CN107513586B - 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法 - Google Patents

一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107513586B
CN107513586B CN201710987761.4A CN201710987761A CN107513586B CN 107513586 B CN107513586 B CN 107513586B CN 201710987761 A CN201710987761 A CN 201710987761A CN 107513586 B CN107513586 B CN 107513586B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amplification system
japanese encephalitis
encephalitis virus
virus rna
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710987761.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107513586A (zh
Inventor
陈淑丹
郑伟
吕沁风
郑乐怡
吴忠华
郭利川
汤赛君
王智宏
应清界
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau)
Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Original Assignee
Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau)
Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau), Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd filed Critical Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau)
Priority to CN201710987761.4A priority Critical patent/CN107513586B/zh
Publication of CN107513586A publication Critical patent/CN107513586A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107513586B publication Critical patent/CN107513586B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，公开了一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系及方法。所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸镁、氯化钾、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、重组酶、单链结合蛋白、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和乙型脑炎病毒特异性引物。将扩增体系与乙型脑炎病毒RNA混合，进行等温扩增，用荧光探针法对扩增产物进行实时检测。本发明提供的方法操作简单，仪器小型化、携带方便，扩增所用时间短，特异性和灵敏度高，适合基层和现场检测。

Description

一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系及方法。
背景技术
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)为球形，直径40nm，内有衣壳蛋白(C)与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白(E)刺突，即病毒血凝素，囊膜内有内膜蛋白(M)，参与病毒的装配。病毒基因组为单股正链RNA，全长11kb，自5′至3′端依次编码结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NS1—NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网装配成熟，出芽释放。人如感染上该病毒，以中枢神经系统损害为主、临床上以高热、意识障碍、惊厥、强直性痉挛和脑膜刺激等神经症状为主要特征。乙型脑炎病毒的主要感染对象及最重要的储存宿主和扩增宿主是猪。该病以蚊虫为媒介进行传播，也是一种人畜共患的自然疫源性疾病。对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一。本病主要流行于亚洲地区，是一个严重的公共卫生问题。
对于乙型脑炎病毒的疫情防控，最重要的是早期发现，快速诊断，为防治活动的计划、实施和防治效果评价等各个环节提供必要的信息和科学依据，对于疫情的及时发现和处理具有重要的意义。目前实验室诊断乙型脑炎病毒的方法有病毒分离法、血清学诊断法如血凝抑制试验、酶联免疫吸附法等。人类作为乙型脑炎病毒传播链中的终末宿主，病毒血症期比较短暂，且病毒载量较低，从患者组织、血液或其它体液中检测乙型脑炎病毒特异RNA依然是实验室确诊乙型脑炎病毒感染的手段之一。但是这些方法或是需接触到活病毒，或是操作复杂、费时、费力，或是敏感度不够高，不能在早期得出诊断结果。
