CN112680547B

CN112680547B - 一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112680547B
Application number: CN202011593439.1A
Authority: CN
Inventors: 何宗顺; 曲峰
Original assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2040-03-13
Also published as: CN112708699A; CN111235314B; CN111235314A; CN112708699B; CN112680547A

Abstract

本发明提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：(i)扩增反应试剂；(ii)混合酶试剂；和(iii)扩增检测试剂。本发明还提供所述实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒与病毒样本灭活裂解试剂盒以及靶核酸磁性捕获试剂或试剂盒结合来实现病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测中的应用本发明的灭活裂解试剂盒可以在室温快速灭活又减少RNA的降解，灵敏度高；靶核酸磁性捕获试剂的特异性更强，所得模板的质量好且数量多；实时荧光核酸恒温扩增技术将逆转录和扩增在一起进行，缩短了反应的时间，提供了检测试剂的灵敏度。

Description

一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其应用

本申请是申请号为“2020101751855”、发明名称为“一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及一种病毒灭活试剂盒、病毒核酸捕获试剂盒、实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用，尤其是涉及将采集灭活裂解一体化、特异性靶标磁性捕获和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合在一起的病毒特别是2019新型冠状病毒(2019-nCoV)前处理及检测相关试剂盒及其应用。

背景技术

2020年的春节，突如其来的新型冠状病毒肺炎疫情持续蔓延，当前形势仍然严峻。新型冠状病毒(2019 Novel Coronavirus,2019-nCoV)是一种RNA病毒，它的遗传物质是核糖核酸，其特异性核酸序列是区分这一病毒与其他病原体的标志物。而新型冠状病毒核酸检测目的就是为了在感染患者体内找到该病毒的存在。新型冠状病毒检测目前普遍采用的是核酸检测方法包括病毒RNA提取和第二代实时荧光定量PCR技术。病毒RNA提取过程即为前处理过程，其中将标本(咽拭子、口咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等)中的病毒RNA纯化分离。荧光定量PCR核酸检测的技术原理是先将新型冠状病毒RNA逆转录为DNA，再将标本中的特定核酸序列进行扩增，理论上进行30次左右的扩增，其核酸数量达就可达到一定的检测标准，再通过荧光等常规方式进行检测。

目前，已有多个国家和地区发布2019-nCoV的确诊检测方法。中国疾病预防控制中心推荐检测的基因靶标为ORF1ab和N基因；香港大学推荐ORF1b-nsp14和N基因；德国查理特推荐RdRP、E和N基因。我国首批获证有6家企业提供的检测方法包括核酸提取、逆转录和PCR扩增；所需时间为2小时至4小时；其中核酸提取一般需要1-2小时，逆转录过程需要1小时，而PCR扩增需要40-90分钟；最低检测限为500-1000copies/mL。

2020年2月5日，中国工程院副院长、呼吸与危重症医学专家王辰教授提到：“目前的检测方式主要还是对于病毒核酸的检测，但新冠病毒有一个特点，并不是所有感染的患者都能测出核酸阳性。”核酸检测对于阳性病人，最高有30～50％的阳性率，也就是说，有些患者核酸检测结果为阴性，却在临床上被确认为疑似新冠肺炎，属于“假阴性”，一些人因此质疑这项检测无法发挥作用。“漏检”情况使一些临床医生和民众对检测试剂盒的质量提出了疑问。

应对上述疑问，重庆人民医院三院检验科对不同的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂的检测性能进行比较和分析。收集该院1例弱阳性患者不同时间点采集的咽拭子标本，选取上述6种国产试剂(A-F)平行检测，进行RNA提取和扩增，根据各试剂检测结果比较其性能。结果发现，C和F试剂3次平行检测结果(ORF1ab和N基因)均为阳性，D试剂均未检出N基因，A、B、E试剂均有未检出ORF1ab情况存在；C试剂批内重复检测结果最佳；F试剂(N和ORF1ab)、E试剂(ORF1ab)和A试剂(ORF1ab)3次检测结果的CT值有趋势性变化。这些结果表明，6种2019-nCoV核酸检测试剂对弱阳性样品的检测能力有差异，部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳，亟需进一步优化，提高其性能，以便更好地适应大规模的筛查需求。

因此，有临床医生和有关专家疾呼将CT影像学检查结果纳入确认诊断标准，但CT影像学检测的灵敏度高而特异性却可能较低，仅用CT检测假阴性可能小但是可能造成大量假阳性，从而可能增加不必要的医疗负担和假阳性患者交叉感染的概率；同时早期感染者CT影像学特征不明显会造成假阴性从而对社会造成交叉感染。毋庸置疑的是，核酸检测最终一定是新型冠状病毒肺炎无创诊断的金标准，也是当前灵敏度和特异性最高的新冠病毒检测方法。一般而言，检测试剂盒作为三类医疗器械，需要经过临床试验，在特异性、灵敏度等多项指标达到要求后，才可由国家食药监局批准上市进入临床，这通常需要花费数月甚至数年的时间。此次疫情暴发迅猛，在试剂盒的开发中拿不到也来不及用足够的临床样本进行多批次重复验证，而临床应用的需求迫在眉睫。

综上所述，现有核酸检测出现假阴性以及阳性率不高的原因是多方面的，不同类型样品的采集、不同病患的不同病程中病毒含量在不同的样品中的病毒含量本身具有较大的浮动，采样后需要特别设备和专业车辆进行低温保存运输，反复冻融导致RNA的完整性降低，传统热灭活方法对RNA的降解，样品保存液和提取试剂的兼容性差，提取过程得率低、前处理耗时长也会导致RNA的降解，提取过程中得到目标靶核酸的纯度低，含有人类大量基因组或其他病原体的基因组导致后续扩增产物不特异性或干扰扩增，PCR检测中引物、探针、酶的浓度的比例是否足够灵敏等众多原因。

发明内容

为解决现有的2019-nCoV检测方法灵敏度较低，检测时长(采集、保存、运输、灭活、提取和检测)、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性的问题，本发明在第一方面提供了一种病毒样本灭活裂解试剂盒，所述试剂盒包括用于配制灭活裂解液的如下试剂：铵盐、异硫氰酸胍、氯化锂、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂、抗坏血酸、二硫苏糖醇和缓冲剂。

优选的是，所述铵盐选自由硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵和碘化铵组成的组。另外地或进一步优选的是，所述铵盐为氯化铵；另外地或进一步优选的是，所述表面活性剂选自由Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween20、Triton X-100、NP40、十二烷基肌氨酸钠和CTAB组成的组。另外地或进一步优选的是，所述表面活性剂为TritonX-100和十二烷基硫酸锂的组合。另外地或进一步优选的是，所述缓冲剂选自由Tris碱、磷酸盐和HEPES组成的组。

另外地或进一步优选的是，所述灭活裂解液用水配制，并且包含0.01-2M铵盐，0.5-2M异硫氰酸胍，0.1-0.5M氯化锂，5-50mM乙二胺四乙酸，1-20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.1-5％表面活性剂，10-500mM抗坏血酸，0.5-5％二硫苏糖醇和20-500mM缓冲剂。

另外地或进一步优选的是，所述灭活裂解液中的铵离子的浓度为0.05M至0.5M，优选为0.1M至0.4M，更优选0.1M至0.2M。另外地或进一步优选的是，所述灭活裂解液中的表面活性剂为0.2％TritonX-100和0.5％十二烷基硫酸锂的组合。另外地或进一步优选的是，所述缓冲剂为HEPES，优选的是，HEPES的浓度为50-200mM。另外地或进一步优选的是，所述灭活裂解液的pH值为5-6.5。

本发明在第二方面提供了一种病毒灭活裂解方法，所述方法采用本发明第一方面所述的病毒样本灭活裂解试剂盒进行。优选的是，病毒样本选自由咽拭子样本、口咽拭子样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本和尿液样本组成的组；所述灭活裂解液为所述病毒样本的体积的2至4倍；所述灭活是在室温处理15至30分钟；和/或所述病毒为2019-nCoV。

