CN112646908A - 创伤弧菌等温扩增引物、探针、试剂盒与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种创伤弧菌等温扩增引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID NO：1；所述下游引物的序列为SEQ ID NO：2。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物和探针特异性好，提供的试剂盒通过靶向捕获探针，特异富集目标序列，能够提高特异性；同时，捕获探针中含有T7启动子序列，通过转录及逆转录反应，放大待测序列，能够大大提高检测灵敏度，操作简便快捷，能够解决复杂样本背景对重组酶等温扩增抑制的问题，解决重组酶等温扩增的实际应用问题，具有广泛的应用场景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及创伤弧菌等温扩增引物、探针、试剂盒与检测方法。
背景技术
创伤弧菌(vibrio vulnificus)是普遍生存在海洋中的一种细菌，一旦感染，发病急，病情发展很快，与霍乱弧菌、肠炎弧菌并列为造成人类感染疾病的三大弧菌。接触创伤弧菌污染的海产或海水，或遭海生鱼贝类等刺伤，都可能导致创伤弧菌进入人体并发生感染。感染创伤弧菌后的症状包括呕吐、发烧、腹泻、低血压、肿胀和疼痛等，临床上容易造成严重的败血症及肢体坏死，需要尽快使用抗生素治疗。
等温扩增技术又称为恒温扩增技术，可在恒定温度下扩增特定的DNA或RNA片段。与常规PCR扩增技术相比，等温扩增技术对仪器要求低、反应时间短，更能满足POCT快速实时检测的要求。现有等温扩增技术主要包括环介导等温扩增(LAMP)、依赖于核酸序列扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、解旋酶等温扩增技术(HAD)等，在食品安全和公共卫生防疫等领域得到广泛的应用。等温扩增技术虽具有许多优点，但由于样品背景的复杂性，容易对重组酶等温扩增产生抑制作用，导致重组酶等温扩增等技术在实际应用中受到限制。
感染创伤弧菌的危害大，现有技术尚无法对创伤弧菌进行快速、高效检测，因此，提供创伤弧菌等温扩增引物、探针、试剂盒与检测方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种创伤弧菌等温扩增引物、探针、试剂盒与检测方法，提供的引物和探针特异性好，结合重组酶等温扩增技术实现了对创伤弧菌的快速、高效检测。此外，本发明提供的试剂盒通过靶向捕获探针，特异富集目标序列，能够提高特异性；同时，捕获探针中含有T7启动子序列，通过转录及逆转录反应，放大待测序列，能够大大提高检测灵敏度，操作简便快捷，能够解决复杂样本背景对重组酶等温扩增抑制的问题，解决重组酶等温扩增的实际应用问题，具有广泛的应用场景。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供创伤弧菌等温扩增引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物(引物F)的序列为CACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTAT(SEQ ID NO：1)；所述下游引物(引物R)的序列为CGATAGTTGAGTTTCACGCCCATCTCGAAATCCG(SEQ ID NO：2)。
本发明还提供创伤弧菌等温扩增探针，所述探针用于检测权利要求1所述创伤弧菌等温扩增引物的扩增产物，其序列由TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTGACGAAGCGCCTGTG(SEQ ID NO：3)修饰得到，修饰后的探针序列为：TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGT/i6FAMdT/T/idSp/G/iBHQ1dT/ACGAAGCGCCTGTG C3 Spacer。
此外，创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：包括所述创伤弧菌等温扩增引物、所述创伤弧菌等温扩增探针。
优选地，所述创伤弧菌等温扩增引物的浓度为5～20μmol/L，所述创伤弧菌等温扩增探针的浓度为5～20μmol/L。
优选地，所述创伤弧菌等温扩增试剂盒，还包括捕获磁珠、扩增反应液和重组酶。
本发明提供的试剂盒采用磁珠靶向捕获探针与重组酶等温扩增结合，能够降低背景基因对扩增的影响，保证扩增的准确性，同时提高特异性，操作简便；捕获探针携带启动子，能够在结合靶标序列后，通过RNA聚合酶以及逆转录酶获得大量的靶标序列，提高检测的灵敏度。所述捕获磁珠带有捕获探针(下划线部分为T7启动子序列)NH2C6-TAATACGACTCA CTATAGGGCCAGTCGATGCGAATACGTTGTTTCACGGT。
更优选地，创伤弧菌等温扩增试剂盒，还包括样品裂解液和阳性对照品。
相应地，本发明还提供创伤弧菌等温扩增检测方法，包括如下步骤：
S1进行样品前处理，提取样品DNA，使用捕获磁珠进行样品靶向富集，得到靶向富集后的捕获磁珠；
S2建立包括所述创伤弧菌等温扩增引物、所述创伤弧菌等温扩增探针和重组酶的扩增体系，加入所述靶向富集后的捕获磁珠，反应步骤和条件包括：1)预热：40℃、1s、1循环；2)延伸及荧光采集：40℃、30s、30循环，恒温扩增检测荧光并收集荧光信号，进行样品检测结果的判断。
