CN102453756A - 一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，该试剂盒含有下述试剂:试剂A：DNA提取液；试剂B：普通PCR反应液，特异引物5’-CGGCGGCTGCTGGCTTTAT-3’和5’-GCTCAGACCGAAGTCCAAACG-3’，试剂C：RealTimePCR反应液；试剂D：标准菌株DNA液。使用本试剂盒，可快速、灵敏、准确地定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量。

Description

一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，试剂盒含特异引物和土壤DNA提取以及进行实时定量PCR相关的试剂，可以定量、特异检测土壤中马铃薯晚疫病病菌量，属农业生物技术领域。

背景技术

马铃薯晚疫病是马铃薯的一种毁灭性病害，己列为世界粮食作物第一大病害。晚疫病在马铃薯种植区普遍发生，田间产量损失达20％～50％，窖藏损失可达5％～30％，大流行年份甚至会造成绝收。近年来，晚疫病的流行频率和流行程度逐渐加重，成为马铃薯生产的一个重要障碍。马铃薯是世界第四大粮食作物(Reader,2009)，世界马铃薯晚疫病造成的损失已达67亿美元（Haverkort et al., 2008）中国已是世界上马铃薯生产的第一大国，中国每年因晚疫病损失高达10亿美元。

马铃薯晚疫病，主要由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起。这种病菌主要以卵孢子和游动孢子的形式在土壤中的带病块茎，残根中过冬、越夏。在适宜的环境条件下，晚疫病菌产生孢子囊随气流传播侵染周围的植株。因而土壤只要含有一定数量病菌或种下极少数的带菌种薯，可能会导致整片地晚疫病的发生（Andrivon, 1995；Zwankhuizen et al., 1998）。因此对种植马铃薯土壤晚疫病菌带菌量进行快速特异性检测，对晚疫病的发生与流行进行预测和防治尤为关键，也是跟踪马铃薯生长过程中晚疫病发生过程进而有效预防病害的主要措施（Zwankhuizen et al., 1998）。

目前检测土壤和种薯晚疫病菌带菌量的主要方法和技术有：①田间检测方法，此法通过观察马铃薯晚疫病引起的主要组织症状作为检测鉴定证据,只有马铃薯组织发生明显的症状时才能进行检测，准确性较差，耗时费力（GB7331-2003中5.1.1.2）；②实验室检测方法，该法利用马铃薯主要致病菌的生理生化特点，通过显微镜、病原菌复苏培养及生化等手段来检测。准确性较田间检测方法高，但检测周期长，对于晚疫病的预防检测滞后（GB6682）。③分子生物学方法（Judelson and Tooley, 2000; Niepold and Schober–Butin, 1995; Tooley., 1997; Trout et al., 1997），这些方法都是利用P.infestans 基因组DNA序列设计引物，来检测马铃薯叶片、块茎等P. infestans的含量，如Niepold等设计引物检测接种晚疫病菌后的马铃薯块茎和叶片，但这种方法只能检测接种马铃薯组织的晚疫病菌，灵敏度较低(Niepold and Schober–Butin., 1995)；Trout 等(Trout et al., 1997)利用引物ITS5和PINF来检测天然薯块中的晚疫病菌，灵敏度较高，但特异性较差。Judelson和Tooley根据晚疫病菌全基因组中重复序列设计引物，这种引物能扩增P. infestans的ITS（Internal Transcribed Spaces）序列，特异性高(Judelson and Tooley, 2000)。但该研究并没有直接用于马铃薯晚疫病种薯及叶带菌的检测。徐安传等设计引物08-3和08-4，分别检测马铃薯种薯不同部位晚疫病潜伏情况，灵敏性和特异性均比较高（徐安传等，2004），但没有实现对马铃薯种植区土壤中的晚疫病菌进行检测。

目前检测种薯和叶片晚疫病菌带菌量的试剂盒有：①马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法，这种检测方法主要设计了一对马铃薯晚疫病菌的特异引物（上游引物INF1和下游引物INF2），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在马铃薯晚疫病菌纯DNA、带菌的植株和薯块中特异性地扩增出片段长度为324bp的特异扩增产物（申请号/专利号： 200910111735）。但是这种方法，不能为马铃薯生产中晚疫病的检测提供量化指标。最重要的是，作为晚疫病蛰伏和传播的主要场所-土壤中带菌量的检测尚没有有效的检测方法。

综合以上分析可以看出，现有技术无法快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤马铃薯晚疫病病菌数目，因而无法有效跟踪马铃薯生长过程中晚疫病发生过程、并据此提出有效预防病害措施。

鉴于现有技术缺陷，本发明提供了一种快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤中马铃薯晚疫病活体病菌的试剂盒，该试剂盒由特异引物和分子生物学试剂组成，可以快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量，满足人们防治马铃薯晚疫病的生产需要。

 

参考文献：

Andrivon D. Biology, ecology and epidemiology of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil. Phytopathology, 1995, 85 : 1053-1056.

