CN111996289A - 病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病毒检测试剂盒及其应用，其中，该病毒检测试剂盒包括核酸释放剂及RNA‑cDNA‑RNA＊反应缓冲液，所述核酸释放剂包括1％SDS盐溶液及蛋白酶K；所述RNA‑cDNA‑RNA＊反应缓冲液包括dNTPs、荧光NTPs溶液，T7‑GGG‑COVID‑19特异性引物及T7反义寡核苷酸。本发明的病毒检测试剂盒可以用于新型冠状病毒(COVID‑19)的检测，并具有如下优点：其一、仅需简单的样品温控设备和荧光检测系统，可简化原有的RT‑PCR仪器需求，降低仪器成本和增加仪器便携程度，解决了检测工具方面的问题；其二、传统核酸检测包括了反转录、荧光定量扩增和检测等多重操作，耗时长，操作复杂，本技术采用恒温以DNA为模板酶促RNA转录扩增方法，整个检测过程不到半小时，极大地提升了检测效率，解决了检测周期长的问题。

Description

病毒检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检验检疫技术领域，具体涉及一种病毒检测试剂盒及 其应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称新 冠肺炎，是新近发现的一种正义单链线性RNA病毒，属于冠状病毒β属。 与之同属还包括中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒和严重急性呼吸综合征 (SARS)冠状病毒。COVID-19的RNA基因组包含近29 000个核苷酸，编码 至少27个蛋白质，其中包括15种非结构蛋白、4种结构蛋白(S、N、E和M)，以及8种辅助蛋白(3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14)。COVID- 19与SARS-CoV的核苷酸同源性高达82％，其感染宿主细胞的机制也非常相 似，都是通过S蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结 合并与宿主细胞膜融合，从而进入细胞内部。

COVID-19主要通过直接传播、气溶胶传播和接触传播方式，引起患者发 烧、乏力、咳嗽等呼吸道症状，病情加重后发展为呼吸困难、急性呼吸衰 竭，其他一系列严重并发症，甚至死亡。地理传播之广，病例突增之迅速， 致死人数之多，让全球公共卫生面临极为紧迫而巨大的挑战，造成全球社 会、经济和政治空前危机。2020年3月11日，世界卫生组织将COVID-19 疫情评估为全球大流行(pandemic)，呼吁各国通力协作拯救生命。再此危 难中，利用科学的力量控制疫情显得极为重要。

目前COVID-19没有特效药，也没有疫苗。中国为了能够有效遏制疫情， 采取了早检测、早隔离、早治疗，应收尽收，以及减少人际接触和跨城出 行等手段，成功的快速扭转了病例增速。新加坡和韩国没有封锁城市，也 成功的遏制了疫情的蔓延。在这些国家成功的背后，有一个共通的值得借 鉴的关键经验，那就是检测和隔离。尽早地、大规模而快速的检测是重中 之重。目前对COVID-19的检验手段主要分为核酸检测法和免疫学检测法。 核酸检测法是对COVID-19的RNA基因组进行检测，包括荧光定量PCR、基 因测序、微滴式数字PCR、基因芯片测序和环介导等温扩增(LAMP)等技术。 免疫学检测法是对COVID-19病毒抗原或人体免疫反应产生的特异性抗体进 行检测，包括免疫色谱试纸条、酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光免 疫分析(CLIA)等技术。虽然已有大量检测产品研发并得到推广，但在实 际临床检测上不少国家仍面临着检测能力“跟不上”的困境，究其原因， 主要是存在检测周期长、灵敏度低、检测工具和人力不足、检测成本高昂 等缺陷。针对以上问题，本申请的发明人团队开发了一种快速检测新冠肺 炎的检测技术，致力于攻克检测难关，推动临床大规模的诊断进程。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此， 本发明的目的在于提出一种病毒检测试剂盒及其应用。

为实现上述目的，根据本发明的第一个方面，本发明提供的病毒检测 试剂盒，包括：

核酸释放剂，所述核酸释放剂包括1％SDS盐溶液及蛋白酶K；

RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液，所述RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液包括 dNTPs溶液，荧光NTPs＊溶液，T7-GGG-COVID-19特异性引物及T7反义寡 核苷酸。