本发明在第三方面提供了一种靶核酸磁性捕获试剂，所述试剂包括：

(1)作为固相载体的磁性高分子微球，所述磁性高分子微球包括由γFe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料制成的微球体和包被所述微球体的一层或多层多聚材料，并且所述磁性高分子微球的表面修饰有微球连接基团；

(2)中间探针，所述中间探针包括5’修饰非核苷酸单元、3’修饰寡聚核苷酸单元和可选的中间臂，并且所述中间探针通过所述微球连接基团与所述5’修饰非核苷酸单元结合来与所述磁性高分子微球连接；

(3)捕获探针，所述捕获探针包括与靶核酸特异性互补的5’特异性序列和3’polyA序列；优选的是，所述靶核酸为表征目标微生物存在的特异性序列，更优选的是，所述目标微生物为2019-nCoV；更优选的是，所述3’polyA序列的长度为10-50碱基，更优选为10-30碱基。

另外地或进一步优选的是，所述多聚材料通过乳液聚合、无皂聚合、分散聚合或种子溶胀聚合来包被所述微球体。另外地或进一步优选的是，所述磁性高分子微球的粒径为0.1-10μm，优选为0.5-5μm，更优选为选自由Dynabeads M270 Streptavidin、DynabeadsMyOne Streptavidin T1、Merck

羧基磁珠M1-200/20、Merck/>

氨基磁珠M2-070/40、Agilent LodeStars 2.7 Carboxyl组成的组。

另外地或进一步优选的是，所述微球连接基团为活性基团或亲和蛋白，和/或所述亲和蛋白为链霉亲和素。另外地或进一步优选的是，所述活性基团选自由羧基、氨基、环氧基、NHS基团(N-羟基琥珀酰亚胺)、叠氮基团、甲苯磺酰基和氯甲基组成的组，优选为羧基或甲苯磺酰基。

另外地或进一步优选的是，所述5’修饰非核苷酸单元选自由氨基、羧基和生物素组成的组。

另外地或进一步优选的是，所述3’修饰寡聚核苷酸单元选自由Oligo dT、OligodU、Oligo dT VN或Oligo dU VN组成的组，其中，V选自由A、G和C组成的组，并且N选自由T、A、G和C组成的组；优选的是，所述3’修饰寡聚核苷酸中的寡聚T或者寡聚U中的核苷酸数目为5-100，更优选为10-50。

另外地或进一步优选的是，所述可选的中间臂为PEG和/或Cn，其中PEG的分子量为100-600，优选为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，更优选n为2-12；所述中间臂的长度为5-50A°，更优选为10-30A°。

另外地或进一步优选的是，所述捕获探针为针对2019-nCoV的捕获探针，并且所述5’特异性序列为orf1ab基因上的特异性序列和/或N蛋白基因位置上的特异性序列；优选的是，所述5’特异性序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示；进一步优选的是，所述捕获探针如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。

优选的是，所述微球连接基团为链霉亲和素，5’修饰非核苷酸单元为生物素；所述中间探针选自由5’biotin Oligo(dT)₁₅ 3’、5’biotin-PEG-Oligo(dT)₁₈ 3’、5’biotin-Cn-Oligo(dT)₂₅ VN 3’和5’biotin-Cn-Oligo(dU)₃₀VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-600，优选为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，n优选为2-12；

另外优选的是，所述微球连接基团为羧基，所述5’修饰非核苷酸单元为氨基；优选的是，所述微球连接基团为和所述5’修饰非核苷酸单元通过EDC一步法、EDC/NHS两步法或EDC/SNHS两步法将带有羧基的磁性高分子微球与氨基化的中间探针进行共价结合；更优选的是，所述中间探针选自由5’NH₂-Cn-Oligo(dT)₁₈ 3’、5’NH₂-PEG-Oligo(dT)₂₅ 3’和5’NH₂-PEG-Oligo(dT)₂₃VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-600，优选为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，n优选为2-12。

另外优选的是，所述微球连接基团为氨基，所述5’修饰非核苷酸单元为羧基。

另外优选的是，所述磁性高分子微球的结合载量为至少100pmol/mg、至少200pmol/mg、至少300pmol/mg、至少400pmol/mg、至少500pmol/mg，更为优选的是，所述磁性高分子微球的结合载量为至少750pmol/mg，最优选的是，所述磁性高分子微球的结合载量为至少1200pmol/mg。

另外优选的是，所述中间探针与捕获探针的摩尔比为50:1～2:1，更优选为25:1～3:1，最优选为20:1～4:1。

另外优选的是，没有结合所述捕获探针的中间探针的含量大于100pmol/mg，更优选大于200pmol/mg。

本发明在第四方面提供了一种靶核酸捕获试剂盒，所述靶核酸捕获试剂盒包含结合缓冲液、保存液、洗涤液W1、洗涤液W2、洗脱液和靶核酸磁性捕获试剂。

优选的是，所述结合缓冲液由氯化锂、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、乙二胺四乙酸、柠檬酸以及水组成，pH范围为6.0-8.0，优选其各组分的含量如下：0.02-5M氯化锂，0.02-5％十二烷基硫酸锂，0.05-5％Triton X-1000，1-100mM乙二胺四乙酸，0.02-0.2M柠檬酸，余量为水。

另外优选的是，所述保存液由BSA、NaN₃和所述结合缓冲液制得。

另外优选的是，所述洗涤液W1包含100mM琥珀酸盐、0.5％十二烷基硫酸锂、100mMLiOH、15mM 2,2'-二硫基二吡啶、0.2M LiCl、5mM EDTA、5mM EGTA、3％(v/v)无水乙醇，pH6.5。

另外优选的是，所述洗涤液W2包含20mM HEPES、7.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3％(v/v)无水乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯、50mM氯化锂、0.1％十二烷基硫酸钠，pH7.5。

所述洗脱液包含1mM EDTA和2mM乙酸钠，pH6.5。

优选的是，所述靶核酸磁性捕获试剂为本发明第三方面所述的靶核酸磁性捕获试剂。

本发明在第五方面提供了一种用于扩增并检测靶核酸的引物对，所述引物对包括基于RNA聚合酶启动子序列的正向引物和基于非RNA聚合酶启动子序列的反向引物，所述正向引物包含位于5'末端的RNA聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列，所述反向引物包含反向靶核酸结合序列。

优选的是，所述RNA聚合酶启动子序列选自由sp6 RNA聚合酶启动子序列、T3 RNA聚合酶启动子序列和T7 RNA聚合酶启动子序列。

另外优选的是，所述正向引物包含位于5'末端的T7 RNA聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列。

更优选的是，所述位于5'末端的T7 RNA聚合酶启动子序列为SEQ ID NO.5所示的序列。

进一步优选的是，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO.6所示，反向引物如SEQID NO.7所示，或者所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO.8所示，反向引物如SEQ IDNO.9。本发明在第六方面提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(i)扩增反应试剂；(ii)混合酶试剂；和(iii)扩增检测试剂；

其中，所述扩增反应缓冲液包含Tris-HCl、MgCl₂、PVP 40、KCl、甘油、醋酸锌二水合物、dNTP、NTP，并且pH为7.0；

所述混合酶试剂包含T7 RNA聚合酶、逆转录酶、HEPES、N-乙酰基-L-半胱氨酸、EDTA、叠氮化钠、TritonX-100、KCl、甘油、海藻糖二水合物，pH7.0；

所述检测试剂包含Tris、EDTA、用于扩增靶核酸的引物对和探测靶核酸探针，所述用于扩增靶核酸的引物对为第五方面所述的引物对。

另外优选的是，在所述引物为SEQ ID NO.6和7时，探测靶核酸的探针如SEQ IDNO.10所示，或者，在所述引物为SEQ ID NO.8和9时，探测靶核酸的探针如SEQ ID NO.11所示。

本发明在第七方面提供了一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括；

(1)本发明第一方面所述的病毒样本灭活裂解试剂盒；

(2)本发明第三方面所述的靶核酸磁性捕获试剂或本发明第四方面所述的靶核酸捕获试剂盒；

(3)本发明第五方面所述的引物对或本发明第六方面所述的靶核酸捕获试剂盒。

本发明还提供了使用上述试剂、引物对、探针和试剂盒对病毒尤其是新冠病毒进行灭活、捕获和检测的方法，以及它们在病毒尤其是新冠病毒的灭活、捕获和检测中的应用。

总的来说，本发明提供了一种检测时间短、高灵敏度、高特异性、反应稳定的2019-nCoV采集灭活裂解一体化、特异性靶标磁性捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测相结合的技术和方法。