近年来，发展起来的分子生物学方法如核酸探针技术、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及等温核酸技术中的逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)法已经建立起来，并且在乙型脑炎病毒的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。应用探针技术可以在短期内处理大量样品，但由于其敏感性尚不够高、加之常常需要放射性标记，操作比较繁琐费时，因而限制了其应用。以RT-PCR技术为代表如RT-巢式PCR以及实时定量RT-PCR以其高度的特异性及敏感性在乙型脑炎病毒检测方面取得了重大的突破。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。等温核酸技术中的RT-LAMP方法克服了RT-PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于乙型脑炎病毒的检测。但是，RT-LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，会导致假阳性的出现，对操作环境及操作技巧的要求更高，这些方法不适合在基层单位和现场检测中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系，以及利用该体系检测乙型脑炎病毒RNA的方法。本发明能够实现一步法扩增检测乙型脑炎病毒，操作简便、快速、灵敏，适用于基层单位和现场检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系，包括以下含量的组分：浓度不高于70mM的Tris缓冲液、氯化钾60～160mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量体积浓度为4.0～7.3％的聚乙二醇、ATP 5～10mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～60μg/μL、单链结合蛋白400～1000ng/μL、重组酶30～400ng/μL、UvsY蛋白50～300ng/μL、核酸外切酶50～200ng/μL、荧光探针50～150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、逆转录酶5～40U、RNA酶抑制剂20～60U、正向引物100～500nM和反向引物100～500nM；
其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的序列如SEQIDNO.2所示；
所述荧光探针序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，所述聚乙二醇的数均分子量为30000～40000。
本发明中，所述扩增体系的pH值为7.0～7.5。
本发明中，所述扩增体系的体积优选为25～100μL。
本发明中，所述扩增体系由粉末状态的组分溶解得到，用于溶解所述组分的溶剂为反应缓冲液。
进一步的，所述反应缓冲液为质量体积浓度为0.5～1.5％、分子量为30000～40000的聚乙二醇水溶液。
本发明还提供一种检测乙型脑炎病毒RNA的方法，包括以下步骤：将乙型脑炎病毒RNA与上述扩增体系混合，在35～45℃下进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在乙型脑炎病毒RNA。
优选的，所述乙型脑炎病毒RNA的浓度为1～100ng/μL。
优选的，所述乙型脑炎病毒RNA与所述扩增体系的体积比为0.5～1.5：49。
优选的，所述等温扩增的时间为5～20min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的检测乙型脑炎病毒RNA的方法，采用扩增体系与乙型脑炎病毒RNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在乙型脑炎病毒RNA。本发明所述扩增体系中包括Tris缓冲液、氯化钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和乙型脑炎病毒RNA的特异性引物，本发明的扩增体系可以在恒定的相对较低的温度下完成扩增，不依赖热循环仪，操作简单，不需要体外再单独进行逆转录，实现一步逆转录，方法简单，且能够在35～45℃较低的温度下对乙型脑炎病毒RNA进行检测，并且扩增所用时间短，5～20min内即可得到检测结果，荧光信号易于收集，能够实现实时监控，适合基层和现场检测。
附图说明
图1为实施例5乙型脑炎病毒RNA检测过程中阴性和阳性的荧光信号变化曲线图；
图2为实施例6乙型脑炎病毒RNA检测过程中阴性和阳性的荧光信号变化曲线图；
图3为实施例7乙型脑炎病毒RNA检测过程中阴性和阳性的荧光信号变化曲线图；
图4为实施例8检测不同稀释浓度的乙型脑炎病毒RNA的荧光信号变化曲线图；
图5为实施例9中检测不同病毒的荧光信号变化曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系，用该扩增体系与乙型脑炎病毒RNA混合进行等温扩增，在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，根据荧光信号的放大情况检测乙型脑炎病毒。本发明不需要体外再单独进行逆转录，实现一步逆转录，操作简便、快速、灵敏，适用于现场检测。
