머라제는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 무세포 발현 시스템은 DNA 폴리머라제의 생산을 위하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제가 단계적인 신장, 한번에 하나의 아미노산에 의해 생성되도록 화학 합성을 이용하여 생성될 수 있다. 그와 같은 화학 합성 기술 (예를 들어 고상 합성)은 단백질의 화학에서 잘 알려진다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 숙주세포의 배양 단계를 포함하는 본 발명의 DNA 폴리머라제의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 하기의 단계를 포함한다: (i) 인코딩된 DNA 폴리머라제 또는 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자 또는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 (ii) 숙주세포로부터 또는 성장 배지/상청액으로부터 DNA 폴리머라제 또는 단백질을 단리 또는 수득하는 단계. 그와 같은 생산 방법은 또한 적어도 하나의 추가의 성분, 예컨대 허용가능한 완충액 또는 담체를 포함하는 조성물 속에 DNA 폴리머라제 또는 생성물의 제형화 및/또는 DNA 폴리머라제 또는 단백질 생성물의 정제 단계를 포함할 수 있다.
DNA 폴리머라제는 당해 분야에서 공지된 및 문헌에서 널리 기재된 단백질용 임의의 정제 기술 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 숙주세포/배양 배지로부터 분리, 또는 단리될 수 있다. 그와 같은 기술은 예를 들어, 침전, 한외여과, 투석, 다양한 크로마토그래피 기술, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 포함할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 아미노산 모티프 또는 다른 단백질 또는 비-단백질 태그, 예를 들어 폴리히스티딘 태그 (예를 들어 His6-태그)를 운반하기 위해 변형될 수 있어서, 단리, 가용화 및/또는 정제 또는 확인을 돕는다.
본 발명의 DNA 폴리머라제의 바람직한 생산 방법은 본 명세서에서 실시예 섹션에서 기재된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 뉴클레오타이드 (예를 들어 dNTP) 중합을 위한 본 발명의 DNA 폴리머라제의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 핵산 (DNA) 가닥을 연장하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 (DNA) 증폭 또는 서열분석 반응에서 본 발명의 DNA 폴리머라제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 분자 비콘 검정에서, 또는 가닥 치환 검정에서 또는 단일-뉴클레오타이드 편입 검정에서 본 발명의 DNA 폴리머라제의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 용도 및 방법에서, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 일정한 온도에서, 즉 열 순환 없이 사용된다. 따라서, 본 발명의 DNA 폴리머라제의 용도는 특히 바람직하다. 등온 증폭 반응에서 본 발명의 DNA 폴리머라제의 용도는 특히 바람직하다. 등온 반응은 일정한 온도에서 수행된다. 많은 등온 증폭 기술은 당해 기술에 공지되어 있고 루프 매개된 등온 증폭 (LAMP), 회전환 증폭 (RCA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 다중 치환 증폭 (MDA) 및 교차 프라이밍 증폭 (CPA)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 폴리머라제를 사용하는 뉴클레오타이드의 중합 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 본 발명의 DNA 폴리머라제, 템플레이트 핵산 분자, 템플레이트 핵산 분자의 부분 및 뉴클레오타이드 (예를 들어 데옥시뉴클레오사이드 삼인산, dNTPS)의 하나 이상의 종에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 템플레이트 핵산 분자에 어닐링하고 상기 DNA 폴리머라제가 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시키는 바의 조건 하에 상기 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 적당한 조건은 당해 기술에 공지되어 있다. 바람직하게는 일정한 온도는 사용되고 바람직한 온도는 본 명세서에서 다른 곳에 설명된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 생성물의 생성은 (예를 들어 겔 전기영동을 통해) 검출된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명DNA 폴리머라제를 이용하는 핵산 (DNA)의 증폭 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 방법은 본 발명의 DNA 폴리머라제, 템플레이트 핵산 분자, 템플레이트 핵산 분자 산 분자의 부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들) (예를 들어 2 이상 프라이머 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6 프라이머), 및 뉴클레오타이드 (예를 들어 데옥시뉴클레오사이드 삼인산, dNTPS)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)이 템플레이트 핵산 분자에 어닐링하고 상기 DNA 폴리머라제가 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)을 연장시키는 바의 조건 하에 상기 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 적당한 조건은 당해 기술에 공지되어 있다. 바람직한 핵산의 증폭 방법은 등온 증폭 방법이다. 본 발명의 등온 증폭 방법은 일정한 온도에서 수행되고 바람직한 온도는 본 명세서에서 다른 곳에 설명된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 생성물의 생성은 (예를 들어 겔 전기영동을 통해) 검출된다.
예시적인 등온 증폭 방법은 루프 매개된 등온 증폭 (LAMP), 회전환 증폭 (RCA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 다중 치환 증폭 (MDA) 및 교차 프라이밍 증폭 (CPA)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법 및 용도에서 사용된 일정한 온도는 저-내지-중간 정도 온도, 예를 들어, 0℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 40℃, 또는 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 약 25℃ 내지 약 40℃, 또는 약 30℃ 내지 약 40℃ 또는 약 35℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃ 내지 약 40℃이다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 15℃이거나 약 10℃ 내지 약 20℃이다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 30℃이다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃이다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 25℃이다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 약 25℃의 일정한 온도가 바람직하다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 25℃이다.
온도는 반응 동안 온도를 변형시키기 위해 활성 단계가 사용되지 않는, 예를 들어 무 열 순환 경우 일정한 것으로 간주될 수 있다. '일정한' 온도는 여전히 최대 약 5℃, 전형적으로 3℃ 또는 2℃ 이하의 방법 동안 온도 변동을 허용할 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라제는 현장 진단 분자 진단 플랫폼에서 사용될 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라제는 전체의 게놈 증폭에서 사용될 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라제는 차세대 서열분석 방법에서 사용될 수 있다. ("제1 세대" 접근법으로서 생거 디데옥시뉴클레오타이드 방법에 관련하여) 소위 "차세대" 또는 "제2 세대" 서열분석 접근법은 널리 퍼졌다. 이들 신 기술은, 예를 들어 평행한, 예를 들어 대규모 병렬 서열분석 반응의 사용의 결과로서, 또는 덜 시간이 걸리는 단계를 통해 고처리량을 특징으로 한다. 다양한 고처리량 서열분석 방법은 단일 분자 서열분석을 제공하고 기술 예컨대 파이로서열분석, 가역적 종결자 서열분석, 결찰에 의한 절단가능 탐침 서열분석, 결찰에 의한 비-절단가능 탐침 서열분석, DNA 나노볼, 및 실시간 단일 분자 서열분석을 이용한다.
본 발명의 DNA 폴리머라제의 효소 활성 단편을 이용하는 용도 및 방법은 또한 제공되고 본 발명의 DNA 폴리머라제 참조는 본 명세서에서 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 그와 같은 활성 단편을 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법은 전형적으로 시험관내 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 폴리머라제를 포함하는 조성물을 제공한다. 그와 같은 조성물은 바람직하게는 완충액을 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 추가로 핵산 증폭 반응 (예를 들어 등온 증폭 반응)을 실행하기 위해 필요한 시약, 예를 들어 증폭되도록 템플레이트 DNA의 영역에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 뉴클레오타이드 (예를 들어 dNTPs) 중 하나 이상을 포함한다. 전형적으로 조성물은 수성일 것이고 표준 완충액 예컨대 트리스, HEPES, 등으로 완충될 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 DNA 폴리머라제, 또는 본 발명의 하나 이상의 조성물, 또는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자, 또는 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터, 또는 본 발명의 하나 이상의 숙주세포 또는 바이러스를 포함하는 키트를 포함한다. 바람직하게는 상기 키트는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 방법 및 용도에서, 예를 들어, 핵산 증폭 방법, 예컨대 등온 증폭 반응에서 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 상기 키트는 키트 구성요소의 사용 지침, 예를 들어 핵산 증폭용 지침을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 그리고 그것의 서열 식별자 (서열번호)
모든 뉴클레오타이드 서열은 이 기술 분야에서 관습에 따라 본 명세서에서 5'에서 3'로 인용된다.