更具体而言，本发明提供了样本裂解灭活试剂和应用方法，特异性靶标磁性捕获前处理过程以及实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明提供的样本灭活裂解试剂专门用于RNA病毒，在本发明中可专门用于SARS或2019-nCoV尤其是2019-nCoV，所述试剂具有灭活2019-nCoV、短期抑制RNase活性、保护RNA短期不降解以及实现短期常温运输保存的功能。现在推荐的灭活方法为56度处理30-45分钟，而常见的样品处理液一般为等渗溶液、生理盐水或PBS溶液，RNA易在此过程中出现降解，造成后续PCR检测过程中无法进行扩增，导致假阴性。

本发明提供了一种针对2019-nCoV样本灭活裂解试剂和应用方法，特异性靶标磁性捕获前处理过程以及实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，与现有的加热灭活、冷链运输、常规提取和RT-PCR检测的流程相比，具有以下优点：

1)样本采集后立即灭活裂解处理，实现常温运输并保证了RNA的完整性，减少了运输的成本和风险；

2)高特异性、高纯度：针对2019-nCoV靶核酸设计的优选磁珠、中间探针和捕获探针，可高效、特异性捕获2019-nCoV的RNA。

3)由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，且扩增产物为RNA，避免了扩增子造成的气溶胶污染。

4)快速检测：从样本裂解灭活至前处理靶向磁性捕获并将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且在检测整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，灭活只需要15分钟，而前处理只需要10-30分钟，扩增检测只需要45分钟，整个流程在1.5小时以内。

5)自动化程度高，减少了人工操作，避免了可能的污染及人为误差；

6)适用于大规模高通量筛查。

附图说明

图1是本发明实施例8的灵敏度分析图，浓度为2000copies/mL，蓝色为ORF1ab基因(上面线条)，绿色为N基因(下面线条)；

图2是本发明实施例8的灵敏度分析图，浓度为500copies/mL，蓝色为ORF1ab基因(上面线条)，绿色为N基因(下面线条)；

图3是本发明实施例8的灵敏度分析图，浓度为100copies/mL，蓝色为ORF1ab基因(上面线条)，绿色为N基因(下面线条)。

具体实施方式

定义

在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这

些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“寡聚体”包括多种寡聚体等。

应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。

除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。

在本申请中，“样品”或“样本”包括含有或可能含有病毒例如新型冠状病毒(2019-nCoV)或SARS病毒或其组分的任何样品，诸如核酸或核酸的片段。样品包括“生物样品”，其包括源自活的或死的动物如哺乳动物(例如人)的任何组织或材料，其可含有或可能含有例如2019-nCoV或SARS病毒的靶核酸或由其衍生的靶核酸。样品或样本可以包括例如咽拭子样品、口咽拭子样品、痰液样品和肺泡灌洗液样品、外周血样品、血浆样品、血清样品、淋巴结样品、胃肠组织样品、粪便样品、尿液样品或其他体液样品或材料。

“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起，以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。

本文所用的“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基(也可称为“核碱基”)组成的核酸的亚基。RNA中发现的5碳糖是核糖。在DNA中，5碳糖是2′-脱氧核糖。所述术语还包括这些亚基的类似物。

本文所用的“非核苷酸单元”是不显著参与聚合物杂交的单元。例如，这些单元不参与与核苷酸的任何显著的氢键合，并且排除具有五个核苷酸碱基或其类似物之一作为组分的单元。

本文所用的“靶核酸”是包含待扩增的靶序列的核酸。靶核酸可以是如本文所述的DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。靶核酸可以包括除靶序列之外的其它序列，其可以不被扩增。

本文中可互换的术语“寡聚物(oligomer)”、“寡聚体(oligo)”和“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指通常具有少于500个核苷酸(nt)残基的核酸，包括具有约5nt残基的下限和约300至500nt残基的上限的聚合物。在一些实施例中，寡核苷酸的尺寸范围具有约8至15nt的下限和约100至200nt的上限，并且其它实施例在下限为约10至20nt并且上限为约50至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化，或者可以使用多种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来合成，并可以通过磁珠或者HPLC等方法进行纯化。术语寡核苷酸不表示对试剂的任何特定功能；相反，它一般用于涵盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以提供各种不同的功能。例如，如果它特异性针对互补链并能够与互补链杂交且可以在核酸聚合酶的存在下进一步延伸，那么它可以充当引物；如果它含有RNA聚合酶识别的序列并允许转录(例如T7引物)，那么它可以充当引物并提供启动子；如果它能够与靶核酸或其扩增子杂交并且还提供可检测部分(例如荧光团)，那么它可以用于检测靶核酸。

如本文所用的，术语“互补”或“互补性”在提及多核苷酸(即核苷酸序列)使用时是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”互补。互补性可以是“部分的”。其中仅核酸碱基中的一些根据碱基配对规则相配。或者，可有核酸之间“完全的”或“整体的”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样品组分中去除至少70％或至少80％或至少90％的目标核酸。

本文中术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利4683195和4683202号的方法，其描述了增加基因组或其他DNA或RNA的混合物中靶序列区段的浓度而无需克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的这一工艺由以下组成：将大量过量的两条寡核苷酸引物引入含有所期望的靶序列的DNA 混合物，之后是在DNA聚合酶存在下精确序列的热循环。所述两条引物与双链靶序列中它们各自的链互补。为了影响扩增，混合物被变性并且之后引物退火至靶分子中它们的互补序列。退火之后，将引物用聚合酶延伸以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以被重复多次(即，变性、退火和延伸组成一个“循环”；可以有多个“循环”)以获得高浓度的所期望的靶序列的扩增区段。所扩增的所期望靶序列的区段的长度通过引物相对于彼此的相对位置来确定，并且因此这一长度是可控制的参数。由于工艺的重复方面，所述方法被称作“聚合物链式反应”(“PCR”)。因为靶序列的所期望的扩增区段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，它们被称为“PCR扩增的”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域技术人员应当理解术语“PCR”使用例如实时PCR、巢式PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单引物和任意引物PCR等涵盖最初描述的方法的许多变体。

序列可以是“2019-nCoV序列”，如果它或其存在的互补序列相对于2019-nCoV的任何基因型或分离物至少约90％或至少约95％相同，或包含不超过一个错配，使得例如，“2019-nCoV序列的15个连续核苷酸”是指与2019-nCoV的基因型或分离物的15个位置中的至少14个或其互补序列匹配的15聚体。例如，为了确定序列是否符合2019-nCoV序列，U的存在被认为等同于T，反之亦然。以2019-nCoV为例，本文公开的示例性寡聚物的靶杂交区、本文公开的2019-nCoV衍生的体外转录物序列及其子序列也被认为是2019-nCoV序列。

本文中“磁体”是产生磁场的材料或物体。磁体可以是永磁体或电磁体。

本文中的特异性反映了检测时的假阳性率(将非此病患者误诊为患此病的概率)，特异性越高则误诊率越低；灵敏度则反应了检测的假阴性率(将此病患者漏诊为未患此病的概率)，灵敏度越高则漏诊率越低。目前新冠肺炎病毒核酸检测的具体假阴性率和假阳性率未见文章统计报道。术语“灵敏度”在PCR检测中含有另外一层意思，在本文用于指核酸扩增反应可以被检测或定量的精确度。扩增反应的灵敏度一般为可以在扩增系统中可靠地检测的靶核酸的最小拷贝数目的量度，并且将取决于例如所使用的检测测定法以及扩增反应的特异性，例如，特异性扩增子与副产物的比率。

本发明中“2019-nCoV序列”借助高通量测序技术，1月10日前后，新型冠状病毒基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBI GenBank数据库，目前版本为1月17日升级的编号为MN908947.3基因组版本。新型冠状病毒2019-nCoV为线性单链RNA(ssRNA)病毒，基因组全长约29903个核苷酸(可参见NCBI GenBank数据库，1月17日升级的编号为MN908947.3基因组版本)，其共包含10个基因，其中：