本发明检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系包括以下含量的组分：浓度不高于70mM的Tris缓冲液、氯化钾60～160mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量体积浓度为4.0～7.3％的聚乙二醇、ATP 5～10mM、dNTPs0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～60μg/μL、单链结合蛋白400～1000ng/μL、重组酶30～400ng/μL、UvsY蛋白50～300ng/μL、核酸外切酶50～200ng/μL、荧光探针50～150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、逆转录酶5～40U、RNA酶抑制剂20～60U、正向引物100～500nM和反向引物100～500nM；
其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述荧光探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明上述引物序列及荧光探针序列均由商业公司进行合成。
在本发明中，所述的扩增体系包括Tris缓冲液，所述Tris缓冲液在扩增体系中的浓度不高于70mM，优选为20～55mM，更优选为30～50mM。在本发明中，所述Tris缓冲液具有良好的缓冲能力，能够维持扩增体系在稳定的pH值范围，所述扩增体系的pH值范围优选为7.0～7.5。
在本发明中，所述扩增体系包括氯化钾，所述氯化钾在扩增体系中的浓度为60～160mM，优选为65～120mM，更优选的为70～85mM。在本发明中，所述氯化钾中的钾离子在等温扩增过程中能够促进引物退火。
在本发明中，所述的扩增体系包括醋酸镁，所述醋酸镁在扩增体系中的浓度为8～30mM，优选为10～20mM，更优选的为12～16mM。在本发明中，所述醋酸镁中的镁离子在等温扩增过程中能够提高扩增的特异性和产量。
在本发明中，所述的扩增体系中包括二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在扩增体系中的浓度为4～9mM，优选为5～8mM，更优选的为6～7mM。在等温扩增中，所述二硫苏糖醇可以打断二硫键，使与染色体DNA结合的蛋白质从DNA上释放出来，导致更多的DNA与引物结合，提高扩增效率。
本发明所述的扩增体系包括聚乙二醇，所述聚乙二醇在扩增体系中的质量体积浓度优选的为4.0～7.3％，更优选为5.0～6.5％，最优选为5.5～6.2％。
在本发明中，所述聚乙二醇的数均分子量优选为30000～40000，更优选为35000。本发明中所述的聚乙二醇作为缩合剂，与单链结合蛋白共同作用，使得整个等温扩增化学平衡朝着扩增产物方向发展，提高等温扩增产物的产量，稳定扩增效果。
本发明所述的扩增体系包括ATP，所述ATP在扩增体系中的浓度为5～10mM，优选6～8.5mM，更优选为7mM。
本发明所述的扩增体系中包括dNTPs，所述dNTPs在扩增体系中的浓度为0.1～0.4mM，优选为0.15～0.35mM，更优选为0.2～0.3mM。
本发明所述的扩增体系中包括磷酸肌酸，所述磷酸肌酸在扩增体系中的浓度为20～60μg/μL，优选为30～50μg/μL，更优选为35～45μg/μL。
在本发明所述等温扩增过程中，dNTPs为等温扩增反应提供原料，ATP提供反应所需的能量，而磷酸肌酸能够促进ATP的再生，为等温扩增反应源源不断的提供能量，实现核酸的高效扩增。
本发明所述的扩增体系包括单链结合蛋白，所述单链结合蛋白在扩增体系中的浓度为400～1000ng/μL，优选为400～700ng/μL，更优选的为550～650ng/μL。在本发明中，所述的单链结合蛋白与上述技术方案所述聚乙二醇共同作用，提高等温扩增产物的产量。
本发明所述的扩增体系包括重组酶，所述重组酶来源可以是噬菌体T2、T4、T7，也可以来源于细菌和真菌中的重组酶，所述重组酶能够起到解开双链DNA功能。所述重组酶在扩增体系中的浓度为30～400ng/μL，优选的为50～350ng/μL，更优选的为100～300ng/μL。
本发明所述的扩增体系包括UvsY蛋白，所述UvsY蛋白在扩增体系中的浓度为50～300ng/μL，优选为60～150ng/μL，更优选的为80～130ng/μL。
本发明所述的扩增体系中包括核酸外切酶，所述核酸外切酶在扩增体系中的浓度为50～200ng/μL，优选的为70～150ng/μL，更优选的为80～100ng/μL；本发明中所述核酸外切酶优选为核酸外切酶Ⅲ。
本发明所述的扩增体系中包括荧光探针，所述荧光探针的在扩增体系中的浓度为50～150nM，优选为100～140nM，更优选的为120nM。所述荧光探针的序列为：
5’-AAGGAGCYAGTGGAGCYACTTGGGTGGACYTGGTGYTAGAAGG AGA-3’。
在本发明中，所述荧光探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，所述报告荧光基团优选的为FAM荧光基团、TAMRA荧光基团或BHQ荧光基团。在本发明具体实施例中，优选为FAM荧光基团。荧光探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无荧光信号；当目标靶基因成功扩增时，5’端的报告基团随着荧光探针水解而脱落下来，不再与淬灭基团发生能量传递作用，从而能发出荧光信号。在荧光检测过程中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与扩增产物形成完全同步，荧光量强弱与扩增产物成正比。因此，荧光量与扩增产物之间存在一一对应关系，通过对检测荧光信号的强弱变化，实现实时检测乙型脑炎病毒RNA扩增产物。