通过特异富集目标序列，可以避免复杂样本背景对重组酶等温扩增抑制的影响，能够提高特异性和准确性。
优选地，所述样品靶向富集包括如下步骤：加入捕获磁珠，涡旋混匀后，90～95℃孵育5～15min。离心，磁力架吸附，弃废液。使用无核酸酶去离子水洗涤，加入无核酸酶去离子水作为核酸保存液，得到靶向富集后的捕获磁珠。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过NCBI的Genebank下载创伤弧菌特异性保守基因vvhA基因序列(MH357338.1)，进行比对后，设计引物和探针，并进行了筛选和优化，特异性好。
(2)本发明提供了创伤弧菌等温扩增试剂盒和检测方法，运用优化的引物和探针，采用磁珠靶向捕获探针与重组酶等温扩增结合，在恒温条件下进行快速扩增，10min内完成扩增实验，能够降低背景基因对扩增的影响，保证扩增的准确性，同时提高特异性，操作简便，检测灵敏度高，适用范围广，对于实现等温扩增技术在基层医疗卫生机构的快速检测应用、提高卫生防疫水平等具有重要意义。
附图说明
图1本发明的检测方法原理示意图。
图2创伤弧菌的引物和探针筛选组合结果示意图。
图3本发明的灵敏度检测结果示意图。
图4本发明的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。羧基磁珠购自苏州海狸生物医学工程有限公司，创伤弧菌来自广东省微生物菌种保藏中心。本发明中的％浓度，如未明确指出，指质量浓度，或按行业内通常理解。
实施例一捕获磁珠的制备
捕获磁珠的制备体系如下：
捕获磁珠的制备方法包括如下步骤：
(1)制备上述制备体系后，涡旋混匀，37℃孵育4h，每隔30min涡旋混匀1次；
(2)反应结束后离心收集管盖及壁上磁珠，置于磁力架上，弃上清；
(3)加入500μL 1mol/L NaHCO3室温洗涤2次；
(4)加入500μL 1mol/L NaHCO3孵育30min；
(5)加入500μL无核酸酶水室温洗涤1次，弃废液；
(6)加入500μL 0.01％Proclin重悬磁珠，获得捕获磁珠，4℃保存。
实施例二样品靶向富集
进行样品前处理，提取样品DNA，加入实施例一制得的捕获磁珠，涡旋混匀后，92℃孵育10min，离心，磁力架吸附3min，弃废液，使用无核酸酶去离子水洗涤，加入无核酸酶去离子水作为核酸保存液，得到靶向富集后的捕获磁珠，靶向富集后的捕获磁珠的质量浓度为1％。
实施例三重组酶等温扩增检测
扩增体系：60mmol/L Tris(pH 7.2)、6mmol/L二硫苏糖醇、5％聚乙二醇、5mmol/LATP、1.5mmol/L dNTPs、100μmol/L磷酸肌醇、50ng/μL单链结合蛋白SSB、10ng/μL RecQ解旋酶、50ng/μL UvsX重组酶、50ng/μL UvsY重组酶、70ng/μL BSU DNA聚合酶、10U RNase H、1U核酸外切酶III、1μmol/L引物F、1μmol/L引物R、0.8μmol/L修饰后的探针、20mmol/L醋酸镁。制备完成后，取35μL扩增体系，加入15μL靶向富集后的捕获磁珠。
检测程序：
| 步骤 | 程序 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 1 | 预热 | 40℃ | 1s | 1 |
| 2 | 延伸及荧光采集 | 40℃ | 30s | 40 |
反应结束自动保存结果。使用原始曲线和终点荧光值，按表1进行结果分析和判定，不需要设定基线和阈值。本发明提供的检测方法的原理示意图如图1所示。
表1结果分析与判定
实施例四创伤弧菌等温扩增引物和探针的设计及优化
合成创伤弧菌特异性保守基因VVHA基因序列(TTTGGTGAGTGTGATGAACTGCGCCGCCAAGAGCTTGGATGCTATTTCACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTATTTGATAAGACGAAGTTCAACCCAATCTCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTTTGTACGAAGCGCCTGTGTCTGAAACTGGCGTAACGGATTTCGAGATGGGCGTGAAACTCAACTATCGTGCACGCTTTGGTACGGTAATCCCTTCAGCACTCTTCTCAGTTTATGGTTCTGCGGGCTCGTCAACCAACAGCAGTACCGTGAAACAACGTATTCGCATCGACTGGAATCATCCACT)，连接入pUC57质粒，使用设计的创伤弧菌的引物、探针和等温扩增反应液，通过质粒DNA来进行检测。将合成的共计9个组合的引物分别进行组合如表2所示，筛选出扩增曲线最优的一个组合。从图2可知：引物探针组合vvF2、vvR1和vvP1的扩增效果最佳，曲线形态最平滑。
表2创伤弧菌的引物和探针筛选组合
vvF1:CAGTGGCTGGGTATTTGATAAGACGAAGTTCAAC；
vvF2:CACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTAT；
vvF3:CAAGAGCTTGGATGCTATTTCACCGCCGCTCAC；
vvR1:CGATAGTTGAGTTTCACGCCCATCTCGAAATCCG；
vvR2:CGTACCAAAGCGTGCACGATAGTTGAGTTTCAC；
vvR3:GCTGAAGGGATTACCGTACCAAAGCGTGCACGATA；