서열번호:1 - 사이크로바실러스 sp.로부터 단리된 절단된 DNA 폴리머라제 I의 아미노산 서열.
서열번호 :1
TEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTK
서열번호:2 - 서열번호:1의 사이크로바실러스 종 DNA 폴리머라제 I 서열을 인코딩하는 핵산 서열.
서열번호 :2
acagaagtagcattcgagattgttgaagaaattgactctacaatattagataaagtaatgtcagtccat
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서열번호:3 - 사이크로바실러스 sp.로부터 단리된 전장 DNA 폴리머라제 I의 아미노산 서열.
서열번호 :3
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서열번호:4 - 서열번호:3의 사이크로바실러스 sp. DNA 폴리머라제 I 서열의 핵산 서열.
서열번호 :4
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서열번호:5 - 사이크로바실러스 sp.로부터 단리된 DNA 폴리머라제 I의 5'-3' 엑소뉴클레아제 기능성 도메인을 함유하는 서열.
서열번호 :5
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서열번호:6 - 본 명세서에서 기재된 실험에서 사용된 알리비브리오 살모니시다의 절단된 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열.
서열번호 :6
VDRSKYETIFTKEAFSAWLEKVNNAEVTAFDTETDSLDYMVANLIGLSFSVEEGEAAYVP
VAHDYLDAPEQLDRDWVLAQLKPYLEDETKAKVGQNLKYDASVLARYDIEMKGIKFDTML
ESYVYNSVAGKHNMDSLALRYLQHNTISFEEIAGKGKKQLTFNQIALEEAAPYAAEDADI
TLRLHNVLHAKLVTDEKLNAVFTDIELPLISVLSRMERKGVYIDDMLLSAQSLEIGQRLD
ELETASFEVAGQEFNMNSPKQLQTILFEKMELPVIKKTPSGAASTNEEVLQELALEYELP
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SIEEVTSEDRRRAKAINFGLIYGMSAFGLAKQIGISRGEAQDYMNVYFERYPGVMQYMEE
TRLLATEQGYVETLYGRRLYLPEINARNAIRRKAAERAAINAPMQGTAADIIKKAMILVD
NWIEAEGTGRVNLLMQVHDELVFEVKEDELEAITKQVTALMEAAVSLDVPLIAESGFGDN
WDEAH
PB DNA 폴리머라제와 비교를 위하여 사용된 상업적 효소, 즉 KF, Bst, Bst2.0, BSU, T4 및 T7 DNA 폴리머라제 모두는 New England Biolabs로부터 구입되었다.
본 발명은 하기 도와 관련하여 비-제한적인 예로써 이제 기재될 것이다:
도 1은 다른 폴리머라제와 사이크로바실러스 sp. (PB)로부터 재조합으로 생산된 해양 폴리머라제의 25 ℃에서 폴리머라제 활성 (특이 활성)의 비교를 도시한다. 상업적으로 공지된 폴리머라제는 KF (클레노우 단편 E. 콜리), Bst (G. 스테아로써모필루스), Bst 2.0 (G. 스테아로써모필루스) 및 BSU (B. 서브틸리스)이다.
도 2 는 가닥-치환 활성 검정 셋업의 개요를 도시한다. F= 형광단. Q= 켄쳐.
도 3 은 다른 폴리머라제와 사이크로바실러스 sp. (PB)로부터 재조합으로 생산된 해양 폴리머라제의 25℃에서 가닥-치환 활성 (특이 활성)의 비교를 도시한다. 상업적으로 공지된 폴리머라제는 KF (클레노우 단편 E. 콜리), Bst (G. 스테아로써모필루스), Bst 2.0 (G. 스테아로써모필루스) 및 BSU (B. 서브틸리스)이다.
도 4 는 다양한 NaCl 농도에서 PB 폴리머라제 및 다른 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 도시한다. 상업적으로 공지된 폴리머라제는 KF (클레노우 단편 E. 콜리), Bst (G. 스테아로써모필루스), Bst 2.0 (G. 스테아로써모필루스) 및 BSU (B. 서브틸리스)이다.
도 5 는 PB 폴리머라제의 폴리머라제 활성에서 온도의 효과를 도시한다.
도 6 은 KF에 비교된 PB 폴리머라제의 안정성에서 온도의 효과를 도시한다. KF는 클레노우 단편 (E.콜리)이다.
도 7 은 상이한 pH에서 PB 폴리머라제 I의 용융 온도 (Tm (℃)) 분석을 도시한다.
도 8 은 상업적 호열성 BstpolI (Bst2.0), 중온성 Bsu 및 PB polI (PbI) 사이 진행성의 비교 (Pr 마킹된 레인)을 도시한다. T7은 공지된 고 진행성 효소이고 고 진행성용 양성 대조군으로서 사용된다. P로 마킹된 레인은 폴리머라제 활성을 명시하는 반면 Pr은 진행성을 명시한다. 진행성은 비-표지된 DNA 트랩의 인큐베이션에 기반하여 분석되고, 이는 효소가 템플레이트 가닥으로부터 해리하면 그리고 더 적은 최종 생성물 수율 (+80 뉴클레오타이드 편입)이 겔상에 보여질 수 있다면 표지된 기질에 DNA 폴리머라제의 재결합을 뛰어나게 할 것이다.
실시예
클로닝, 유전자 발현 및 단백질 정제
서열번호:1의 PB 폴리머라제의 생산
지오바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 I 및 그것의 절단된 "큰 단편" (PDB 1L3S)의 구조적 지식에 기반하여, 원치않는 5'-3'-엑소뉴클레아제 도메인은 발현 작제물에서 제거되었다, 즉 정방향 프라미어는 PB 폴리머라제의 PCR 생성물이 원치않는 엑소뉴클레아제 도메인이 부족한 그와 같은 방식으로 설계된다. 사이크로바실러스 sp.로부터 DNA 폴리머라제 I을 인코딩하는 유전자는 Gateway® 기술 (Thermo Fisher)를 사용하여 벡터 pET151/D-TOPO®속에 클로닝되었다. 폴리머라제 연쇄 반응용 개시 물질은 사이크로바실러스 sp.의 게놈 DNA이었다. 정방향 프라미어 (5'- CACCACAGAAGTAGCATTCGAGATTGTT -3' (서열번호:7)) 및 역방향 프라이머 (5'- TTACTTCGTGTCATACCAAGATGAACC -3' (서열번호:8))을 사용함으로써 유전자는 절단되었고 폴리머라제 I의 소위 큰 단편에 유사하다.
재조합 단백질 생산은 Rosetta 2 (DE3) 세포 (Novagen®)에서 수행되었다. 세포는 Terrific Broth에서 성장하였고 유전자 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 단백질 생산은 15 ℃에서 6시간 동안 수행되었다. 제1 정제 단계에서 His6-태깅된 단백질은 고정된 Ni2+-친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 제2 단계는 4 ℃에서 밤새 수행된 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제에 의한 태그의 절단이었다. His6-태그 및 His6-태깅된 TEV 프로테아제로부터 단백질을 분리시키기 위해 제2 Ni2+-친화성 크로마토그래피는 제3 단계에서 수행되었다. 단백질 정제의 제4 및 최종 단계는 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare)에서 크기-배제 크로마토그래피이었다. 최종 단백질 용액은 농축되었고 50 % 글리세롤과 -20 ℃에서 저장되었다.