Haverkort AJ. et al. Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification. Potato Res. 2008, 51：47-57.

Judelson HS., and Tooley PW. Enhanced PCR methods for detection and quantification of Phytophthora infestans in plants. Phytopathology, 2000, 90:1112-1115. 

Niepold F.B. and S. Butin. Application of the PCR technique to detect Phytophthora infestans in potato tubers and leaves. Microbiol Res, 1995, 150: 379-385.

Reader J. Potato: A History of the Propitious Esculent. 2009 Yale Univ. Press.

Tooley P.W., Bunyard B.A., Carras MM. and Hatziloukas E. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes. Appl. Environ. Microbiol, 1997, 63:1467-1475.

Trout C.L., Ristaino J.B., Madritch M. and Wangsomboondee T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight potatoes and tomatoes using PCR. Plant Dis, 1997, 81:1042-1048.

Wangsomboondee T. and Ristaino JB. Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phythphtoora infestans. Plant Dis.2002, 86 （3）:247-253.

Zwankhuizen M.J.F.，Govers J.C., Zadoks. Development of potato late blight eipidemics: disease foci, disease gradients and infeciton sources. Phytopathology, 1998 , 88 : 754-763. 

徐安传, 罗文富, 杨艳丽. 赵海燕马铃薯晚疫病种薯带菌的分子检测. 中国马铃薯，2004, 18(2): 72-76.

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒。其特征在于该试剂盒含有以下几种试剂:

①、试剂A：

DNA提取液：100 mmol/L，Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA,100 mmol/L磷酸钠,1.5mol/L NaCl, 2% CTAB,pH8.0。

②、试剂B: 

普通PCR 反应液：10×Tris-HCl缓冲液（pH8.3，500mM KCl,15mM MgCl₂）；dNTP（2.5mM）；Taq酶（5U/μl）以及Blotto（10%脱脂奶粉和0.2% NaN₃）。

特异性引物：浓度10μM，序列为：

正向引物(PIF): 5’- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3’；

反向引物(PIR): 5’- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3’

③、试剂C：

Real Time PCR反应液：SYBR-Green荧光标记试剂混合物（SYBR green PCR Master Mix，Applied Biosystems)

④试剂D：

标准菌株（P.infestans ATCC）DNA液：浓度为100ng/μl。

该试剂盒可用于定量检测土壤中晚疫病菌带菌量。

该试剂盒使用方法如下：

①、标准曲线的构建过程：用试剂D，10倍稀释DNA至10²ng/μl，10ng/μl，1ng/μl， 10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl；在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板1μl(浓度分别为10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl)，加入试剂C 10μl，以及试剂B 中的特异性引物PIF/PIR（10μM）各0.5μl，无菌去离子水至总体积20μl。每个反应做3个平行实验。实时荧光定量PCR仪的设置程序为：50℃-5 min, 95℃-10 min；然后以95℃-20s，60℃-1min，循环35次；最后在72℃保温5min。整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃/s，从60℃增加到95℃。反应结束后，导出EXCEL表格，根据反应的溶解曲线判断每个样品的扩增效率，每组反应取平均值，舍弃Ct大于30的反应（thresholds cycles，Ct），以DNA模板含量的log值为横坐标，反应Ct为纵坐标作图，并计算曲线的相关性，R²≥0.99认为相关性好，扩增结果可信。

②、取土壤0.5克，加入试剂盒内的试剂A1.2ml，按照CTAB法提取DNA，通过紫外分光光度法测定提取DNA的质量，标准为OD260/280为1.8左右，作为下几步的DNA模板。

③、在扩增管中加入DNA模板2μl(50ng)，加入试剂盒内试剂B缓冲液3μl；dNTP（2.5mM）2μl；特异引物（PIF/PIR, 10μM）各1μl；Taq酶（5U/μl）0.2μl以及2% Blotto（10%脱脂奶粉和0.2% NaN₃），加入无菌去离子水至总体积25μl。

④、对上述反应体系进行普通PCR扩增，具体程序为： 95℃-4min；然后以95℃-55s，60℃-1min，72℃-45s，循环40次；最后在72℃保温5min。

⑤、将扩增后的样品在琼脂糖凝胶电泳检测，看101bp处有无条带，若有，说明有马铃薯晚疫病菌存在，若没有发现明显扩增条带，说明该菌不存在或含量很低。

⑥、在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板1ul(浓度分别为10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl)，加入试剂盒内试剂C 10μl，以及试剂B 中的特异性引物PIF/PIR（10μM）各0.5 μl，无菌去离子水至总体积20μl。

⑦、对上述反应体系进行Real Time PCR扩增，具体程序为：50℃-5min,95℃-10min；然后以95℃-20s，60℃-1min，循环35次；最后在72℃保温5min。整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃/s，从60℃增加到95℃。