荧光探针vvP1：
TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGT/i6FAMdT/T/idSp/G/iBHQ1dT/ACGAAGCGCCTGTG3'Spacer C3。
实施例四检测的灵敏度和特异性
将创伤弧菌寄送给深圳市龙华区疾病预防控制中心，委托其进行菌种培养、菌落计数、及不同浓度增菌液的核酸提取，采用水煮法进行的不同浓度增菌液DNA提取，共提取9个浓度。其中取梯度稀释的菌稀释液浓度10-4和10-5进行菌落平板涂布计数，每板取100ul相应菌液进行涂布，每个浓度涂布3个平板，菌落计数结果如表3所示。
表3创伤弧菌菌落计数
根据深圳市龙华区疾病预防控制中心菌落计数的菌落数，按照《中国兽药典》2015版关于菌落计数的要求，应选择10-4作为理想计数结果。计算不同浓度增菌液浓度分别为：
起始浓度：1.84×107cfu/ml
1：1.84×105CFU/ml
2：1.84×104CFU/ml
3：1.84×103CFU/ml
4：1.84×102CFU/ml
5：1.84×101CFU/ml
6：1.84×100CFU/ml
本发明的灵敏度检测结果如图3所示，试剂盒最低检测限可达到1.84×102CFU/ml，反应时间可在10min内完成。
使用金色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜菌、蜡状芽孢杆菌、无乳链球菌、铅黄肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行特异性检测，浓度为106CFU/ml，结果如图4所示，说明本发明的检测特异性好，金色葡萄球菌等其他菌不会造成干扰。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州赛哲生物科技股份有限公司
<120> 创伤弧菌等温扩增引物、探针、试剂盒与检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
caccgccgct cactggggca gtggctgggt at 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
cgatagttga gtttcacgcc catctcgaaa tccg 34
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
tcttattcca acttcaaacc gaactatgac gttgacgaag cgcctgtg 48
Claims (9)
1.创伤弧菌等温扩增引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID NO：1；所述下游引物的序列为SEQ ID NO：2。
2.创伤弧菌等温扩增探针，其特征在于：所述探针用于检测权利要求1所述创伤弧菌等温扩增引物的扩增产物，其序列由SEQ ID NO：3修饰得到，修饰后的探针序列为：TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGT/i6FAMdT/T/idSp/G/iBHQ1dT/ACGAAGCGCCTGTG3'Spacer C3。
3.创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述创伤弧菌等温扩增引物、权利要求2所述创伤弧菌等温扩增探针。
4.根据权利要求3所述的创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：所述创伤弧菌等温扩增引物的浓度为5～20μmol/L，所述创伤弧菌等温扩增探针的浓度为5～20μmol/L。
5.根据权利要求3或4所述的创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：还包括捕获磁珠、扩增反应液和重组酶。
6.根据权利要求5所述的创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：所述捕获磁珠带有捕获探针NH2C6-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGTCGATGCGAATACGTTGTTTCACGGT。
7.根据权利要求5或6所述的创伤弧菌等温扩增试剂盒，其特征在于：还包括样品裂解液和阳性对照品。
8.创伤弧菌等温扩增检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1进行样品前处理，提取样品DNA，使用捕获磁珠进行样品靶向富集，得到靶向富集后的捕获磁珠；
S2建立包括权利要求1所述创伤弧菌等温扩增引物、权利要求2所述创伤弧菌等温扩增探针和重组酶的扩增体系，加入所述靶向富集后的捕获磁珠，反应步骤和条件包括：1)预热：40℃、1s、1循环；2)延伸及荧光采集：40℃、30s、30循环，恒温扩增检测荧光并收集荧光信号，进行样品检测结果的判断。
9.根据权利要求8所述的创伤弧菌等温扩增检测方法，其特征在于：所述样品靶向富集包括如下步骤：加入捕获磁珠，涡旋混匀后，90～95℃孵育5～15min，离心，磁力架吸附，去废液，收集捕获磁珠，加入无核酸酶去离子水洗涤，加入无核酸酶去离子水作为核酸保存液，得到靶向富集后的捕获磁珠。
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