폴리머라제 활성 검정
이 실험은 25℃에서 분자 비콘 검정을 사용하여 특정 상업적으로 입수가능한 폴리머라제와 PB 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성을 비교한다.
폴리머라제 활성 검정은 (Summerer, Methods Mol. Biol., 2008, 429, 225-235으로부터 변형된) 분자 비콘 탐침에 기반된다. 분자 비콘 템플레이트는 GC-풍부 8mer 줄기 영역 (서열은 이탤릭체로 명시된다)에 의해 연결되는 23mer 루프 및 43mer 연장으로 구성된다. 루프 형성으로 인해 형광단 Dabcyl 및 FAM은 가깝게 근접하고 따라서 켄칭된다. 분자 비콘 템플레이트에 어닐링되는 프라이머의 DNA 폴리머라제 I의 연장시 줄기는 개방되고 2개의 형광단의 거리에서 증가는 FAM 형광 (여기 485 nm, 방출 518 nm)의 회복에 의해 측정된다.
분자 비콘 템플레이트
5'- GGCCCGT Dabcyl AGGAGGAAAGGACATCTTCTAGCAT FAM ACGGGCCGTCAAGTTCATG GCCAGTCAAGTCGTCAGAAATTTCGCACCAC -3' (서열번호:9)
프라이머
5'- GTGGTGCGAAATTTCTGAC -3' (서열번호:10)
분자 비콘 기질은 95 ℃에서 5분 동안 100 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0내 15 μM 프라이머 및 10 μM 분자 비콘 템플레이트의 20 μl 인큐베이팅에 의해 생산되었다. 반응은 그 다음 실온에서 2시간 동안 냉각되었다. 기질액은 10 μM의 최종 농도로 -20 ℃에서 저장되었다.
50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP (등몰 양의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 구성되었다. PB 폴리머라제 I을 위하여 반응은 추가로 pH 8.5에서 50 mM BIS-TRIS 프로판내 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2 % 글리세롤을 함유하였다. 상업적으로 공지된 폴리머라제 Is를 위하여 New England Biolabs에 의해 공급된 각각의 반응 완충액은 사용되었다. 반응 완충액에서 최종 염 농도는 각각의 폴리머라제에 대하여 최적의 염에 따라 100 mM로 조정되었다. 활성 검정은 25 ℃에 흑색 96-웰 형광 검정 플레이트 (Corning®)에서 수행되었다. 반응은 단백질 용액의 첨가 (즉 폴리머라제의 첨가)에 의해 개시되었다. FAM 형광에서 증가는 485 nm에서 여기 및 518 nm에서 방출에 의해 적절한 시간 간격에서 상대 형광 단위로서 측정되었다. 측정은 SpectraMax® Gemini Microplate Reader (Molecular Devices)에서 수행되었다.
이 폴리머라제 활성 검정의 결과는 도 1에서 도시된다. PB 폴리머라제는 상업적으로 (New England Biolabs) 이용가능한 폴리머라제 KF (클레노우 단편 E.콜리), Bst (G.스테아로써모필루스로부터 폴리머라제), Bst 2.0 (G.스테아로써모필루스로부터 폴리머라제)보다 더 높은 폴리머라제 활성을 보여준다. B. 서브틸리스로부터 BSU 폴리머라제만이 이 온도에서 더 높은 폴리머라제 활성을 보여준다.
폴리머라제 활성 검정의 동일한 유형은 해양 공급원으로부터 다른 DNA 폴리머라제와 PB 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성을 비교하기 위해 또한 수행되었다 (데이터 도시되지 않음). PB 폴리머라제는 시험된 다른 해양 폴리머라제 (예를 들어 알리비브리오 살모니시다 DNA 폴리머라제)와 비교된 현저하게 더 높은 폴리머라제 활성을 가졌다.
가닥-치환 활성 검정
이 실험은 25℃에서 가닥-치환 활성 검정을 사용하여 특정 상업적으로 입수가능한 폴리머라제와 PB DNA 폴리머라제의 가닥-치환 활성을 비교한다. 가닥을 치환시키기 위한 폴리머라제의 능력, 일명 가닥 치환은 많은 등온 증폭 방법에 중요하다.
가닥-치환 특성 평가에서 중요한 것은 강력한 검정 설계이다. 검정 셋업의 개요는 도 2에서 도시된다. 검정은 DNA 폴리머라제의 가닥-치환 활성을 통해 유일하게 달성가능한 켄칭된 리포터 가닥의 치환시 측정되는 형광 신호에서 증가에 기반된다. 대조군으로서 가닥-치환 음성 폴리머라제 T4는 사용되고 검정에서 무 활성을 보여주었다 (결과 도시되지 않음).
가닥-치환 활성 검정용 기질은 19 올리고뉴클레오타이드 (서열번호:11)의 "차가운" 프라이머 및 그것의 3' 말단 (서열번호:12)에서 TAMRA 형광단 (F)로 표지되는 20 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 리포터 가닥으로 구성된다. 템플레이트 가닥은 40 올리고뉴클레오타이드로 구성되고 그것의 5' 말단 (서열번호:13)에서 블랙 홀 켄쳐 2 (BHQ2)로 표지된다. 프라이머는 템플레이트 가닥상의 위치 20에서 하나의 뉴클레오타이드 갭을 이탈시키는 템플레이트 가닥에 어닐링된다. 게다가 표지는 가깝게 근접하고 따라서 형광단 TAMRA는 BHQ2로 켄칭된다. DNA 폴리머라제 I의 가닥-치환 활성시 TAMRA 표지된 올리고뉴클레오타이드는 템플레이트 가닥으로 치환된다. 그 결과 형광단 및 켄쳐는 더 이상 가깝게 근접하지 않고 TAMRA 형광에서 증가는 측정될 수 있다 (여기 525 nm, 방출 598 nm).
5'- TATCCACCAATACTACCCT CGATACTTTGTCCACTCAAT[TAMRA] -3'
3'- ATAGGTGGTTATGATGGGATGCTATGAAACAGGTGAGTTA[BHQ2] -5'
mRFU/min/mg로서 표현된 PB 폴리머라제의 가닥-치환 활성은 상기-기재된 가닥-치환 활성 검정을 사용하여 분석되었다.
가닥-치환 활성 검정용 기질은 5 분 동안 95 ℃에서 100 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0내 10 μM 템플레이트 가닥 및 10 μM 리포터 가닥, 10 μM "차가운" 프라이머의 20 μl 인큐베이팅에 의해 생산되었다. 반응은 그 다음 실온에서 2시간 동안 냉각하게 되었다. 기질액은 10 μM의 최종 농도로 -20 ℃에서 저장되었다.
50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP (등몰 양의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 구성되었다. PB 폴리머라제 I을 위하여 반응은 추가로 pH 8.5에서 50 mM BIS-TRIS 프로판내 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2 % 글리세롤을 함유하였다. 상업적으로 공지된 폴리머라제 Is를 위하여 New England Biolabs에 의해 공급된 각각의 반응 완충액은 사용되었다. 반응 완충액에서 최종 염 농도는 각각의 폴리머라제용 최적의 염에 따라 100 mM로 조정되었다. 활성 검정은 25 ℃에 흑색 96-웰 형광 검정 플레이트 (Corning®)에서 수행되었다. 반응은 단백질 용액의 첨가 (즉 폴리머라제의 첨가)에 의해 개시되었다. TAMRA 형광에서 증가는 525 nm에서 여기 및 598 nm에서 방출 기록에 의해 적절한 시간 간격에서 상대 형광 단위로서 측정되었다. 측정은 SpectraMax® Microplate Reader (Molecular Devices)에서 수행되었다.