⑧、检测样品得到的Ct值，通过Ct=-3.3282log[DNA]+31.994计算得到相应的样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量。由于土壤样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量与土壤中晚疫病菌带菌量成正比，所以可以通过土壤样品马铃薯晚疫病菌DNA含量的高低间接定量土壤样品马铃薯晚疫病菌带菌量的高低，从而达到定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的目的。

  

具体实施方式：

实施例1 标准曲线的构建过程

用试剂D，10倍稀释至10²ng/μl，10ng/μl，1ng/μl， 10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl；在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板1μl(浓度分别为10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl)，加入试剂C 10μl，以及试剂B 中的特异性引物PIF/PIR（10μM）各0.5μl，无菌去离子水至总体积20μl。每个反应做3个平行实验。实时荧光定量PCR仪的设置程序为：50℃- 5 min, 95℃- 10 min；然后以95℃- 20s，60℃-1min，循环35次；最后在72℃保温5min。整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃/s，从60℃增加到95℃。反应结束后，导出EXCEL表格，根据反应的溶解曲线判断每个样品的扩增效率，每组反应取平均值，舍弃Ct大于30的反应（thresholds cycles，Ct），以DNA模板含量的log值为横坐标，反应Ct为纵坐标作图，并计算曲线的相关性，得到相关性较高的标准曲线（R²=0.9984），扩增结果可信。

  [0022] 

实施例2  定量检测土壤中晚疫病菌带菌量

1、分别取三种马铃薯种植土壤（沙土Sandy、粘土Clay和腐殖土Muck）各0.5g，加入试剂盒内的试剂A1.2ml，按照CTAB法提取DNA，通过紫外分光光度法测定提取DNA的质量，标准为OD260/280为1.8左右。

2、在扩增管中加入DNA模板2μl(50ng)，加入试剂盒内试剂B缓冲液3μl；dNTP（2.5mM）2μl；特异引物（PIF/PIR, 10μM）各1μl；Taq酶（5U/μl）0.2μl以及2% Blotto（10%脱脂奶粉和0.2% NaN₃），加入无菌去离子水至总体积25μl。

3、对上述反应体系进行普通PCR扩增，具体程序为： 95℃-4min；然后以95℃-55s，60℃-1min，72℃-45s，循环40次；最后在72℃保温5min。

4、将扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，三种土壤的DNA扩增结果显示在101bp处均有明显扩增条带，说明该菌存在或含量较高。

5、在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板1μl(浓度分别为10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl)，加入试剂盒内试剂C 10μl，以及试剂B 中的特异性引物PIF/PIR（10μM）各0.5 μl，无菌去离子水至总体积20μl。

6、在Real Time PCR分析仪上扩增，程序为：50℃-5min,95℃-10min；然后以95℃-20s，60℃-1min，循环35次；最后在72℃保温5min。整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃/s，从60℃增加到95℃。

7、扩增结束后，把检测样品得到的Ct值，再通过Ct=-3.3282log[DNA]+31.994（R²=0.9984）计算得到相应的样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量（如下表）。

由于土壤样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量与土壤中晚疫病菌带菌量成正比，所以可以通过土壤样品马铃薯晚疫病菌DNA含量的高低间接定量土壤样品马铃薯晚疫病菌带菌量的高低，上表表明三种土壤都带有大量的马铃薯晚疫病菌，且腐殖土带菌量>沙壤土带菌量>粘土带菌量。

Claims (4)

1.一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒含下述试剂：

①、试剂A：

DNA提取液：100 mmol/L，Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA，100 mmol/L磷酸钠，1.5mol/L NaCl，2% CTAB，pH8.0；

②、试剂B：

普通PCR 反应液：10×Tris-HCl缓冲液（pH8.3，500mM KCl,15mM MgCl₂）；dNTP（2.5mM）；Taq酶（5U/μl）以及Blotto（10%脱脂奶粉和0.2% NaN₃）；

特异性引物：浓度10μM，序列为：

正向引物(PIF): 5’- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3’；

反向引物(PIR): 5’- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3’

③、试剂C：

Real Time PCR反应液：SYBR-Green荧光标记试剂混合物（SYBR green PCR Master Mix，Applied Biosystems)；

④试剂D：

标准菌株（P.infestans ATCC）DNA液：浓度为100ng/μl。

2.一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒中所采用的引物为下述引物对，这些引物的两端可以添加不定数的保护碱基，酶切位点或接头：

正向引物(PIF): 5’- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3’；

反向引物(PIR): 5’- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3’。

3.根据权利要求1至2中任意一项所述的一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒中所采用的引物可以在合成时使引物带上荧光标记或是同位素标记。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒在定量检测土壤中晚疫病菌DNA含量，并间接推知土壤中晚疫病菌带菌量中应用。