本发明所述的扩增体系包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶在扩增体系中的浓度为60～150ng/μL，优选为70～120ng/μL，更优选的为85～95ng/μL。
在本发明中，UvsY蛋白是重组蛋白，对目标序列具有高度特异性，与重组酶、DNA聚合酶共同作用，完成等温扩增，减少非特异性扩增，实现产物的无本底背景的高效扩增。
本发明所述的扩增体系包括乙型脑炎病毒RNA特异性引物，所述乙型脑炎病毒RNA特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物在扩增体系中的浓度为100～500nM，优选的为150～450nM，更优选的为180～220nM；所述反向引物在扩增体系中的浓度为100～500ng/μL，优选的为150～450ng/μL，更优选的为180～220ng/μL。
本发明中，正向引物的序列为：
5’-ATCCTYCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTA-3’,
反向引物序列为：5’-ATCATRCGGACRTCYAATGTTGGTTTGTCG-3’。
本发明所述的扩增体系包括逆转录酶，所述逆转录酶为M-MLV或AMV，目的是将乙型脑炎病毒RNA进行逆转录得到cDNA。在本发明具体实施例中，优选为AMV。本发明逆转录酶在扩增体系中的浓度为5～40U，优选的为10～30U，更优选为10～20U。
本发明所述的扩增体系包括RNA酶抑制剂，所述RNA酶抑制剂作用是防止RNA降解。本发明RNA酶抑制剂在扩增体系中的浓度为20～60U，优选的为30～50U，更优选为30～40U。
在本发明中，所述扩增体系的pH值范围优选为7.0～7.5；所述扩增体系的体积优选为25～100μL，更优选的为40～60μL。
本发明对扩增体系的状态没有特殊限定，可以为液体或固体。在本发明中，所述扩增体系优选为冷冻干燥后的粉末。所述扩增体系以冷冻干燥粉末的形貌储存，以便扩增体系的长期保存和运输。本发明的扩增体系还可以作为检测乙型脑炎病毒RNA的试剂盒，用于对乙型脑炎病毒RNA进行等温扩增检测。
本发明对扩增体系的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的制备方法进行配制。若所述扩增体系为冷冻干燥粉末，本发明优选采用负压冷冻干燥的方式制备扩增体系粉末。在本发明中，优选冷冻干燥的压力为0.005～0.035KPa，更优选为0.01～0.02KPa；冷冻干燥的温度优选为-50～20℃，更优选为-35～10℃；冷冻干燥的时间优选为6.5～20h，更优选为11～18h。
在本发明中，所述扩增体系在使用时，将冷冻干燥粉末状态的扩增体系组分原料溶解，用于溶解所述扩增体系原料的溶剂为反应缓冲液。优选的，所述反应缓冲液为聚乙二醇水溶液，所述聚乙二醇水溶液的质量体积浓度优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％。所述聚乙二醇水溶液中，聚乙二醇的分子量优选为30000～40000，更优选为33000～37000。
本发明还提供了用上述技术方案的扩增体系检测乙型脑炎病毒RNA的方法，包括以下步骤：将乙型脑炎病毒RNA与上述扩增体系混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在乙型脑炎病毒RNA。
在本发明中乙型脑炎病毒RNA需要进行逆转录得到cDNA，扩增才能顺利进行。在本发明中，所述乙型脑炎病毒RNA作为等温扩增的模板，体积优选为0.5～5μL，更优选为1～3μL，最优选为1μL；所述乙型脑炎病毒RNA的浓度优选为1～100ng/μL，更优选为30～60ng/μL，最优选为40～60ng/μL。本发明对乙型脑炎病毒RNA的来源及存在形式没有特殊限定，可以为血清或组织中提取的乙型脑炎病毒RNA，或疫苗中存在的乙型脑炎病毒RNA。
在本发明中，将乙型脑炎病毒RNA与本发明上述扩增体系混合后进行等温扩增反应。所述乙型脑炎病毒RNA的体积与扩增体系体积比优选的为(0.5～1.5):49，更优选为0.7～1.3:49，最优选为1:49。
本发明中，所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为35～45℃，优选的为37～42℃，更优选的为38～41℃；所述等温扩增的时间为5～20min，更优选的为10～15min；所述等温扩增反应优选的在能够检测FAM荧光的仪器中进行。
本发明在等温扩增过程中，利用荧光探针法对扩增产物进行实时检测。当目标靶基因成功扩增时，荧光探针发出荧光信号。在荧光检测过程中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与扩增产物形成完全同步，荧光量强弱与扩增产物成正比；因此，荧光量与扩增产物之间存在一一对应关系，通过对检测荧光信号的强弱变化，可以实现实时检测乙型脑炎病毒RNA扩增产物。
本发明的扩增体系可以在恒定的相对较低的温度下完成扩增，不依赖热循环仪，操作简单，不需要体外再单独进行逆转录，实现一步逆转录，方法简单。本发明能够在35～45℃较低的温度下对乙型脑炎病毒RNA进行检测，并且扩增所用时间短，5～20min内即可得到检测结果，荧光信号易于收集，能够实现实时监控，适合基层和现场检测。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