前265个核苷酸为5'UTR区域；266..21555为名为"ORF1ab"的基因；21563..25384为“S”基因，可产生病毒表面糖蛋白；25393..26220为"ORF3a"基因；26245..26472为“E”基因可产生病毒包膜蛋白；26523..27191为“M”基因可产生病毒膜糖蛋白；27202..27387为"ORF6"基因；27394..27759为"ORF7a"基因；27894..28259为"ORF8"基因；28274..29533为“N”基因可产生病毒核衣壳磷蛋白；29558..29674为"ORF10"基因；29675..29903为3'UTR区域。具体序列请登录Genbank数据库(登录号：MN908947；版本号：MN908947.3)。

本发明一种病毒样本灭活裂解试剂盒包括铵盐、异硫氰酸胍、氯化锂、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂、抗坏血酸、二硫苏糖醇、缓冲液以及去离子水组成。优选各组分的含量为：0.01-2M铵盐，0.5-2M异硫氰酸胍，0.1-0.5M氯化锂，5-50mM乙二胺四乙酸，1-20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.1-5％表面活性剂，10-500mM抗坏血酸，0.5-5％二硫苏糖醇，20-500mM缓冲液。

根据本发明方法灭活病毒所需要的铵离子(NH4⁺)可以以许多不同方式存在，如通过添加铵盐来提供。在一个优选的实施方案中，所述铵盐是硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵，或碘化铵或其混合物，所述的铵盐优选为氯化铵。

铵离子的浓度通常在0.01M至2M的范围内，优选在0.05M至0.5M的范围内，更优选在0.1M至0.4M的范围内，最优选在0.1M至0.2M的范围内。

所述的表面活性剂为Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween 20、Triton X-100、NP40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中任意一种或其中2-3种的组合，浓度为0.1-5％。优选的表面活性剂为TritonX-100和十二烷基硫酸锂，优选的组合为0.2％TritonX-100和0.5％十二烷基硫酸锂。

所述的缓冲液可以是Tris缓冲液，也可以是磷酸盐缓冲体系，也可以是HEPES缓冲系统，优选的缓冲液为HEPES缓冲，优选的pH值为5-6.5，浓度为50-200mM。

采用本发明病毒样本灭活裂解试剂盒配制的样本灭活裂解试剂可以短期保存RNA，实现短期常温保存运输，本发明中的“短期”指的是25度5天，37度1-2天，本发明中的铵盐和异硫氰酸胍作为蛋白变性剂，用于变性裂解病毒RNA，异硫氰酸胍可抑制RNase活性功能，保证RNA不被酶降解，缓冲液维持了RNA的缓冲环境，维持核酸的稳定，乙二胺四乙酸和乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸可以耦合二价金属离子，抑制RNA酶活性，抗坏血酸是可以使核酸在UV下保持稳定不被降解，二硫苏糖醇被用于蛋白质中二硫键的还原，促进病毒RNA外壳蛋白破裂，表面活性剂能溶解病毒RNA外壳蛋白中的脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，促进病毒RNA外壳蛋白破裂，从而灭活病原微生物。

本发明配制的样本灭活裂解试剂可用于咽拭子、口咽拭子、痰液和肺泡灌洗液、尿液或其他体液中，对于痰液和肺泡灌洗液、尿液或其他体液，优选用2倍体积的样本灭活裂解试剂，室温处理15-30分钟，所述的咽拭子、口咽拭子可以加入1-2mL样本裂解灭活试剂。该试剂中的异硫氰酸胍浓度较低，而表面活性剂、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸是常见的核酸提取用化学组分，所以不影响后续核酸提取，可以兼容市面上常见的硅膜离心柱核酸提取和基于硅磁珠的核酸提取，如Applied Biosystems^TM提供的MagMAX^TM Viral RNAIsolation Kit(CAT#AM1939),Thermo Scientific^TM提供的GeneJET Viral DNA/RNAPurification Kit(CAT#K0821)，Invitrogen^TM提供的Dynabeads^TM SILANE Viral NA Kit(CAT#37011D)以及Qiagen提供的

Viral RNA Mini(CAT#52904)等。令人意外的，本发明配制的样本灭活裂解试剂不仅适合于常规的核酸提取纯化，也适合于本发明专门替代常规核酸提取纯化的特异性靶标磁性捕获前处理技术，直接作为该技术的捕获杂交液，从灭活、裂解到后续的结合在一管中进行，无需额外添加其他试剂，极大节约了前处理的时间。

本发明中的“核酸提取”指核酸从样本中分离的过程，2019-nCoV为RNA病毒，核酸提取过程需要注意RNA的降解情况，市场上主流病毒RNA提取试剂盒一般基于硅膜的柱式法或者是磁珠法，对单个样的提取过程为30-60分钟不等，对90个样本的提取过程在60分钟至120分钟左右。上述的方法纯化出核酸不会都是目标靶核酸，可能会含有其他的DNA和RNA，如病患呼吸道、口腔中的脱落细胞中的基因组DNA、tRNA、rRNA、mRNA等，也可能是其他微生物的核酸，这是因为上述的提取试剂盒一般是针对总RNA，总核酸、总DNA，或者是总病毒RNA和DNA，即会包含丰度较高的非目标核酸。

本发明提供了特异性靶标磁性捕获前处理过程去替代传统的核酸提取纯化过程，上述目的是提供一种前处理时间短、无蛋白酶K和特异性捕获例如2019-nCoV的方法。

本发明从已经通过样本灭活裂解试剂处理过的“样本”捕获纯化2019-nCoV的方法包括如下步骤：

1)提供一种连接有特异性捕获探针的固相载体，上述的固相载体为由γFe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料合成的均一、超顺磁、单分散性多聚微球。优选地，每个微球体包被一层或者多层多聚材料，可通过乳液聚合、无皂聚合、分散聚合或种子溶胀聚合制备，最终形成磁性高分子微球，在磁性高分子微球表面修饰含有羧基、氨基、环氧基、甲苯磺酰基、氯甲基等活性基团或者是链霉亲和素蛋白。优选地，上述的磁性高分子微球的粒径为0.1-10μm，更为优选地，粒径为0.5-5μm，如Dynabeads M270 Streptavidin、Dynabeads MyOne StreptavidinT1、Merck

羧基磁珠M1-200/20、Merck/>

氨基磁珠M2-070/40、AgilentLodeStars 2.7 Carboxyl等可用于本发明。

本发明的磁性高分子微球(有时称为磁珠)可通过表面活性基团或者是链霉亲和素连接中间探针，中间探针5’修饰非核苷酸单元，非核苷酸单元可以与磁珠进行亲和结合或者是共价结合，若使用羧基磁珠则5’非核苷酸单元可以是氨基化的，可通过碳二亚胺的方法进行共价偶联，若使用链霉亲和素修饰的磁珠则5’修饰非核苷酸单元可以是生物素，中间探针的3’修饰寡聚核苷酸，可以是Oligo dT或者Oligo dU。所用Oligo dT或dU的选择取决于分离的目标靶核酸的下游用途，与载体结合的Oligo dU可以用于含有末端为dA的探针或者是靶核酸，这类似于Oligo dT的应用，但是还有另一个优点，Us提供了一个糖基化酶切位点。在一个优选的实施方案中，Oligo dT/dU构建体还包括另一个核苷酸序列(命名为“VN”，其中“V”是T以外的任何核苷酸(例如A、G、或C)，“N可以是包含T以内的任何核苷酸”)。这个另外的“VN”序列其辅助Oligo dT/dU探针序列与核酸结合的靶向或定位的作用。探针结合定位于PolyA尾与靶核酸目标序列之间的边界处是有利的。

本发明的中间探针的Oligo dT、Oligo dU、Oligo dT VN或Oligo dU VN的寡聚T或者寡聚U的数目优选为5-100，更为优选的，寡聚T或寡聚U的个数为10-50，如Oligo dT25，Oligo dT30VN，Oligo dT15VN都在本发明的保护范围之内。