优选地，所述RNA-cDNA-RNA＊缓冲液还包括镁离子。

优选地，所述RNA-cDNA-RNA＊缓冲液还包括酶混合液，所述酶混合液 包括RNA逆转录酶，核糖核酸酶H及T7 RNA聚合酶。

优选地，所述T7-GGG-COVID-19特异性引物的序列为：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3′，其中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为 20碱基病毒cDNA特异互补序列；

所述T7反义寡核苷酸的序列是5′TAATACGACTCACTATAGGG3′的反义互补 寡核苷酸序列。

根据本发明的第二个方面，本发明提出了如上所述的病毒检测试剂盒， 在新型冠状病毒检测中的应用。

优选地，上述应用包括以下步骤：

将样本加入到核酸释放剂进行孵育，以得到混合溶液；

将预先连接有COVID-19特异的反义寡核苷酸的N+尼龙膜放入收集容器， 并在所述收集容器中加入所述混合溶液；

将RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液加入至所述收集容器中，进行RNA- cDNA-RNA＊反应；

检测所述N+尼龙膜发出的荧光信号。

优选地，所述孵育的温度为50℃至60℃，时间为5秒至15秒。

优选地，所述RNA-cDNA-RNA＊反应的温度为35℃至40℃，时间为5至 13分钟。

通过上述技术方案，本发明的病毒检测试剂盒可以用于新型冠状病毒 (COVID-19)的检测，并具有如下优点：其一、仅需要简单的样品温控设 备和荧光检测系统，可简化原有的RT-PCR仪器需求，降低仪器成本和增加 仪器便携程度，解决了检测工具方面的问题；其二、传统核酸检测包括了 反转录、荧光定量扩增和检测等多重操作，耗时长，操作复杂，本技术采 用恒温扩增RNA＊方法，整个检测过程不到半小时，极大地提升了检测效率，解决了检测周期长的问题。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所 描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

基于新型冠状病毒(COVID-19)相关检测手段，存在检测周期长、灵 敏度低、检测工具和人力不足、检测成本高昂等缺陷，本申请的发明人团 队开发了一种快速检测新冠肺炎的检测试剂盒，致力于攻克检测难关，推 动临床大规模的诊断进程。

根据本发明实施例提供的病毒检测试剂盒，包括核酸缓释剂及RNA- cDNA-RNA＊反应缓冲液(其中，＊指荧光)。

其中，核酸释放剂包括1％SDS盐溶液(十二烷基硫酸钠)及蛋白酶K， 1％SDS盐溶液用于溶解样本，样本可以是咽拭子、鼻拭子和鼻咽抽取物，1 ％SDS盐溶液的配置可以将1g的SDS加入至100ml的去离子水中，即可得 到1％SDS盐溶液。蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解 酶，具有很高的比活性，用于提取样本的RNA。采用上述核酸释放剂，可以 确保样本能够快速释放，可以节省RNA提取时间和成本，然后直接获取样 本基因组RNA，加速样本检测。

RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液包括转录产生荧光RNA＊的荧光NTPs＊溶 液，产生cDNA的dNTPs溶液，T7-GGG-COVID-19特异性引物及T7反义寡核 苷酸，T7-GGG-COVID-19特异性引物的序列5′-TAATACGACTCACTATAGGG-NNN NNNNNNNNNNNNNNNNN 3′，其中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为20碱基病毒cDNA 特异互补序列。T7反义寡核苷酸即是5′TAATACGACTCACTATAGGG3′的反义互 补寡核苷酸，即5′CCCTATAGTGAGTCGTATTA3′。

上述RNA-cDNA-RNA＊缓冲液还包括镁离子。

上述RNA-cDNA-RNA＊缓冲液还包括酶混合液，所述酶混合液包括依赖 于RNA为模板的RNA逆转录酶，核糖核酸酶H及依赖于cDNA模板的T7 RNA 聚合酶。