如无特殊说明，本发明实施例中所用试剂的来源均为商业购买得到。
实施例1
配制检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比配制等温核酸扩增体系，体积为50μL。
其中，正向引物、反向引物及荧光探针的序列如下：
正向引物序列：5’-ATCCTYCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTA-3’,
反向引物序列：5’-ATCATRCGGACRTCYAATGTTGGTTTGTCG-3’；
所述荧光探针序列为：
5’-AAGGAGCYAGTGGAGCYACTTGGGTGGACYTGGTGYTAGAAGGAGA-3’；
上述引物及探针序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状扩增体系，真空冷冻干燥的压力为0.02KPa，冷冻干燥的温度为-35℃，冷冻干燥的时间为10h。使用时用反应缓冲液溶解应用。
实施例2
配制检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比配制等温核酸扩增体系，体积为100μL。
其中，正向引物、反向引物及荧光探针的序列如下：
正向引物序列：5’-ATCCTYCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTA-3’,
反向引物序列：5’-ATCATRCGGACRTCYAATGTTGGTTTGTCG-3’；
所述荧光探针序列为：
5’-AAGGAGCYAGTGGAGCYACTTGGGTGGACYTGGTGYTAGAAGGAGA-3’；
上述引物及探针序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状扩增体系，真空冷冻干燥的压力为0.015KPa，冷冻干燥温度为－18℃，冷冻干燥的时间为14h。使用时用反应缓冲液溶解应用。
实施例3
配制检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比配制等温核酸扩增体系，体积为50μL。
其中，正向引物、反向引物及荧光探针的序列如下：
正向引物序列：5’-ATCCTYCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTA-3’,
反向引物序列：5’-ATCATRCGGACRTCYAATGTTGGTTTGTCG-3’；
所述荧光探针序列为：
5’-AAGGAGCYAGTGGAGCYACTTGGGTGGACYTGGTGYTAGAAGGAGA-3’；
上述引物及探针序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状扩增体系，真空冷冻干燥的压力0.02KPa，冷冻干燥的温度为10℃，冷冻干燥的时间为17h。使用时用反应缓冲液溶解应用。
实施例4
配制检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比配制等温核酸扩增体系，体积为50μL。
Tris缓冲液 50mM
氯化钾 90mM
醋酸镁 18mM
二硫苏糖醇 6mM
聚乙二醇 5.5％(w/v)
ATP 5mM
dNTPs 0.28mM
磷酸肌酸 50μg/U
单链结合蛋白 600ng/μL
重组酶 350ng/μL
UvsY蛋白 90ng/μL
核酸外切酶 100ng/μL
荧光探针 110nM
DNA聚合酶 70ng/μL
逆转录酶 20U
RNA酶抑制剂 30U
正向引物 300nM
反向引物 300nM
其中，正向引物、反向引物及荧光探针的序列如下：
正向引物序列：5’-ATCCTYCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTA-3’,
反向引物序列：5’-ATCATRCGGACRTCYAATGTTGGTTTGTCG-3’；
所述荧光探针序列为：
5’-AAGGAGCYAGTGGAGCYACTTGGGTGGACYTGGTGYTAGAAGGAGA-3’；
上述引物及探针序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉末状扩增体系，真空冷冻干燥的压力0.02KPa，冷冻干燥的温度为4℃，冷冻干燥的时间为14h。使用时用反应缓冲液溶解应用。
实施例5
采用实施例1中配制的扩增体系检测乙型脑炎病毒RNA
样品来源：由乙型脑炎疫苗标本提取的基因组RNA，RNA的浓度为50ng/μL。
向离心管中加入质量体积浓度为0.5％、分子量为35000的聚乙二醇水溶液作为反应缓冲液将实施例1的扩增体系溶解为49μL，再加入制备好的1μL乙型脑炎病毒RNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应20分钟。
为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照。
检测结果如附图1所示。由图1可以看出，添加乙型脑炎病毒RNA的样品随着等温扩增荧光信号成对数曲线增长，而阴性对照的荧光信号则不增长。
实施例6
采用实施例2中配制的扩增体系检测乙型脑炎病毒RNA
样品来源：由乙型脑炎疫苗标本提取的基因组RNA，RNA的浓度为70ng/μL。