이 가닥-치환 활성 검정의 결과는 도 3에서 도시된다. 결과는 사이크로바실러스 sp. (PB)로부터 폴리머라제가 상업적으로 입수가능한 폴리머라제 KF (클레노우 단편 E.콜리), Bst (G.스테아로써모필루스로부터 폴리머라제), Bst 2.0 (G.스테아로써모필루스로부터 폴리머라제)보다 우월한 가닥 치환 활성을 보유한다는 것을 보여준다. 사이크로바실러스 sp. (PB) DNA 폴리머라제는 상업적으로 입수가능한 BSU (B. 서브틸리스) 폴리머라제에 비교할만한 가닥 치환-활성을 보여준다.
가닥-치환 활성 검정의 동일한 유형은 해양 공급원으로부터 다른 DNA 폴리머라제와 PB 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성을 비교하기 위해 또한 수행되었다 (데이터 도시되지 않음). PB 폴리머라제는 시험된 다른 해양 폴리머라제 (예를 들어 알리비브리오 살모니시다 DNA 폴리머라제)와 비교된 현저하게 더 높은 가닥-치환 활성을 가졌다.
폴리머라제 활성에서 염 농도의 효과의 분석
미정제 샘플, 예컨대 혈액에서, 폴리머라제 반응을 억제시킬 수 있는 몇 개의 화합물이 존재할 수 있다. 하나의 그와 같은 화합물은 염 (고 염 함량)이다. 폴리머라제 활성에서 염 농도의 효과를 평가하기 위한 실험은 아래에 기재된 바와 같이 수행되었다.
PB DNA 폴리머라제용 최적 NaCl 농도는 반응 완충액에서 존재하는 염의 양을 다양화하는 기재된 폴리머라제 활성 검정을 사용하여 분석되었다. 100 퍼센트 활성은 최고 폴리머라제 활성을 제공하는 염 농도를 지칭한다. 환언하면, 각각의 시험된 DNA 폴리머라제에 대하여 관측된 최대 폴리머라제 활성은 100% 활성 값으로서 셋팅된다. 각각의 곡선에서 다른 값 (데이터 포인트)는 각각의 폴리머라제용 100% 활성에 상대적이다.
50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP (등몰 양의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 구성되었다. PB 폴리머라제 I을 위하여 반응은 추가로 pH 8.5에서 50 mM BIS-TRIS 프로판내 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2 % 글리세롤을 함유하였다. 상업적으로 공지된 폴리머라제 Is를 위한 완충액은 염을 생략한 New England Biolabs에 의해 공급된 각각의 완충액의 조성물에 따라 제조되었다. 이 실험에서 시험된 각각의 NaCl 농도는 각각의 반응에 개별적으로 첨가되었다. 활성 검정은 25 ℃에 흑색 96-웰 형광 검정 플레이트 (Corning®)에서 수행되었다. 반응은 PB에 대하여 1 μg/ml, Bst에 대하여 16 유닛/ml, Bst 2.0에 대하여 16 유닛s/ml, BSU에 대하여 2.5 유닛/ml 또는 KF에 대하여 2 유닛/ml를 가진 단백질 용액의 첨가에 의해 개시되었다. FAM 형광에서 증가는 485 nm에서 여기 및 518 nm에서 방출에 의해 적절한 시간 간격에서 상대 형광 단위로서 측정되었다. 측정은 SpectraMax® Gemini Microplate Reader (Molecular Devices)에서 수행되었다.
이 실험의 결과는 도 4에서 도시된다. 도 4에서 분명한 바와 같이, PB DNA 폴리머라제는 상이한 염 농도의 범위에 내성을 나타낸다.
PB 폴리머라제의 폴리머라제 활성에서 온도의 효과
PB 폴리머라제 I의 폴리머라제 활성에서 온도의 효과는 단일-뉴클레오타이드 편입 검정으로 조사되었다.
단일-뉴클레오타이드 편입 검정
19 올리고뉴클레오타이드 (서열번호:15)로 구성되는 프라이머는 40 올리고뉴클레오타이드 (서열번호:14)로 구성되는 템플레이트 가닥에 어닐링된다. 프라이머는 그것의 5' 말단에서 FAM 형광단으로 표지된다. 반응 배치에서 유일하게 dATP는 제공될 것이고 따라서 폴리머라제는 위치 20에서 하나의 뉴클레오타이드에 의해서만 5'-3' 방향으로 프라이머를 연장시킬 수 있다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 (12 % 폴리아크릴아미드/7 M 우레아)에서 후속적인 분석 및 FAM 표지된 올리고뉴클레오타이드용 스캐닝은 19 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 아데닌에 의해 연장된 따라서 20 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머를 보여준다. 효소 활성은 연장된 프라이머 (강도 1) 및 미연장된 프라이머 (강도 0)을 나타내는 밴드의 밀도계 측정에 의해 결정된다. 상대 편입 속도는 아래와 같이 계산된다:
편입 [%] = 강도 1/(강도 0 + 강도 1)*100
5'- ATTGAGTGGAGATAGTATCGTAGGGTAGTATTGGTGGATA - 3' 40mer
3'- TCCCATCATAACCACCTAT[FAM] - 5' 19mer
단일-뉴클레오타이드 편입 검정용 기질은 5 분 동안 75 ℃에서 100 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0내 0.5 μM 템플레이트 DNA 및 0.5 μM 형광단-표지된 프라이머의 20 μl 인큐베이팅에 의해 생산되었다. 반응은 실온에서 2시간 동안 냉각하게 되었다. 기질액은 0.5 μM의 최종 농도로 -20 ℃에서 저장되었다.
10 마이크로리터 반응은 30 nM 기질 및 10 μM dATP를 함유하였다. PB 폴리머라제 I을 위하여 반응은 추가로 pH 8.5에서 50 mM 트리스내 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2 % 글리세롤을 함유하였다. 실온에서 반응 완충액의 pH는 각각의 인큐베이션 온도에서 pH 8.5이도록 조정되었다. 반응은 0.018 ng/μl 단백질 PB 폴리머라제 I의 첨가에 의해 개시되었고 각각의 온도 (즉 도 5에서 데이터 포인트에 상응하는 온도)에서 15분 동안 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서 단백질 희석 완충액은 단백질 용액 대신에 사용되었다.
반응은 2.5 μl 변성 겔 장입 완충액 (95 % 포름아미드, 10 mM EDTA, 0.1 % 자일렌 시아놀)의 첨가 및 5 분 동안 95 ℃에서 인큐베이션에 의해 중단되었다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (12 % 폴리아크릴아미드/7 M 우레아)를 위하여 6 μl의 샘플 용적은 겔상에 장입되었다. 겔 전기영동은 50 W에서 1시간 15 분 동안 0.5 x TBE 완충액 (44.5 mM 트리스, 44.5 mM 붕산, 1 mM EDTA)에서 수행되었고 겔은 후속적으로 PharosFX Plus Imager (Bio-Rad)로 스캐닝되었다.
이 실험의 결과는 도 5에서 도시된다. 100 퍼센트 활성은 최고 활성을 가진 온도 값을 지칭한다. 환언하면, 시험된 PB DNA 폴리머라제에 대하여 관측된 최대 폴리머라제 활성은 100% 활성 값으로서 셋팅된다. 각각의 곡선에서 다른 값 (데이터 포인트)는 각각의 폴리머라제에 대하여 100% 활성에 상대적이다. 예로써, 20℃의 인큐베이션 온도에서, PB 폴리머라제의 폴리머라제 활성은 관측된 최대 PB 폴리머라제 활성의 약 60%이다, 즉 약 60% "상대" 활성이 있다.
도 5에서 결과는 PB 폴리머라제가 넓은 범위의 온도에 걸쳐 상당한 폴리머라제 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
KF (클레노우 단편)에 비교된 PB 폴리머라제의 안정성에서 온도의 효과.
PB 폴리머라제 I의 안정성에서 온도의 효과는 단일-뉴클레오타이드 편입 검정으로 조사되었다.