本发明如采用链霉亲和素磁珠则中间探针可以是5’biotin Oligo(dT)₁₅ 3’，5’biotin-PEG-Oligo(dT)₁₈ 3’，5’biotin-Cn-Oligo(dT)₂₅ VN 3’，或5’biotin-Cn-Oligo(dU)₃₀ VN 3’。所述PEG的分子量可以是100-600，优选为100-200。Cn指的是具有n个碳原子的亚烷基，n一般可以是2-12。例如，C₆指的是6个碳的间接臂。PEG和Cn都是用来增加其间接臂的长度，优选在5-50个A°的长度，如10-30个A°的长度是优选的。

本发明如采用羧基磁珠则中间探针可以是5’NH₂-Cn-Oligo(dT)₁₈ 3’，5’NH₂-PEG-Oligo(dT)₂₅ 3’或5’NH₂-PEG-Oligo(dT)₂₃ VN 3’等，本发明可以通过EDC一步法，EDC/NHS两步法或EDC/SNHS两步法将羧基磁珠与氨基化的中间探针进行共价结合，对本领域的技术人员来说，此技术是容易掌握的。本发明也可以通过其他活化或者是有活性官能团的磁珠与中间探针进行共价偶联，如甲苯磺酰基、NHS基团、氯甲基、叠氮基团、氨基、环氧基等，当使用不同类型的官能团的磁珠，则对应的中间探针的5’需要进行共价反应的配对，如选择羧基磁珠，则中间探针的5’优选为氨基，如选择氨基磁珠，则中间探针的5’优选为羧基，优选地，本发明选择羧基磁珠或甲苯磺酰基磁珠。

本发明不管采用哪一种磁珠和中间探针进行共价反应或者是亲和连接，中间探针在磁珠上的基团密度优选进行控制，如磁珠的结合载量至少为100pmol/mg，200pmol/mg，300pmol/mg，400pmol/mg，500pmol/mg，更为优选地，磁珠的结合载量至少为750pmol/mg，最为优选地，磁珠的结合载量至少为1200pmol/mg。

如果使用一种以上的不同类型的结合配体(本发明中指中间探针)时，他们可以附着于相同或不同的固相载体上。使用不同的固相载体的这种系统特别适用于磁性颗粒的情况。因此，不同的结合配体可以附着于不同的磁珠。在使用一种以上的不同类型的结合配体的实施方案中，本领域的技术人员将很容易可以确定使用不同类型的结合配体的使用含量或比例。

2)本发明的磁珠首先连接一段中间探针，并通过中间探针与捕获探针进行结合，中间探针与捕获探针的结合方式为互补结合，即捕获探针的3’含有一段A序列，可以与Oligo dT、Oligo dU、Oligo dT VN或Oligo dUVN的5’的寡聚T或寡聚U进行互补结合，捕获探针的寡聚A序列的长度为10-50，更为优选的寡聚A序列的长度为10-30，而捕获探针的5’的序列可以与2019-nCoV的特异序列进行互补，所述的捕获探针可以与2019-nCoV靶核酸特异性结合，在含有内标时，其最好还可以与该内标序列特异性结合，所述的捕获探针通过磁珠-中间探针进行结合，形成了磁珠-中间探针-捕获探针复合物，此复合物具有高特异性，可从样本中抓取出2019-nCoV，而基本不吸附其他的核酸片段，通过洗涤后可以将其他的杂质，如蛋白质、脂质、糖、盐离子清洗干净，进而通过洗脱得到纯净的2019-nCoV，本发明可以不从磁珠上洗脱2019-nCoV，可直接带着磁珠-中间探针-捕获探针-2019-nCoV进行下游检测测试。

本发明中针对2019-nCoV的捕获探针分别为:SEQ ID NO.3为orf1ab基因上一段特异序列(5’uacgaagucagucgacuacguguuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3’)，SEQ ID NO.1为uacgaagucagucgacuacguguu；SEQ ID NO.4为编码N蛋白基因位置上一段特异的序列(5’ccguuaccgccacuacgacgagaacg aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3’)，SEQ ID NO.2为ccguuaccgccacuacgacgagaacg。上述的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中3’的A尾数目是10-30，在本发明中不应该被严格限制，该捕获探针均采用PAGE或者HPLC纯化方式进行纯化。

本发明上的捕获探针与中间探针具有一定的比例结合，中间探针与捕获探针的摩尔比应该为50:1～2:1，更为优选地，摩尔比为25:1～3:1，最为优选地，20:1～4:1。本发明的中间探针不可与捕获探针进行饱和结合，捕获探针最多不超过饱和结合载量的50％，即若中间探针在磁珠上的结合量为1000pmol/mg，在实验测试中，若捕获探针的最高结合载量为400pmol/mg，则捕获探针的加入量不可超过最高200pmol/mg。

在本发明中必需含有一定量的中间探针暴露在外面，优选地，没有结合捕获探针的中间探针含量需要超过100pmol/mg，更为优选地，需要超过200pmol/mg，这些暴露的中间探针可以有效特异地结合2019-nCoV 3’端的33个A尾。

因此，利用对于目标靶核酸表面上存在的分子或其他实体的了解，可以选择一种捕获探针的组合或者混合物，实现从样本中分离或分开目标靶核酸。有利的是，可以分离样本中存在的全部或基本上全部(即接近全部)目标靶核酸。可以实现的分离不仅取决于选择的捕获探针，而且取决于磁珠本身结合的捕获探针的含量，磁珠的性质(粒径、表面基团和亲水性等)、也取决于样本的性质、结合条件等。另外，生物系统的性质是可变的，不总是能够达到100％的分离，实际上根据本发明这也不是必需的；在任何生物系统中，必需允许一定的容许度。然后在本发明的优选实施方案中，可以分离样本中存在的至少40％、50％、60％、75％、80％、90％或95％的目标靶核酸。

3)提供一种磁性特异性捕获2019-nCoV的试剂盒以替换传统的核酸提取前处理步骤，具体成分包括已制备好的磁珠-中间探针-捕获探针复合物(以下简称捕获磁珠)，捕获磁珠保存液、结合缓冲液、洗涤液W1、洗涤液W2和洗脱液。

本发明中使用20-1000μg捕获磁珠针对200-2000μL的已灭活裂解样本，上述需含有捕获探针量为0.01-1μmoL。捕获磁珠的保存液含有一定浓度的BSA、NaN₃和结合缓冲液，BSA和NaN₃与常规磁珠保存液中的浓度一致即可，如Invitrogen公司、Promega公司、Roche公司等生产的磁珠的保存液。所述的结合缓冲液有助于捕获探针与目标靶核酸进行捕获杂交，结合缓冲液由氯化锂、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、乙二胺四乙酸、柠檬酸以及去离子水组成，pH范围为6.0-8.0，其各组分的含量为：0.02-5M氯化锂，0.02-5％十二烷基硫酸锂，0.05-5％Triton X-1000，1-100mM乙二胺四乙酸，0.02-0.2M柠檬酸。本发明中所述的洗涤液W1的组分为：100mM琥珀酸盐、0.5％十二烷基硫酸锂、100mM LiOH、15mM 2,2'-二硫基二吡啶、0.2M LiCl、5mM EDTA、5mM EGTA、3％(v/v)无水乙醇，pH6.5。洗涤液W2的组分为：20mM HEPES、7.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3％(v/v)无水乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯、50mM氯化锂、0.1％十二烷基硫酸钠，pH7.5。通过所述的洗涤液W1和W2清洗捕获磁珠和靶核酸的复合物，最终在洗脱液中进行洗脱，洗脱液可以是1mM EDTA，2mM乙酸钠pH6.5的混合溶液，或者是常规的TE buffer或者是Low TE buffer。

在使用分离方法中使用试剂，如醇、离液盐、有机溶剂(如苯酚、异戊醇和氯仿)和高盐等，有时是不利的。本发明具有可以避免使用这些试剂的特点，或使用非常少量的上述试剂，在传统的核酸提取中会用到使用高浓度的离液盐和一种醇类，经常是异丙醇进行结合，使用70％乙醇、75％乙醇或80％乙醇进行清洗。虽然本发明中也可以使用上述这些试剂，但在本发明的有利实施方案中，基本不使用这些试剂。