向离心管中加入质量体积浓度为1.5％、分子量为35000的聚乙二醇水溶液作为反应缓冲液将实施例2的扩增体系溶解成为98μL，再加入制备好的2μL乙型脑炎病毒RNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在38℃条件下反应15分钟。同时设置不加模板的体系作为阴性对照。
检测结果如附图2所示，由图2可以看出，添加乙型脑炎病毒RNA的样品随着等温扩增荧光信号成对数曲线增长，而阴性对照的荧光信号则不增长。通过观察荧光信号强弱变化判断样品中是否存在乙型脑炎病毒RNA。
实施例7
采用实施例3中配制的扩增体系检测乙型脑炎病毒RNA
样品来源：由乙型脑炎疫苗标本提取的基因组RNA，RNA的浓度为82ng/μL。
向离心管中加入质量体积浓度为1.0％、分子量为35000的聚乙二醇水溶液作为反应缓冲液将实施例3的扩增体系溶解成为49μL，再加入制备好的1μL乙型脑炎病毒RNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应15分钟。同时设置不加模板的体系作为阴性对照。
检测结果如附图3所示，由图3可以看出，添加乙型脑炎病毒RNA的样品随着等温扩增荧光信号成对数曲线增长，而阴性对照的荧光信号则不增长。通过观察荧光信号强弱变化判断样品中是否存在乙型脑炎病毒RNA。
实施例8
委托上海生工进行合成乙型脑炎质粒，所述乙型脑炎质粒的核苷酸序列如下：
ATCCTCCTGCTGTTGGTCGCTCCGGCTTATAGTTTCAACTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGACTTCATAGAAGGAGCCAGTGGAGCCACTTGGGTGGACTTGGTGCTAGAAGGAGACAGCTGCTTGACAATCATGGCAAACGACAAACCAACATTGGACGTCCGCATGAT。
合成信息如下：
将乙脑质粒稀释成107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、10拷贝，分别作为模板进行扩增。
其中，拷贝数(拷贝/μL)＝[6.02×1023]×[质粒浓度(ng/μL)×10-9]/[DNA长度×660]。
取8个实施例4的冻干扩增体系，向每个冻干管中加入质量体积浓度为1.5％、分子量为35000的聚乙二醇水溶液作为反应缓冲液将扩增体系重新溶解成为49μL，再分别加入1μL制备好的乙型脑炎质粒，浓度分别为107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝和10拷贝。每一管都混合均匀，瞬时离心后，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应30分钟。为确保实验准确性，同时设置不加模板的体系作为阴性对照。
检测结果如附图4所示。由图4可以看出，添加各浓度的质粒样品有扩增荧光信号，形成扩增曲线，而阴性对照的荧光信号则不增长。从图4中可知，本发明乙型脑炎病毒RNA用等温扩增体系的检测灵敏度可达到102拷贝。
实施例9
特异性检测
检测对象：乙型脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒
样本来源：
乙型脑炎病毒：乙型脑炎减毒活疫苗，成都生物制品研究所有限责任公司；
黄热病毒：黄热减毒活疫苗，北京天坛生物制品股份有限公司；
西尼罗病毒：美国病理学家协会提供；
登革热阳性血清及基孔肯雅热阳性血清标本：浙江国际旅行卫生保健中心提供。
取6个实施例4中的冻干扩增体系，向每个冻干管中加入质量体积浓度为1.5％、分子量为35000的聚乙二醇水溶液作为反应缓冲液将扩增体系溶解成为49μL，再分别加入1μL制备好的乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒，作为模板进行扩增。每一管都混合均匀，瞬时离心后，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应20分钟。
为确保实验准确性，同时设置不加模板的体系作为阴性对照。
检测结果如附图5所示，由图5可以看出，只有乙型脑炎病毒有扩增，形成扩增曲线，而阴性对照及其他样本无扩增的荧光信号。
以上实施例说明使用本发明的方法能够快速检测乙型脑炎病毒RNA，操作简便，检测时间大大缩减，不需要大型仪器设备，不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对乙型脑炎病毒RNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，荧光信号易于收集，能够实时检测，适用于基层和现场的大规模筛选检测。另外，本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏奇天基因生物科技有限公司
浙江国际旅行卫生保健中心（浙江出入境检验检疫局口岸门诊部）
<120> 一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcctyctgc tgttggtcgc tccggctta 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcatrcgga crtcyaatgt tggtttgtcg 30
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggagcyag tggagcyact tgggtggacy tggtgytaga aggaga 46
<210> 4