단일-뉴클레오타이드 편입 검정
19 올리고뉴클레오타이드 (서열번호:15)로 구성되는 프라이머는 40 올리고뉴클레오타이드 (서열번호:14)로 구성되는 템플레이트 가닥에 어닐링된다. 프라이머는 그것의 5' 말단에서 FAM 형광단으로 표지된다. 반응 배치에서 유일하게 dATP는 제공될 것이고 따라서 폴리머라제는 위치 20에서 하나의 뉴클레오타이드에 의해서만 5'-3' 방향으로 프라이머를 연장시킬 수 있다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 (12 % 폴리아크릴아미드/7 M 우레아)에서 후속적인 분석 및 FAM 표지된 올리고뉴클레오타이드용 스캐닝은 19 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 아데닌에 의해 연장된 따라서 20 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머를 보여준다. 효소 활성은 연장된 프라이머 (강도 1) 및 미연장된 프라이머 (강도 0)을 나타내는 밴드의 밀도계 측정에 의해 결정된다. 상대 편입 속도는 아래와 같이 계산된다:
편입 [%] = 강도 1/(강도 0 + 강도 1)*100
5'- ATTGAGTGGAGATAGTATCGTAGGGTAGTATTGGTGGATA - 3' 40mer
3'- TCCCATCATAACCACCTAT[FAM] - 5' 19mer
단일-뉴클레오타이드 편입 검정용 기질은 5 분 동안 75 ℃에서 100 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0내 0.5 μM 템플레이트 DNA 및 0.5 μM 형광단-표지된 프라이머의 20 μl 인큐베이팅에 의해 생산되었다. 반응은 실온에서 2시간 동안 냉각하게 되었다. 기질액은 0.5 μM의 최종 농도로 -20 ℃에서 저장되었다.
PB 폴리머라제 I을 위하여 10 μl 반응은 pH 8.5에서 50 mM BIS-TRIS 프로판, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2 % 글리세롤에서 수행되었다. 불활성화 온도를 시험하기 위해 0.018 ng/μl의 PB 폴리머라제 I은 반응 완충액에 첨가되었고, 15분 동안 각각의 온도 (즉 도 6에서 데이터 포인트에 상응하는 온도)에서 인큐베이션되었고 나중에 5분 동안 얼음에서 냉각되었다. KF를 위하여 반응 완충액은 25 ℃에서 최적의 pH로 New England Biolabs에 의해 공급된 각각의 완충액의 조성물에 따라 제조되었다. 단백질은 0.67 유닛/ml로 반응 완충액에 첨가되었고 반응은 PB 폴리머라제 I에 대하여 기재된 바와 같이 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서 단백질 희석 완충액은 단백질 용액 대신에 사용되었다.
단일-뉴클레오타이드 연장 반응은 30 nM 기질 및 10 μM dATP의 첨가에 의해 개시되었고 혼합물은 25 ℃에서 15분 동안 인큐베이션되었다. 반응은 2.5 μl 변성 겔 장입 완충액 (95 % 포름아미드, 10 mM EDTA, 0.1 % 자일렌 시아놀)의 첨가 및 5 분 동안 95 ℃에서 인큐베이션에 의해 중단되었다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (12 % 폴리아크릴아미드/7 M 우레아)를 위하여 6 μl의 샘플 용적은 겔상에 장입되었다. 겔 전기영동은 50 W에서 1시간 15 분 동안 0.5 x TBE 완충액 (44.5 mM 트리스, 44.5 mM 붕산, 1 mM EDTA)에서 수행되었고 겔은 후속적으로 PharosFX Plus Imager (Bio-Rad)로 스캐닝되었다.
이 실험의 결과는 도 6에서 도시된다. 100 퍼센트 활성은 얼음 (0℃)에서 인큐베이션된 효소 샘플을 지칭한다. 환언하면, 각각의 시험된 DNA 폴리머라제 (PB 및 E.콜리 (KF)로부터 클레노우 단편)을 위하여 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 15 분 동안 얼음 (0 ℃)에서 폴리머라제가 인큐베이션된 경우 관측된 폴리머라제 활성은 100% 활성 값으로서 셋팅된다. 각각의 곡선에서 다른 값 (데이터 포인트)는 각각의 폴리머라제에 대하여 100% 활성에 상대적이다. 예로써, 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 37℃에서 15 분 인큐베이션후, PB 폴리머라제의 폴리머라제 활성은 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 15 분 인큐베이션이 얼음 (0℃)에서 실시된 경우 관측된 PB 폴리머라제 활성의 약 80%이다, 즉 약 80% "잔여" 활성이 있다.
도 6에서 결과는 KF와 비교하여, PB 폴리머라제가 일정 범위의 온도에서 사전 인큐베이션후 더 높은 폴리머라제 활성을 보유한다는 것을 보여준다. 환언하면, PB 폴리머라제는 KF 폴리머라제보다 더욱 온도 안정적이다. 예를 들어, 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 15 분 동안 30℃에서 인큐베이션으로, PB 폴리머라제는 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 인큐베이션이 얼음 (0℃)에서 실시된 (즉 30℃ 인큐베이션으로 100% 잔여 활성인) 경우와 동일한 폴리머라제 활성을 보유한다. 그에 반해서, 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 15 분 동안 30℃에서 인큐베이션으로, KF 폴리머라제는 단일-뉴클레오타이드 연장 반응의 개시에 앞서 인큐베이션이 얼음 (0℃)에서 실시된 (즉 30℃ 인큐베이션으로 60% 잔여 활성인) 경우 관측된 폴리머라제 활성의 단지 약 60%를 갖는다.
검정의 동일한 유형은 해양 공급원으로부터 다른 DNA 폴리머라제와 PB 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성을 비교하기 위해 또한 수행되었다 (데이터 도시되지 않음). PB 폴리머라제는 시험된 다른 해양 폴리머라제 (예를 들어 알리비브리오 살모니시다 DNA 폴리머라제)와 비교된 현저하게 더 높은 안정성을 가졌다.
상이한 pH 완충액에서 PB 폴리머라제의 용융 온도를 보여주는 생체물리학적 데이터
단백질의 용융 온도 (T m)는 Ericsson 등에 따른 써모플루오르 실험 (Anal. Biochem., 2006, 357, 289-298)에 의해 결정되었다. 50 mM의 농도에서 pH 6.0 내지 pH 9.5의 수많은 완충액은 시험되었다. 각각의 완충액, 6x의 최종 희석액으로 SYPRO® Orange (Sigma Aldrich) 및 12.5 μg의 단백질 (즉 PB 폴리머라제)는 박-벽 PCR 플레이트 (Biorad)의 웰에서 철저하게 혼합되었다. 웰들은 광학-품질 밀봉 테이프 (Biorad)로 밀봉되었다. 최종 반응의 용적은 25 μl이었다. 3 초 간격에서 0.3 ℃의 증분으로 10 - 90 ℃의 온도 범위는 써모플루오르 실험에서 스캐닝되었다.
이 실험의 결과는 도 7에서 도시된다. PB 폴리머라제 I은 그것의 상대적 넓은 온도 적용 범위를 추가로 증명하는 평균 약 43-44 ℃ 용융 온도로 pH 6 - 8.5의 범위에서 넓은 pH 안정성 프로파일을 보여준다.
진행성
진행성은 해리전 합성 (뉴클레오타이드 편입) 동안 DNA 템플레이트 가닥에 결합된 채 유지되는 DNA 폴리머라제의 능력이고, DNA 합성의 전반적인 효율은 따라서 주어진 폴리머라제의 증가하는 진행성과 함께 증가할 수 있다. 이러한 특징은 특히 DNA의 더 긴 스트레치가 합성될 필요가 있다면 중요할 수 있다. 진행성 검정은 따라서 단일 결합 이벤트후 중합의 정도를 측정하기 위해 설계된다. 연장 생성물이 폴리머라제의 진행성을 반영하기 위해, 과잉의 트랩 DNA는 이 경우에 첨가되어 각각의 프라이머 템플레이트가 1회만 연장되는 것을 확보한다.