本发明因不是传统的核酸提取步骤，因此不需再额外添加裂解液，这节约时间的基础上额外增加了另一个优势，增加上样量，传统的方法一般取拭子保存液为200-400μL，然后再加入等体积的裂解液和一定量的结合液，整个体系将近1mL，超过1mL则不适合96位自动化的工作站(使用96孔板操作)，而本发明因无需在捕获阶段添加裂解液，而选择添加少量的捕获磁珠和结合缓冲液，可以将拭子保存液的上样量提高2倍左右，这样可以大大增加PCR过程中的模板量。

本发明利用捕获磁珠进行特异性富集靶核酸的方法有利于适合自动化，特别是使用磁性颗粒作为固相载体时。在本发明的一个特别有利的实施方案中，使用一种自动化系统实现核酸的磁性捕获分离方法，该系统用于在病毒裂解之后与核酸进行靶向捕获以及洗涤和洗脱步骤过程中处理固相载体。例如与载体分离的靶核酸可以转移到这样的一种自动化系统中，该系统中有磁体可以转移磁性颗粒，可以进行结合、洗涤、洗脱，适当地根据方法的具体步骤和所用的具体载体和条件，靶核酸可以与载体结合，使用这种自动化的装置可以容易地洗下未结合的核酸或者蛋白质。此外，这种装置也可以用来处理样本的裂解、灭活处理过程。因此，可以看出，可以随心所欲地选择将该方法的所有步骤都自动化。

本发明还提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

在前处理之后，通过使用限定体外酶介导的核酸合成而扩增的区域的5'端和3'端的引物来实现2019-nCoV靶核酸的扩增以产生扩增子(有时称为扩增产物)。本发明优选使用实时荧光恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)方法，该方法可以产生大量的可检测的扩增产物(RNA转录物)，属于等温扩增的一种技术。引物组合包含基于启动子序列的启动子引物(正向引物)和基于非启动子序列的反向引物。优选地，基于启动子序列的正向引物为包含5'RNA聚合酶启动子序列和3'靶标结合序列的启动子引物即正向引物。RNA聚合酶启动子序列在本领域中已知包括但不限于sp6 RNA聚合酶启动子序列、T3 RNA聚合酶启动子序列以及T7 RNA聚合酶启动子序列。在优选的一些实施方式中，启动子引物包含5'T7 RNA聚合酶启动子序列和3'靶标结合序列。最优选地，5'T7 RNA聚合酶启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA(如SEQ ID NO.5所示)。

进一步，所述检测试剂盒还包含有扩增反应试剂和/或混合酶试剂。例如，典型的25μL扩增反应体系可以使用12.5μL的扩增反应试剂、2.5μL引物探针混合液和5.0μL混合酶试剂，靶核酸加入量为5μL，总反应体系为25μL。

本发明的2×扩增反应缓冲液组成为：10.5mM Tris-HCl、15.2mM MgCl₂、0.2％PVP40、13.5mM KCl、2.5％甘油、0.05mM醋酸锌二水合物、各0.725mM dNTP、各5.56mM NTP，pH7.0。

本发明的检测液组成为：将2019-nCoV扩增引物和2019-nCoV检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.5)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7启动子引物浓度优选为6.5pmol/反应，检测探针浓度优选为5.5pmol/反应。

本发明的混合酶试剂包含500-1000U的T7 RNA聚合酶、1000-2000U逆转录酶、15mMHEPES、50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、1mM EDTA、0.05％(w/v)叠氮化钠、1％TritonX-100、50mM KCl、20％(v/v)甘油、200mM海藻糖二水合物，pH7.0。本发明优选与保留在捕获磁珠上的靶核酸混合。扩增检测用到的引物和探针可以如下所示：

SEQ ID NO.6:ORF1ab反向引物序列：TGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTA；

SEQ ID NO.7:ORF1abT7启动子引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGATTGTGCATCAGCTGA；

SEQ ID NO.10:ORF1ab探针序列：5’-acacagucuguaccgucugcggugugu-3’，ORF1ab探针为5’FAM-acacagucuguaccgucugcggugugu-3’DABCYL。

SEQ ID NO.8:N反向引物序列：TTCCTCATCACGTAGTCGCAACAG

SEQ ID NO.9:N启动子引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGACAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

SEQ ID NO.11:N探针序列：5’-aauggcggugaugcugcucuugcuuugccauu-3’，N探针为5’VIC-aauggcggugaugcugcucuugcuuugccauu-3’DABCYL。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：

灭活裂解液的配制：

按照如下组分和浓度采用去离子水配制灭活裂解液：0.2M铵盐，2M异硫氰酸胍，0.5M氯化锂，20mM乙二胺四乙酸，50mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.2％TritonX-100，0.5％十二烷基硫酸锂，50mM抗坏血酸，0.5％二硫苏糖醇，100mM HEPES缓冲液，pH5.5。

将已知浓度的假病毒分别加入200μL上述灭灭活裂解液和PBS溶液中，常温震荡20分钟后，使用Invitrogen^TM提供的Dynabeads^TM SILANE Viral NA Kit进行验证，对已经使用上述灭活裂解液的不再加入Invitrogen^TM试剂盒中的裂解试剂，不使用此试剂盒的裂解液和裂解步骤，直接进行提取并进行用常规RT-PCR进行检测，结果显示两者没有显著差别，这证明实施例1的灭活裂解试剂可以充分裂解假病毒，可以将目标RNA释放出来。同时本发明人与常规的VTM病毒保存液进行25度常温稳定性试验验证。验证结果表明，样本灭活裂解试剂对病毒RNA具有较好的保护作用(表1)。

表1:灭活裂解液对RNA的稳定性测试

样品	立即检测	1天	2天	3天
					本发明灭活裂解液	26.7	26.8	27.1	27.4
Invitrogen试剂盒裂解液	27.1	27.8	28.9	34.0
					VTM病毒保存液	26.6	28.9	31.5	35.2

实施例2：中间探针序列的合成

委托生工生物工程(上海)有限公司合成SEQ ID NO.3至11以及以下中间探针序列：

5’biotin Oligo(dT)₁₅ 3’

5’biotin-C6-Oligo(dT)₂₅ VN 3’

5’NH₂-C6-Oligo(dT)₃₀ 3’

实施例3：捕获磁珠Capture MB-1的制备

10mg Dynabeads MyOne Streptavidin T1(来源于Invitrogen公司)使用PBS清洗两次，重悬于500μL5X SSC缓冲液中，加入10μmol 5’biotin Oligo(dT)₁₅ 3’的中间探针，室温反应30分钟后，磁性分离，上清液检测剩余的探针含量。磁珠-中间探针使用2X SSCbuffer清洗5次，最终保存在，含有0.1％防腐剂，0.05％Tween20的PBS缓冲液中暂存，检测上述的磁珠上的探针含量为935pmol/mg，在上述的10mg磁珠-中间探针的缓冲液中加入800pmol SEQ ID NO.3和800pmol SEQ ID NO.4，室温反应30分钟后，磁性分离，上清液检测剩余的探针含量为零，即所有捕获探针都已经结合至上述磁珠表面，以制备好捕获磁珠Capture MB-1。

实施例4：捕获磁珠Capture MB-2的制备

使用和实施例3一致的方法，还是采用10mg Dynabeads MyOne Streptavidin T1，但中间探针替换为5’biotin-C₆-Oligo(dT)₂₅ VN 3’并进行饱和结合，并计算得结合载量为712pmol/mg，在上述的10mg磁珠-中间探针的缓冲液中加入600pmol SEQ ID NO.3和600pmol SEQ ID NO.4，并检测上清液中的捕获探针含量为零，制备好捕获磁珠CaptureMB-1。