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcctcctgc tgttggtcgc tccggcttat agtttcaact gtctgggaat gggcaatcgt 60
gacttcatag aaggagccag tggagccact tgggtggact tggtgctaga aggagacagc 120
tgcttgacaa tcatggcaaa cgacaaacca acattggacg tccgcatgat 170

Claims (10)

1.一种检测乙型脑炎病毒RNA的扩增体系，包括以下含量的组分：浓度不高于70mM的Tris缓冲液、氯化钾60～160mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量体积浓度为4.0～7.3％的聚乙二醇、ATP 5～10mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～60μg/μl、单链结合蛋白400～1000ng/μL、重组酶30～400ng/μL、UvsY蛋白50～300ng/μL、核酸外切酶50～200ng/μL、荧光探针50～150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、逆转录酶5～40U、RNA酶抑制剂20～60U、正向引物100～500nM和反向引物100～500nM；
其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述荧光探针序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述聚乙二醇的数均分子量为30000～40000。
3.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系的pH值为7.0～7.5。
4.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系的体积为25～100μL。
5.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系由粉末状态的组分溶解得到，用于溶解所述组分的溶剂为反应缓冲液。
6.根据权利要求5所述的扩增体系，其特征在于，所述反应缓冲液为质量体积浓度为0.5～1.5％、数均分子量为30000～40000的聚乙二醇水溶液。
7.一种非诊断目的的检测乙型脑炎病毒RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：将乙型脑炎病毒RNA与权利要求1～6任意一项所述扩增体系混合，在35～45℃下进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在乙型脑炎病毒RNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乙型脑炎病毒RNA的浓度为1～100ng/μL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述乙型脑炎病毒RNA与所述扩增体系的体积比为0.5～1.5：49。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述等温扩增的时间为5～20min。
CN201710987761.4A 2017-10-21 2017-10-21 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法 Active CN107513586B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710987761.4A CN107513586B (zh) 2017-10-21 2017-10-21 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710987761.4A CN107513586B (zh) 2017-10-21 2017-10-21 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107513586A CN107513586A (zh) 2017-12-26
CN107513586B true CN107513586B (zh) 2019-11-08

Family

ID=60727454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710987761.4A Active CN107513586B (zh) 2017-10-21 2017-10-21 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107513586B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349696A (zh) * 2015-09-02 2016-02-24 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用
CN105803045A (zh) * 2014-11-27 2016-07-27 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种荧光等温核酸扩增方法