100-mer 템플레이트
3'ATGTTGGTTCTCGTATGCTGCCGGTCACGGCTTAAGTGTGCCACAACACACAACCAACACCACCACAACACACCAACAACCACAACACACACAACCACAC-5' (서열번호:16)
Fam 표지된 20-mer 프라이머
5'FAM-TACAACCAAGAGCATACGAC (서열번호:17)
프라이머-템플레이트 DNA 기질을 제조하기 위해, 100 mer 템플레이트 (0.5 μM)은 75 ℃에서 5 분 동안 50 mM NaCl 및 50 mM 트리스/HCl pH 7.5의 존재 하에 20 mer FAM 표지된 프라이머 (0.5 μM)로 인큐베이션되었고, 적어도 2 시간 동안 실온으로 냉각하게 되었다. 본 명세서에서 시험된 PB 폴리머라제 I 및 상업적 폴리머라제 (New England Biolabs)는 25 ℃에서 10분 동안 50 mM 트리스-HCl (PB 폴리머라제 I 및 T7 DNA 폴리머라제에 대하여 pH 8.5, Bst 2.0 및 BSU에 대하여 pH 7.5), 50 mM KCl (PB 폴리머라제 I, Bst 2.0, T7 DNA 폴리머라제) 또는 50 mM NaCl (BSU), 0.2 mg/ml BSA, 1 mM DTT 및 2 % 글리세롤내 DNA 기질 (25 nM) 및 dNTPs (10 μM)로 전-인큐베이션되었다.
반응 (Pr)은 트랩으로서 1.1 mg/ml 청어 정자 DNA 및 5 mM MgCl2 첨가에 의해 개시되었고 중단 용액 (95 % 포름아미드 10 mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루) 첨가에 의해 2 분후 종결되었다. 트랩의 유효성을 보여주기 위해, 동일한 양의 PbI는 평행한 반응에서 MgCl2 (R0)와 반응의 개시전 1.1 mg/ml 트랩 및 DNA 기질로 사전 인큐베이션되었다. 대조군으로서 프라이밍된 기질의 완전한 중합을 위하여, 또 다른 반응 (P)는, 동일한 반응 조건 하에, 임의의 트랩 첨가 없이 운영되었다. P 반응에서 동등한 폴리머라제 활성을 제공하였던 효소의 양은 진행성 분석용 개시점으로서 사용되었다. 따라서, 진행성 분석용 효소의 하기 양은 사용되었다: PB 폴리머라제 I 0.013 mg, Bst 2.0 0.14 mg 및 BSU 0.016 mg.
반응은 5 분 동안 95 ℃에서 가열되었고 생성물은 8 M 우레아를 함유하는 10 % TBE-폴리아크릴아미드 겔상에 분해되었다. 이미지는 그 다음 Pharose FX Plus imager (BioRad)에 의해 시각화되었다.
이 실험의 결과는 도 8에서 도시된다. 이들 결과는 PB 폴리머라제가 Bsu 및 Bst2.0에 비교된 상당히 더 높은 진행성을 갖는다는 것을 보여주고, 여기에서 이들은 PB>Bsu>Bst 2.0 순서로 수행한다.
<110> UNIVERSITETET I TROMS?- NORGES ARKTISKE UNIVERSITET <120> Marine DNA Polymerases <130> MPI18-013 <150> GB1604876.1 <151> 2016-03-22 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 580 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated PB polymerase <400> 1 Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu 1 5 10 15 Asp Lys Val Met Ser Val His Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His 20 25 30 Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp 50 55 60 Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr 65 70 75 80 Gln Ala Val Ser Arg Lys His Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu 100 105 110 Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr 115 120 125 Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile 130 135 140 Glu Lys Ile Ala Glu His Ala Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp 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355 360 365 Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp 370 375 380 Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala 385 390 395 400 Val Thr Ser Asp Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile 405 410 415 Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr 420 425 430 Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro 435 440 445 Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr 450 455 460 Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile 465 470 475 480 Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met 485 490 495 Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 500 505 510 Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu Ile Ser Glu Asn Met Gln Thr Lys Met 515 520 525 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu 530 535 540 Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile 545 550 555 560 Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp 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Glu Lys Tyr Thr Pro Glu His Val Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Leu Gln Ile Ile Asp Met Lys Gly Leu Met Gly Asp Ala Ser Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu 195 200 205 Lys Glu His Gly Ser Val Glu Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Asp Thr Val 210 215 220 Ser Gly Val Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn Glu Glu Gln Ala 225 230 235 240 Ile Met Ser Lys Ala Leu Ala Thr Ile Glu Thr Ala Ala Pro Ile Gln 245 250 255 Ile Ser Ile Asp Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Pro Asn Met Glu Glu Val 260 265 270 Ile Glu Val Trp Lys Glu Leu Ala Phe Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 Asp Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Glu Thr Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile 290 295 300 Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu Asp Lys Val Met Ser Val His 305 310 315 320 Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile 325 330 335 Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala 340 345 350 Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys 355 360 365 Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr Gln Ala Val Ser Arg Lys His 370 375 380 Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr 385 390 395 400 Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys 405 410 415 Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys 420 425 430 Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile Glu Lys Ile Ala Glu His Ala 435 440 445 Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp Leu Lys Glu Lys Leu Glu Val 450 455 460 Lys Leu Glu Glu Asn Glu Gln Tyr Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Leu 465 470 475 480 Pro Leu Ala Ser Ile Leu Gly Thr Met Glu Ser Asp Gly Val Leu Val 485 490 495 Asp Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Gly His Glu Leu Asn Ile Lys Leu 500 505 510 Arg Ala Ile Glu Gln Asp Ile Tyr Ala Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn 515 520 525 Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly 530 535 540 Leu Thr Pro Ile Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp 545 550 555 560 Val Leu Glu Lys Leu Ala Ser Glu His Glu Ile Ile Glu Gln Ile Leu 565 570 575 Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Asn Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu 580 585 590 Leu Lys Glu Ile His Glu Asp Asp Gly Lys Ile His Thr Arg Tyr Gln 595 600 605 Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu 610 615 620 Gln Asn Ile Pro Val Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala 625 630 635 640 Phe Val Pro Ser Gln Pro Gly Trp Val Met Phe Ala Ala Asp Tyr Ser 645 650 655 Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu 660 665 670 Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met 675 680 685 Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala Val Thr Ser Asp Met Arg Arg 690 695 700 Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 705 710 715 720 Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe 725 730 735 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp 740 745 750 Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu 755 760 765 Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu 770 775 780 Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser 785 790 795 800 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu 805 810 815 Ile Ser Glu Asn Met Gln Thr Lys Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu 820 825 830 Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile 835 840 845 Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys 850 855 860 Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp Tyr Asp Thr Lys 865 