实施例5：捕获磁珠Capture MB-3的制备

使用10mg Merck

羧基磁珠M1-200/20用去离子水清洗两次再用PBS清洗两次后将其重悬于1mL 50mM MES pH6.0的缓冲液中，加入10μmol 5’NH₂-C₆-Oligo(dT)₃₀3’室温混匀30分钟后加入新鲜配置的100μL 100mg/mL EDC溶液(事先溶解于MES溶液)继续反应1小时候，磁性分离去除上清液后(上清液需测试核酸浓度)，加入1mL 1M Tris-HClpH7.2封闭2小时，最后用2X SSC清洗5遍得磁珠-中间探针复合物，并计算得上述的中间探针的结合载量为1650pmol/mg，在上述的10mg磁珠-中间探针的缓冲液中加入1200pmol SEQID NO.3和1200pmol SEQ ID NO.4，并检测上清液中的捕获探针含量为零，制备好捕获磁珠Capture MB-3。

实施例6：磁性特异性捕获2019-nCoV的试剂盒前处理试剂

磁珠悬液：2mg/mL捕获磁珠(Capture MB-1，Capture MB-2或Capture MB-3)，溶解于0.05％NaN₃，0.5％BSA的2X SSX缓冲液中。

结合缓冲液：1M氯化锂，1％十二烷基硫酸锂，0.5％Triton X-1000，50mM乙二胺四乙酸，0.2M柠檬酸，pH6.5。

洗涤液W1：100mM琥珀酸盐、0.5％十二烷基硫酸锂、100mM LiOH、15mM 2,2'-二硫基二吡啶、0.2M LiCl、5mM EDTA、5mM EGTA、3％(v/v)无水乙醇，pH6.5

洗涤液W2：20mM HEPES、7.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3％(v/v)无水乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯、50mM氯化锂、0.1％十二烷基硫酸钠，pH7.5

针对1mL灭活裂解样本，使用100μL 2mg/mL捕获磁珠，200μL结合缓冲液，洗涤液W1和洗涤液W2都为500μL，上述的体积可以随着灭活裂解样本的加样量体积线性增加或者减少。捕获磁珠-靶核酸的复合物最终分散于50μL 10mM Tris,pH7.2中以备检测。

实施例7：SAT扩增

本发明的2×扩增反应buffer组成为：10.5mM Tris-HCl、15.2mM MgCl₂、0.2％PVP40、13.5mM KCl、2.5％甘油、0.05mM醋酸锌二水合物、各0.725mM dNTP、各5.56mM NTP，pH7.0。

本发明的检测液组成为：引物浓度为6.5pmol/反应，检测探针浓度为5.5pmol/反应。

本发明的混合酶试剂包含1000U的T7 RNA聚合酶、1500U逆转录酶、15mM HEPES、50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、1mM EDTA、0.05％(w/v)叠氮化钠、1％TritonX-100、50mMKCl、20％(v/v)甘油、200mM海藻糖二水合物，pH7.0。

典型的25μL扩增反应液使用12.5μL的扩增反应buffer、2.5μL引物探针混合液和5.0μL混合酶试剂，靶核酸加入量为5μL，总反应体系为25μL。

取5μL捕获磁珠-靶核酸的复合物悬液至新的微量反应管中，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将混合酶试剂也预热到42℃，将上述5μL捕获磁珠-靶核酸的复合物，5.0μL混合酶试剂，5μL引物探针混合液和加入到12.5μL扩增反应buffer中，将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃反应42分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。读取dt值，dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

结果判定如下：N基因和OFR1ab基因同时阳性，则证明该样本为阳性；N基因和OFR1ab基因同时阴性或一阴一阳，则证明该样本为阴性。

N基因和OFR1ab管的阳性判断，dt≤35的样本为阳性，35-42的样本建议重新检测，dt无数值或为42则为阴性。

实施例8：检测试剂盒的灵敏度检测

用含有N基因和ORF1ab基因的假病毒样本(1X10⁶/μL)按照10倍梯度稀释，加入1mL至灭活裂解液中，捕获磁珠使用实施5制备的Capture MB-3，磁性靶向捕获流程按照实施例6处理，SAT扩增按照实施例7进行操作，结果显示如图1、2和3所示，整个试剂对ORF1ab基因的灵敏度可以达到25copies/反应，对N基因的灵敏度可以达到50copies/反应，这说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州白垩纪生物科技有限公司

<120> 一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其应用

<130> GY20100861F

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

uacgaaguca gucgacuacg uguu 24

<210> 2

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccguuaccgc cacuacgacg agaacg 26

<210> 3

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 3

uacgaaguca gucgacuacg uguuaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50

<210> 4

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccguuaccgc cacuacgacg agaacgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 51

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

taatacgact cactataggg aga 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtgacttaa aaggtaagta tgta 24

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

taatacgact cactataggg agaacgattg tgcatcagct ga 42

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttcctcatca cgtagtcgca acag 24

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

taatacgact cactataggg agacagacat tttgctctca agctg 45

<210> 10

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 10

acacagucug uaccgucugc ggugugu 27

<210> 11

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 11

aauggcggug augcugcucu ugcuuugcca uu 32

Claims

1.一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（i）2×扩增反应缓冲液；（ii）混合酶试剂；和（iii）扩增检测试剂；

其中，2×扩增反应缓冲液的组成为：10.5mM Tris-HCl、15.2mM MgCl₂、0.2%PVP 40、13.5mM KCl、2.5%甘油、0.05mM醋酸锌二水合物、各0.725mM dNTP、各5.56mM NTP，pH7.0；

所述混合酶试剂的组成为500-1000U 的T7 RNA 聚合酶、1000-2000U逆转录酶、15mMHEPES、50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、1mM EDTA、0.05%(w/v)叠氮化钠、1% TritonX-100、50mM KCl、20％(v/v)甘油、200mM 海藻糖二水合物，pH7.0；

所述扩增检测试剂包含Tris、EDTA、用于扩增靶核酸的引物对和探测靶核酸探针；

所述引物对包括基于RNA聚合酶启动子序列的正向引物和基于非RNA聚合酶启动子序列的反向引物，所述正向引物包含位于5'末端的RNA 聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列，所述反向引物包含反向靶核酸结合序列；

所述RNA聚合酶启动子序列为T7 RNA 聚合酶启动子序列；

所述正向引物包含位于5'末端的T7 RNA 聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列；

所述位于5'末端的T7 RNA 聚合酶启动子序列为SEQ ID NO. 5所示的序列；

所述试剂盒的靶标为ORF1ab基因和N基因，针对ORF1ab基因的反向引物如SEQ ID NO.6所示，针对ORF1ab基因的正向引物如SEQ ID NO.7所示，针对ORF1ab基因的探针如SEQ IDNO. 10所示；针对N基因的反向引物如SEQ ID NO.8所示，针对N基因的正向引物如SEQ IDNO.9所示，针对N基因的探针如SEQ ID NO. 11所示。

2.根据权利要求1所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

在扩增反应体系为25μL的情况下，所述扩增反应体系包含12.5μL的扩增反应试剂、2.5μL的引物探针混合液和5.0μL混合酶试剂，靶核酸加入量为5μL。

3.根据权利要求1所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

利用所述检测试剂通过如下方式配制检测液：将用于扩增靶核酸的引物对和探测靶核酸探针溶解在TE 溶液中配制而成，所述TE 溶液包含10mM Tris和1mM EDTA, pH7.5。

4.根据权利要求1所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：各引物和探针浓度在5-10pmol/ 反应。

5.根据权利要求1所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

T7启动子引物的浓度为6.5pmol/ 反应，检测探针的浓度为5.5pmol/ 反应。

6.一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括；

（1）病毒样本灭活裂解试剂盒；

（2）靶核酸磁性捕获试剂或靶核酸捕获试剂盒；

（3）权利要求1至5中任一项所述的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述靶核酸磁性捕获试剂包括：

（1）作为固相载体的磁性高分子微球，所述磁性高分子微球包括由γFe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料制成的微球体和包被所述微球体的一层或多层多聚材料，并且所述磁性高分子微球的表面修饰有微球连接基团；

（2）中间探针，所述中间探针包括5’修饰非核苷酸单元、3’修饰寡聚核苷酸单元和可选的中间臂，并且所述中间探针通过所述微球连接基团与所述5’修饰非核苷酸单元结合来与所述磁性高分子微球连接；

（3）捕获探针，所述捕获探针包括与靶核酸特异性互补的5’特异性序列和3’polyA序列。

8.根据权利要求7所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述靶核酸为表征目标微生物存在的特异性序列。