上所述的病毒检测试剂盒可以在新型冠状病毒检测中的应用。

具体地，上述应用包括以下步骤：

1)将样本加入到核酸释放剂进行孵育，以得到混合溶液，也即是，将 样本加入至释放剂中进行快速释放，提取样本RNA。较佳地，该步骤中的孵 育的温度为50℃至60℃，时间为5秒至15秒。

2)将预先连接有COVID-19特异的反义寡核苷酸的N+尼龙膜放入收集 容器，并在所述收集容器中加入所述混合溶液。该步骤中，病毒RNA将与 COVID-19特异的反义寡核苷酸(可能不止一个)杂交，并粘附在N+尼龙膜 上进行进一步反应。

3)将RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液加入至所述收集容器中进行反应。也 即是，将包含镁离子，RNA逆转录酶、核糖核酸酶H、荧光NTPs＊溶液， dNTPs，T7-GGG-COVID-19特异性引物、T7反义寡核苷酸及T7 RNA聚合酶 的RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液加入至收集容器中，RNA-cDNA-RNA＊反应缓 冲液与混合容器进行反应，得到RNA＊反应荧光产物。

4)检测所述N+尼龙膜发出的荧光信号，也即是采用荧光检测设备检测 N+尼龙膜发出的荧光信号，例如利用激光照射N+尼龙膜，采集N+尼龙膜发 出的荧光信号，如果检测到强荧光信号，例如5分钟后检测到强荧光信号， 则样品呈阳性，即样本中检测到新型冠状病毒，而如果未检测到荧光信号， 例如15分钟后仍未检测到信号，则样本为阴性，即未检测到新型冠状病毒。

根据本发明提供的病毒检测试剂盒，可以用于新型冠状病毒(COVID- 19)的检测，并具有如下优点：其一、仅需要简单的样品温控设备和荧光 检测系统，可简化原有的RT-PCR仪器需求，降低仪器成本和增加仪器便携 程度，解决了检测工具方面的问题；其二、传统核酸检测包括了反转录、 荧光定量扩增和检测等多重操作，耗时长，操作复杂，本技术采用恒温扩 增方法，整个检测过程不到半小时，极大地提升了检测效率，解决了检测 周期长的问题。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述 实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技 术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不 必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要 其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 兰婷

唐贵良

<120> 病毒检测试剂盒及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29903

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60

gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120

cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180

ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240

cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300

acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360

agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420

cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480

acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540

cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600

cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660

tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720

tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780

actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840

ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900

atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960

tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020

gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080

ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140

gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200

caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260

gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320

aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380

atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440

cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500

ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560

ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620

aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680

gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740

aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800

aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860

tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920

tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980

aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040

taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100

gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160

agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220

ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280

ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340

tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400

ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460

tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520

aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580

agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640

aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700

cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760

agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820

acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880

ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940

actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000

tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060

agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120

agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180

agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240

cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300

agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360

aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420

aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480

aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540

tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600

acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660

gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720

tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780

tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840

aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900

gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960

caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020

cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080

tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140

agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200

gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260

gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320

cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380

ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440

tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500

agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560

gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620

tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680

agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740

ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800

agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860

taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920

ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980

aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040

acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100

acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160

tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220

cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280

caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340

acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400

acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460

gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520

taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580

cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640

agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700

tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760

gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820

acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880

ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940

tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000

tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060

tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120

aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180

taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240

gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300

tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360

cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420

ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480

aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540

cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600

attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660

tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720

aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780

ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840

atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900

ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960

gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020

tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080

ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140

tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200

atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260

tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320

ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380

acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440

tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500

ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560

gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620

tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680

cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740

tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800

ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860

taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920

atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980

agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040

tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100

agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160

ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220

tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280

ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340

tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400

atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460

tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520

tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580

gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640

tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700

tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760

tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820

attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880

gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940

tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000

ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060

ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120

acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180

tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240

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atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360

accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420

tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480

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gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 22860

tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta 22920

tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 22980

tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca 23040

atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact 23100

ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt 23160

ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac 23220

tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac 23280

tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg 23340

tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca 23400

ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg 23460

gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc 23520

tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag 23580

ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat 23640

tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc 23700

catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa 23760

gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt 23820

gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga 23880

acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc 23940

aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag 24000

caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt 24060

catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca 24120

aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata 24180

cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc 24240

attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca 24300

gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa 24360

aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga aaacttcaag atgtggtcaa 24420

ccaaaatgca caagctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat 24480

ttcaagtgtt ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat 24540

tgataggttg atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat 24600

tagagctgca gaaatcagag cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt cagagtgtgt 24660

acttggacaa tcaaaaagag ttgatttttg tggaaagggc tatcatctta tgtccttccc 24720

tcagtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact tatgtccctg cacaagaaaa 24780

gaacttcaca actgctcctg ccatttgtca tgatggaaaa gcacactttc ctcgtgaagg 24840

tgtctttgtt tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca 24900

aatcattact acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt 24960

caacaacaca gtttatgatc ctttgcaacc tgaattagac tcattcaagg aggagttaga 25020

taaatatttt aagaatcata catcaccaga tgttgattta ggtgacatct ctggcattaa 25080

tgcttcagtt gtaaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggttg ccaagaattt 25140

aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat gagcagtata taaaatggcc 25200

atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat 25260

gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg 25320

ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac 25380

ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag 25440

caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg 25500

atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt 25560

cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt 25620

gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc 25680

gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag 25740

agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa 25800

aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat 25860

tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca 25920

agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga 25980

gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca 26040

actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt 26100

gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt 26160

aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa 26220

gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta 26280

atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc 26340

atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta 26400

aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat 26460

cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag 26520

ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat 26580

ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg 26640

ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag 26700

taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa 26760

ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt 26820

tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc 26880

tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa 26940

tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg 27000

acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca 27060

aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca 27120

ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc 27180

ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag 27240

atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata 27300

aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat 27360

gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg 27420

ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta 27480

cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta 27540

gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac 27600

ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga 27660

caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt 27720

ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780

tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840

ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900

ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960

agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020

ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080

atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140

gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200

cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260

cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 28320

gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 28380

atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 28440

cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 28500

caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 28560

tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 28620

gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 28680

gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 28740

aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 28800

cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 28860

ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 28920

tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 28980

taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 29040

gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 29100

acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 29160

tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 29220

aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 29280

catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 29340

tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc 29400

tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc 29460

tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 29520

aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc 29580

ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc 29640

acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta 29700

gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt 29760

acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat 29820

tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 29880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 29903

Claims (8)

1.一种病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：

核酸释放剂，所述核酸释放剂包括1％SDS盐溶液及蛋白酶K；

RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液，所述RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液包括dNTPs溶液，荧光NTPs＊溶液，T7-GGG-COVID-19特异性引物及T7反义寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液还包括镁离子。

3.根据权利要求1所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液还包括酶混合液，所述酶混合液包括RNA逆转录酶，核糖核酸酶H及T7 RNA聚合酶。

4.权利要求1所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述T7-GGG-COVID-19特异性引物的序列为：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3′，其中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为20碱基病毒cDNA特异互补序列；

所述T7反义寡核苷酸的序列是5′TAATACGACTCACTATAGGG3′的反义互补寡核苷酸序列。

5.权利要求1-4中任意一项所述的病毒检测试剂盒，在新型冠状病毒检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将样本加入到核酸释放剂进行孵育，以得到混合溶液；

将预先连接有COVID-19特异的反义寡核苷酸的N+尼龙膜放入收集容器，并在所述收集容器中加入所述混合溶液；

将RNA-cDNA-RNA＊反应缓冲液加入至所述收集容器中，进行从RNA到cDNA再到RNA的反应；

检测所述N+尼龙膜富集反应产物RNA＊后发出的荧光信号。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述孵育的温度为50℃至60℃，时间为5秒至15秒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述RNA-cDNA-RNA＊反应的温度为35℃至40℃，时间为5至13分钟。