870 875 <210> 4 <211> 2634 <212> DNA <213> Psychrobacillus sp. <400> 4 atgtatttgt caaccgagaa aatcctatta ttagacggca atagtttggc ataccgagct 60 ttttttgccc tacctttatt aacaaatgaa catggaatac atacaaacgc agtatatggc 120 tttacaatga tgctacaaaa aattatggat gaagaaaatc ctactcatat gctcgtggca 180 tttgatgccg ggaaaacgac cttccgtcac tctacttttg gggattataa aggtggaaga 240 caaaaaacac caccagaact atcggaacaa ttcccttata tacgcaagtt aatcgatgct 300 tatggtatta agcgatacga actggaaatg tacgaagcag acgatattat cggtacttta 360 agcaagcgtg cagacgaaaa agggcagcaa gttgtaattg tctcaggtga taaagattta 420 acacaactag ctacagataa aacaactgtg tatatcacaa gaaaaggcat aaccgatatt 480 gaaaaatata cacctgaaca tgtacaagaa aagtatggct taactccatt acagattata 540 gacatgaaag gtttaatggg agatgcttct gataatattc caggagttcc tggtgtcgga 600 gaaaaaacag ctattaagct tttaaaagaa catggttcgg tagaggattt atataaagca 660 cttgatacag ttagtggtgt taaactaaag gaaaaactca tcgccaacga agagcaggca 720 attatgagta aggcattagc tacgattgaa acagctgcac cgatacagat ttctatagac 780 gatctttcat atactggtcc taatatggaa gaagtaattg aagtttggaa ggaactagct 840 tttaaaactc ttcttgagaa atctgactat atttctgagg aatccgaaac tacagaagta 900 gcattcgaga ttgttgaaga aattgactct acaatattag ataaagtaat gtcagtccat 960 ttagaaatgt atgatgggca atatcataca agcgaattat taggtattgc tttatcagat 1020 ggagaaaagg gttattttgc tcctgctgat atagcttttc aatcgaagga tttttgttct 1080 tggttagaaa atgctacgaa taaaaagtat ttagcagact ccaaagcaac acaagcagtg 1140 agtagaaaac ataatgtgaa tgtacatgga gtggaattcg accttctttt agcagcgtat 1200 atagtaaatc ctgctatctc ttcagaggat gttgctgcta ttgctaaaga atttggatat 1260 tttaacttgc tgacaaacga tagtgtttat gggaaaggtg ccaaaaaaac cgcacctgaa 1320 atcgagaaaa ttgcagaaca tgccgtaaga aaagcaaggg ctatttggga cttgaaagaa 1380 aagttagaag taaaactgga agaaaatgaa caatatgcgt tgtataaaga aatagagcta 1440 ccgcttgcat ctatccttgg tacgatggaa tcagatgggg tgctggtgga taaacaaatt 1500 cttgtagaaa tgggtcatga gcttaatatt aagttacgag cgattgaaca agacatttat 1560 gcgttagctg gtgaaacgtt taatattaat tcacctaaac aattaggtgt aatactattt 1620 gaaaaaattg gtcttacccc tattaaaaag acaaaaacgg gctattcaac tgcagcagat 1680 gttttggaaa aactagcaag tgaacatgaa ataatagagc aaattttact atatcgtcaa 1740 ttaggtaaac tcaattccac atatatcgaa ggattattaa aagagattca tgaagatgat 1800 gggaagatcc atacccgata tcaacaagcc ctaacttcaa ctgggcgttt gagttcgatc 1860 aatccaaacc ttcaaaatat accagttcgt ttagaagaag gtagaaaaat acgtaaagcc 1920 tttgttcctt cacaaccggg atgggtaatg tttgcggcgg attactctca aattgaattg 1980 cgtgttcttg cccatatgtc tgaggatgaa aacctggtag aagcttttaa taatgatctg 2040 gatattcata ctaaaacggc tatggatgta ttccatgtgg agcaggaagc agtaacgtcc 2100 gatatgcgcc gtgctgctaa ggcagttaac tttgggattg tgtatggtat tagtgattat 2160 ggtttatcac aaaacctaga tattactaga aaagaagcgg cgacatttat cgagaattat 2220 ttaaatagct tcccaggtgt aaaaggatat atggatgata tcgttcaaga tgcgaaacaa 2280 acaggctacg ttacaacaat tttgaataga cgaagatatt tgcctgaaat aacaagttct 2340 aactttaatc tccgcagttt tgcagaacgt actgctatga atacaccaat tcaagggagt 2400 gcagccgata ttattaaaaa agcaatgatc gatatggcgg aaagattaat atcagaaaat 2460 atgcagacca aaatgctact acaagtacat gatgaattaa tttttgaggc tccaccagag 2520 gaaattgcaa tgctagaaaa aatagtgcca gaggtgatgg aaaacgctat taaactgatt 2580 gtacctttga aagtggatta tgcctttggt tcatcttggt atgacacgaa gtag 2634 <210> 5 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing a 5'-3' exonuclease functional domain of DNA polymerase I isolated from a Psychrobacillus sp. <400> 5 Met Tyr Leu Ser Thr Glu Lys Ile Leu Leu Leu Asp Gly Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu Thr Asn Glu His Gly 20 25 30 Ile His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Gln Lys Ile 35 40 45 Met Asp Glu Glu Asn Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly 50 55 60 Lys Thr Thr Phe Arg His Ser Thr Phe Gly Asp Tyr Lys Gly Gly Arg 65 70 75 80 Gln Lys Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Tyr Ile Arg Lys 85 90 95 Leu Ile Asp Ala Tyr Gly Ile Lys Arg Tyr Glu Leu Glu Met Tyr Glu 100 105 110 Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ser Lys Arg Ala Asp Glu Lys Gly 115 120 125 Gln Gln Val Val Ile Val Ser Gly Asp Lys Asp Leu Thr Gln Leu Ala 130 135 140 Thr Asp Lys Thr Thr Val Tyr Ile Thr Arg Lys Gly Ile Thr Asp Ile 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Thr Pro Glu His Val Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Leu Gln Ile Ile Asp Met Lys Gly Leu Met Gly Asp Ala Ser Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu 195 200 205 Lys Glu His Gly Ser Val Glu Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Asp Thr Val 210 215 220 Ser Gly Val Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn Glu Glu Gln Ala 225 230 235 240 Ile Met Ser Lys Ala Leu Ala Thr Ile Glu Thr Ala Ala Pro Ile Gln 245 250 255 Ile Ser Ile Asp Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Pro Asn Met Glu Glu Val 260 265 270 Ile Glu Val Trp Lys Glu Leu Ala Phe Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 Asp Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Glu Thr 290 295 <210> 6 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated DNA polymerase of Aliivibrio salmonicida <400> 6 Val Asp Arg Ser Lys Tyr Glu Thr Ile Phe Thr Lys Glu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Trp Leu Glu Lys Val Asn Asn Ala Glu Val Thr Ala Phe Asp Thr 20 25 30 Glu Thr Asp Ser Leu Asp Tyr Met Val Ala Asn Leu Ile Gly Leu Ser 35 40 45 Phe Ser Val Glu Glu Gly Glu Ala Ala Tyr Val Pro Val Ala His Asp 50 55 60 Tyr Leu Asp Ala Pro Glu Gln Leu Asp Arg Asp Trp Val Leu Ala Gln 65 70 75 80 Leu Lys Pro Tyr Leu Glu Asp Glu Thr Lys Ala Lys Val Gly Gln Asn 85 90 95 Leu Lys Tyr Asp Ala Ser Val Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Glu Met Lys 100 105 110 Gly Ile Lys Phe Asp Thr Met Leu Glu Ser Tyr Val Tyr Asn Ser Val 115 120 125 Ala Gly Lys His Asn Met Asp Ser Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Gln His 130 135 140 Asn Thr Ile Ser Phe Glu Glu Ile Ala Gly Lys Gly Lys Lys Gln Leu 145 150 155 160 Thr Phe Asn Gln Ile Ala Leu Glu Glu Ala Ala Pro Tyr Ala Ala Glu 165 170 175 Asp Ala Asp Ile Thr Leu Arg Leu His Asn Val Leu His Ala Lys Leu 180 185 190 Val Thr Asp Glu Lys Leu Asn Ala Val Phe Thr Asp Ile Glu Leu Pro 195 200 205 Leu Ile Ser Val Leu Ser Arg Met Glu Arg Lys Gly Val Tyr Ile Asp 210 215 220 Asp Met Leu Leu Ser Ala Gln Ser Leu Glu Ile Gly Gln Arg Leu Asp 225 230 235 240 Glu Leu Glu Thr Ala Ser Phe Glu Val Ala Gly Gln Glu Phe Asn Met 245 250 255 Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gln Thr Ile Leu Phe Glu Lys Met Glu Leu 260 265 270 Pro Val Ile Lys Lys Thr Pro Ser Gly Ala Ala Ser Thr Asn Glu Glu 275 280 285 Val Leu Gln Glu Leu Ala Leu Glu Tyr Glu Leu Pro Lys Leu Ile Leu 290 295 300 Glu Tyr Arg Gly Leu Ala Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Thr Asp Lys Leu 305 310 315 320 Pro Lys Met Ile Asn Pro Ser Thr Gly Arg Val His Thr Ser Tyr His 325 330 335 Gln Ala Val Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Asp Pro Asn Leu 340 345 350 Gln Asn Ile Pro Ile Arg Asn Lys Glu Gly Arg Arg Ile Arg Gln Ala 355 360 365 Phe Val Ala Pro His Gly Trp Lys Ile Leu Ala Val Asp Tyr Ser Gln 370 375 380 Ile Glu Leu Arg Ile Met Ala His Leu Ser Gln Asp Arg Ala Leu Leu 385 390 395 400 Glu Ala Phe Ser Ala Gly Lys Asp Ile His Ala Ala Thr Ala Ala Glu 405 410 415 Val Lys Gly Val Ser Ile Glu Glu Val Thr Ser Glu Asp Arg Arg Arg 420 425 430 Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly Met Ser Ala Phe Gly 435 440 445 Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gln Asp Tyr Met 450 455 460 Asn Val Tyr Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Val Met Gln Tyr Met Glu Glu 465 470 475 480 Thr Arg Leu Leu Ala Thr Glu Gln Gly Tyr Val Glu Thr Leu Tyr Gly 485 490 495 Arg Arg Leu Tyr Leu Pro Glu Ile Asn Ala Arg Asn Ala Ile Arg Arg 500 505 510 Lys Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ile Asn Ala Pro Met Gln Gly Thr Ala 515 520 525 Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Leu Val Asp Asn Trp Ile Glu 530 535 540 Ala Glu Gly Thr Gly Arg Val Asn Leu Leu Met Gln Val His Asp Glu 545 550 555 560 Leu Val Phe Glu Val Lys Glu Asp Glu Leu Glu Ala Ile Thr Lys Gln 565 570 575 Val Thr Ala Leu Met Glu Ala Ala Val Ser Leu Asp Val Pro Leu Ile 580 585 590 Ala Glu Ser Gly Phe Gly Asp Asn Trp Asp Glu Ala His 595 600 605 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 caccacagaa gtagcattcg agattgtt 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ttacttcgtg tcataccaag atgaacc 27 <210> 9 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular beacon template <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> labeled with the fluorophore Dabcyl <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> labeled with the fluorophore FAM <400> 9 ggcccgtagg aggaaaggac atcttctagc atacgggccg tcaagttcat ggccagtcaa 60 gtcgtcagaa atttcgcacc ac 82 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gtggtgcgaa atttctgac 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cold primer <400> 11 tatccaccaa tactaccct 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reporter strand <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> labeled with TAMRA fluorophore at 3' end <400> 12 cgatactttg tccactcaat 20 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template strand <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> labeled at 5' end with the Black Hole Quencher 2 <400> 13 attgagtgga caaagtatcg tagggtagta ttggtggata 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template strand <400> 14 attgagtgga gatagtatcg tagggtagta ttggtggata 40 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> labeled at 5' end with the fluorophore FAM <400> 15 tatccaccaa tactaccct 19 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template <400> 16 cacaccaaca cacacaacac caacaaccac acaacaccac cacaaccaac acacaacacc 60 gtgtgaattc ggcactggcc gtcgtatgct cttggttgta 100 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> labeled at 5-end with the fluorophore FAM <400> 17 tacaaccaag agcatacgac 20

Claims (28)

  1. DNA 폴리머라제가 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호:1에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 서열번호:1에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 0℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 30%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 20℃ 내지 35℃의 온도 범위에 걸쳐 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 60%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 최대 활성을 나타내는 온도에서 약 10℃까지 벗어나는 온도에서, 상기 DNA 폴리머라제가 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 30%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 활성 평가에 앞서 0℃ 내지 40℃의 온도 범위에 걸쳐 임의의 온도에서 상기 DNA 폴리머라제의 15 분 동안 인큐베이션후 그것의 최대 활성의 적어도 40%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 활성 평가에 앞서 0℃ 내지 37℃의 온도 범위에 걸쳐 임의의 온도에서 상기 DNA 폴리머라제의 15 분 동안 인큐베이션후 그것의 최대 활성의 적어도 60%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 pH 범위 6.0 내지 8.5에서 약 42℃-45℃의 용융 온도를 갖는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제, 지오바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 및/또는 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제보다 더 높은 폴리머라제 활성을 갖고, 상기 DNA 폴리머라제 활성이 약 25℃에서 평가되는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 E.콜리 클레노우 단편 DNA 폴리머라제, 지오바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제 및/또는 알리비브리오 살모니시다로부터 DNA 폴리머라제보다 적어도 50% 더 높은 가닥 치환 활성을 갖는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 바실러스 서브틸리스 DNA 폴리머라제보다 더 높은 진행성을 갖는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 0mM 내지 210mM NaCl의 농도 범위에 걸쳐서, 상기 DNA 폴리머라제가 그것의 최대 폴리머라제 활성의 적어도 30%를 나타내는, 단리된 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편 및 완충액을 포함하는, 조성물.
  15. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열번호:2에서 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 서열번호:2에 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 따른 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질 서열의 전사 및 번역을 위하여 필요한 조절 서열을 함유하는, 발현 벡터.
  18. 청구항 17에 따른 하나 이상의 발현 벡터 또는 청구항 15 또는 청구항 16에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 숙주세포.
  19. 하기의 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편의 생산 방법:
    (i) 인코딩된 DNA 폴리머라제의 발현에 적합한 조건 하에 청구항 17에 따른 하나 이상의 재조합 발현 벡터 또는 청구항 15 또는 청구항 16에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를 배양시키는 단계; 및
    (ii) 숙주세포로부터 또는 성장 배지 또는 상청액으로부터 DNA 폴리머라제를 단리 또는 수득하는 단계.
  20. 뉴클레오타이드 중합을 위한 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편의 용도.
  21. 핵산 증폭 또는 서열분석 반응에서 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편의 용도.
  22. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편이 일정한 온도에서 사용되는, 용도.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 상기 반응이 등온 핵산 증폭 반응인, 용도.
  24. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 이용하는 뉴클레오타이드의 중합 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    (i) 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편, 템플레이트 핵산 분자, 템플레이트 핵산 분자의 부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 뉴클레오타이드의 하나 이상의 종을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; 및
    (ii) 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 템플레이트 핵산 분자를 어닐링하고, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 DNA 폴리머라제가 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시키는 바의 조건 하에 상기 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계.
  25. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편을 이용하는 핵산의 증폭 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    (i) 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라제 또는 이의 효소 활성 단편, 템플레이트 핵산 분자, 템플레이트 핵산 분자 산 분자의 부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들), 및 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)이 템플레이트 핵산 분자에 어닐링하고, 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 DNA 폴리머라제가 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)을 연장시키는 바의 조건 하에 상기 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계.
  26. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서, 상기 방법이 일정한 온도에서 수행되는, 방법.
  27. 청구항 22 또는 청구항 26에 있어서, 상기 일정한 온도가 0℃ 내지 42℃인, 용도 또는 방법.
  28. 청구항 27 또는 27에 있어서, 상기 일정한 온도가 10℃ 내지 25℃인, 용도 또는 방법.
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