9.根据权利要求8所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述目标微生物为2019-nCoV。

10.根据权利要求7所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述3’polyA序列的长度为10-50碱基。

11.根据权利要求10所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述3’polyA序列的长度为10-30碱基。

12.根据权利要求7所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述多聚材料通过乳液聚合、无皂聚合、分散聚合或种子溶胀聚合来包被所述微球体；

所述磁性高分子微球的粒径为0.1-10μm；

所述微球连接基团为活性基团或亲和蛋白；

所述5’修饰非核苷酸单元选自由氨基、羧基和生物素组成的组；

所述3’修饰寡聚核苷酸单元选自由Oligo dT、Oligo dU、Oligo dT VN或Oligo dU VN组成的组，其中，V选自由A、G和C组成的组，并且N选自由T、A、G和C组成的组；

所述可选的中间臂为PEG和/或Cn，其中PEG的分子量为100-600；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基；所述中间臂的长度为5-50Å；和/或

所述捕获探针为针对2019-nCoV的捕获探针，并且所述5’特异性序列为orf1ab基因上的特异性序列和/或N蛋白基因位置上的特异性序列。

13.根据权利要求12所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的粒径为0.5-5μm；

所述亲和蛋白为链霉亲和素；所述活性基团选自由羧基、氨基、环氧基、NHS基团、叠氮基团、甲苯磺酰基和氯甲基组成的组；

所述3’修饰寡聚核苷酸中的寡聚T或者寡聚U中的核苷酸数目为5-100；

所述可选的中间臂为PEG和/或Cn，其中PEG的分子量为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，n为2-12；所述中间臂的长度为10-30Å；和/或

所述5’特异性序列如SEQ ID NO. 1和/或SEQ ID NO.2所示。

14.根据权利要求13所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述捕获探针如SEQ ID NO. 3和/或SEQ ID NO.4所示。

15.根据权利要求13所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球为选自由Dynabeads M270 Streptavidin、Dynabeads MyOneStreptavidin T1、Merck Estapor® 羧基磁珠 M1-200/20、Merck Estapor® 氨基磁珠M2-070/40、Agilent LodeStars 2.7 Carboxyl组成的组；

所述活性基团为羧基或甲苯磺酰基；

所述3’修饰寡聚核苷酸中的寡聚T或者寡聚U中的核苷酸数目为10-50；和/或

所述捕获探针如SEQ ID NO. 3和/或SEQ ID NO.4所示。

16.根据权利要求12所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述微球连接基团为链霉亲和素，5’修饰非核苷酸单元为生物素；所述中间探针选自由5’biotin Oligo (dT)₁₅3’、5’biotin-PEG-Oligo (dT)₁₈3’、5’biotin-Cn-Oligo(dT)₂₅VN 3’和5’biotin-Cn-Oligo (dU)₃₀ VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-600；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基；

或者

所述微球连接基团为羧基，所述5’修饰非核苷酸单元为氨基；

或者

所述微球连接基团为氨基，所述5’修饰非核苷酸单元为羧基。

17.根据权利要求16所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述中间探针选自由5’biotin Oligo (dT)₁₅3’、5’biotin-PEG-Oligo (dT)₁₈3’、5’biotin-Cn-Oligo (dT)₂₅VN 3’和5’biotin-Cn-Oligo (dU)₃₀ VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，n为2-12；

或者

所述微球连接基团为和所述5’修饰非核苷酸单元通过EDC一步法、EDC/NHS两步法或EDC/SNHS两步法将带有羧基的磁性高分子微球与氨基化的中间探针进行共价结合。

18.根据权利要求17所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述中间探针选自由5’NH₂-Cn-Oligo (dT)₁₈3’、5’NH₂-PEG-Oligo (dT)₂₅3’和5’NH₂-PEG-Oligo (dT)₂₃VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-600；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基。

19.根据权利要求17所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述中间探针选自由5’NH₂-Cn-Oligo (dT)₁₈3’、5’NH₂-PEG-Oligo (dT)₂₅3’和5’NH₂-PEG-Oligo (dT)₂₃VN 3’组成的组，其中PEG的分子量为100-200；Cn表示具有n个碳原子的直链亚烷基，n为2-12。

20.根据权利要求7至19中任一项所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为至少100pmol/mg；

所述中间探针与捕获探针的摩尔比为50:1~2:1；和/或

没有结合所述捕获探针的中间探针的含量大于100pmol/mg。

21.根据权利要求20所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为至少200 pmol/mg；

所述中间探针与捕获探针的摩尔比为25:1~3:1；和/或

没有结合所述捕获探针的中间探针的含量大于200pmol/mg。

22.根据权利要求21所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为400 pmol/mg；和/或

所述中间探针与捕获探针的摩尔比为20:1~4:1。

23.根据权利要求20所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为至少500 pmol/mg。

24.根据权利要求23所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为至少750 pmol/mg。

25.根据权利要求24所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述磁性高分子微球的结合载量为至少1200 pmol/mg。

26.根据权利要求6至19中任一项所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述靶核酸捕获试剂盒包含结合缓冲液、保存液、洗涤液W1、洗涤液W2、洗脱液和靶核酸磁性捕获试剂；

所述结合缓冲液由氯化锂、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、乙二胺四乙酸、柠檬酸以及水组成，pH范围为6.0 - 8.0；

所述保存液由BSA、NaN₃ 和所述结合缓冲液制得；

所述洗涤液W1包含100mM 琥珀酸盐、0.5%十二烷基硫酸锂、100mM LiOH、15mM 2,2'-二硫基二吡啶、0.2M LiCl、5mM EDTA、5mM EGTA、3%(v/v) 无水乙醇，pH6.5；

所述洗涤液W2包含20mM HEPES、7.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3%(v/v) 无水乙醇、0.02%(w/v) 对羟基苯甲酸甲酯、0.01%(w/v) 对羟基苯甲酸丙酯、50mM 氯化锂、0.1% 十二烷基硫酸钠，pH7.5；

所述洗脱液包含1mM EDTA和2mM 乙酸钠，pH6.5；

所述靶核酸磁性捕获试剂包括：

27.根据权利要求26所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述结合缓冲液的其各组分的含量如下：0.02-5M氯化锂，0.02-5% 十二烷基硫酸锂，0.05-5% Triton X-1000，1-100mM乙二胺四乙酸，0.02-0.2M柠檬酸，余量为水。

28.根据权利要求6至19中任一项所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述病毒样本灭活裂解试剂盒包括用于配制灭活裂解液的如下试剂：铵盐、异硫氰酸胍、氯化锂、乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂、抗坏血酸、二硫苏糖醇和缓冲剂。

29.根据权利要求28所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述铵盐选自由硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵和碘化铵组成的组。

30.根据权利要求29所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述铵盐为氯化铵；所述表面活性剂选自由Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠、Tween 20、Triton X-100、NP40、十二烷基肌氨酸钠和CTAB组成的组；和/或所述缓冲剂选自由Tris碱、磷酸盐和HEPES组成的组。

31.根据权利要求30所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述表面活性剂为TritonX-100和十二烷基硫酸锂的组合。

32.根据权利要求29所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述灭活裂解液用水配制，并且包含0.01-2M铵盐，0.5-2M异硫氰酸胍，0.1-0.5M氯化锂，5-50mM乙二胺四乙酸，1-20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.1-5%表面活性剂，10-500mM抗坏血酸，0.5-5%二硫苏糖醇和20-500mM缓冲剂。

33.根据权利要求29所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述灭活裂解液中的铵离子的浓度为0.05M 至0.5M；所述灭活裂解液中的表面活性剂为0.2% TritonX-100和0.5% 十二烷基硫酸锂的组合；和/或所述缓冲剂为HEPES。

34.根据权利要求33所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述灭活裂解液中的铵离子的浓度为0.1M 至0.4M；和/或所述缓冲剂为HEPES，HEPES的浓度为50-200mM。

35.根据权利要求34所述的病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：

所述灭活裂解液中的铵离子的浓度为0.1M 至0.2M；和/或所述灭活裂解液的pH值为5-6.5。