CN107164558A (zh) * 2017-04-20 2017-09-15 华南农业大学 一种流行性乙型脑炎的重组酶常温扩增核酸（rt‑rpa）试纸条检测试剂盒及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803045A (zh) * 2014-11-27 2016-07-27 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种荧光等温核酸扩增方法
CN105349696A (zh) * 2015-09-02 2016-02-24 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 检测日本乙型脑炎病毒核酸的试剂盒及应用
CN107164558A (zh) * 2017-04-20 2017-09-15 华南农业大学 一种流行性乙型脑炎的重组酶常温扩增核酸（rt‑rpa）试纸条检测试剂盒及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A recombinase polymerase amplification assay for detection of the heterogeneous sequences encompassing Japanese Encephalitis virus;Macdonald J et al.;《2014 University Research Conference》;20141231;Description部分 *
Recombinase polymerase amplification: Emergence as a critical molecular technology for rapid, low-resource diagnostics;Ameh James et al.;《Expert Review of Molecular Diagnostics》;20151030;第15卷(第11期);第1475-1489页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107513586A (zh) 2017-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111004870B (zh) 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒
CN111733283B (zh) 传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光pcr检测试剂盒
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN106967845A (zh) 一种用于猪Delta冠状病毒检测的试剂盒及检测方法
CN116676428B (zh) 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型的荧光定量pcr引物及其应用
CN105886667A (zh) 猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
CN103173568B (zh) 一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法
CN101892321B (zh) 一种检测禽副粘病毒的简并引物和检测试剂盒
CN106435020B (zh) 用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒
CN103146846A (zh) 一种基于单一标准品的四色荧光定量pcr方法和试剂盒
CN102108420B (zh) 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒
CN107513586B (zh) 一种检测乙型脑炎病毒rna的扩增体系及方法
JP2018000124A (ja) ウイルスからの核酸抽出増幅キット及びそれを用いた抽出増幅方法
CN103173574B (zh) 基于液相芯片检测鲤春病毒血症病毒的方法
CN102912038B (zh) 一种检测禽流感病毒的rt-hda试剂盒及引物
KR101617142B1 (ko) 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트
CN107988429B (zh) 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用
CN114457191A (zh) 基于Cas13a无扩增检测H7亚型禽流感病毒方法
CN111440900A (zh) 用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN107523651A (zh) 一种检测h1n1病毒rna的扩增体系及方法
CN101538618B (zh) 人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒
CN111961757A (zh) 检测鸭坦布苏病毒的双基因探针法实时荧光定量pcr试剂盒及应用
CN111893213A (zh) 用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途
CN111690769A (zh) 一种猪细小病毒7型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant