CN116103437A - Lamp检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合、方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LAMP检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合物、方法。该试剂盒包括用于检测甲型流感病毒的第一检测体系、用于检测乙型流感病毒的第二检测体系及用于检测呼吸道合胞病毒的第三检测体系；第一检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的引物；第二检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的引物；第三检测体系包括用于检测呼吸道合胞病毒A型的引物组及用于检测呼吸道合胞病毒B型的引物组，A型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18所示的引物；B型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.23所示的引物。本发明能够快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒A型和B型。
Description
技术领域
本发明属于检测试剂盒领域，涉及一种LAMP反应联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合物、方法。
背景技术
呼吸道感染是人类最常见的疾病之一，造成呼吸道感染的主要原因是各种呼吸道病毒和一些细菌、支原体、衣原体。其中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒为临床中较为常见且重要的呼吸道病毒。呼吸道病毒引起的感染症状和流行性感冒的症状相似，引起的疫情及对社会造成的危害程度不一样，由于很难靠临床症状确定病原体，因此，快速有效的鉴定呼吸道病原体种类，对于制定治疗和用药方案和疫情控制具有重要意义。
目前，分离培养是呼吸道病毒检测的“金标准”，但该方法操作复杂，耗时长，不适合用于早期诊断。抗体检测虽然操作简便，但其灵敏度和特异性变化比较大，容易出现假阳性和假阴性。聚合酶链反应(PCR)技术敏感性高，特异性强的特点，但该技术在临床应用过程中也存在易交叉污染、耗时长等方面问题，且对实验室环境要求较高，昂贵的仪器设备也不利于基层医疗机构单位的推广和应用。现有通过环介导等温扩增技术(LAMP)进行体外核酸扩增技术来进行检测，该技术对温度的要求较低，不需要昂贵精密的温度循环装置，只需要恒定温度下就可以完成，有利于降低成本，反应时间比传统的qPCR方法快，最快可以达到15min检测出结果，且结果易于判读，不需要依赖于特定机器，肉眼就可以进行判读。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种LAMP联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合物、方法，其能够快速检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒，对呼吸道合胞病毒A型和B型两种分型均能够准确快速地检测。
根据本发明的第一个方面，一种LAMP检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，包括用于检测甲型流感病毒的第一检测体系、用于检测乙型流感病毒的第二检测体系及用于检测呼吸道合胞病毒的第三检测体系；所述第一检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3 和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第二检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第三检测体系包括用于检测呼吸道合胞病毒A型的引物组及用于检测呼吸道合胞病毒B型的引物组；用于检测呼吸道合胞病毒A型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18 所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；用于检测呼吸道合胞病毒B型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.23所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物LB。
在一具体且优选的实施例中，各外引物F3和B3的浓度分别为0.1～0.4μM，各内引物FIP和BIP的浓度分别为1～2μM，各环引物的浓度分别为0.1～1μM。。
在一实施例中，所述第一检测体系、所述第二检测体系及所述第三检测体系还分别包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、甜菜碱、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、 MgSO4、TritonX-100、BstDNA聚合酶及核酸染料。
在一具体且优选的实施例中，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度分别为 1.0～2.0mM，(NH4)2SO4的浓度为6～10mM，甜菜碱的浓度为0.5～1.2M，Tris-HCl 的浓度为9.0～40mM，KCl的浓度为10～20mM，MgSO4的浓度为1～10mM， TritonX-100的浓度为0.05％～1.0％，Bst DNA聚合酶的浓度为8～20U。进一步地，所述核酸染料为钙黄绿素。
在一实施例中，LAMP扩增反应程序为55～65℃下反应18～42min。
根据本发明的第二个方面，一种LAMP检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的引物组合物，包括用于检测甲型流感病毒的第一引物组、用于检测乙型流感病毒的第二引物组、用于检测呼吸道合胞病毒A型的第三引物组及用于检测呼吸道合胞病毒B型的第四引物组；所述第一引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第二引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第三引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第四引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的外引物对F3和 B3、内引物对FIP和BIP、及环引物LB。
在一实施例中，各外引物F3和B3的浓度分别为0.1～0.4μM，各内引物FIP 和BIP的浓度分别为1～2μM，所述第一引物组及所述第二引物组的各环引物LF 和LB的浓度分别为0.1～1μM。
根据本发明的第三个方面，一种非诊断治疗目的的甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的检测方法，包括使用上述的试剂盒或引物组合物进行LAMP扩增反应。
在一实施例中，所述LAMP扩增反应的程序为55～65℃下反应18～42min。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的引物组合物及试剂盒，能够通过LAMP反应快速、准确地检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型，检测灵敏度和特异性均较好，同时检测时间较短，节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1的甲型流感病毒的扩增结果图；
图2是甲型流感病毒的最低检测限实验结果图；
图3是乙型流感病毒的最低检测限实验结果图；
图4是呼吸道合胞病毒A型的最低检测限实验结果图；
图5是呼吸道合胞病毒B型的最低检测限实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
本实施例所需的试剂和材料：引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成；甜菜碱(betaine)、dNTP、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tris-HCl、TritonX-100 购自国药集团化学试剂有限公司；恒温扩增用的BstDNA聚合酶购自NEB公司；核酸染料钙黄绿素购自荣研化学株式会社；甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的假病毒由上海卡敏生物科技有限公司合成。
实施例1：引物组合物的筛选
本实施例对甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、呼吸道合胞病毒A型(HRSVA)、呼吸道合胞病毒B型(HRSVB)病毒基因序列进行分析，进行引物设计，针对每个病毒靶标设计几套引物，甲型流感病毒设计了2组引物，乙型流感病毒设计了5组引物，呼吸道合胞病毒A型设计了5组引物，呼吸道合胞病毒B型设计了4组引物，对每个靶标的引物进行筛选。针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型及呼吸道合胞病毒B型的待筛选的引物信息依次参见下表1至表4。
表1甲型流感病毒FluA的待筛选引物
表2乙型流感病毒FluB的待筛选引物
表3呼吸道合胞病毒A型HRSVA的待筛选引物
表4呼吸道合胞病毒B型HRSVB的待筛选引物
分别将上述各组待筛选的引物和dATP、dTTP、dCTP、dGTP、(NH4)2SO4、甜菜碱、Tris-HCl、KCl、MgSO4、TritonX-100、Bst DNA聚合酶及钙黄绿素、核酸模板混合形成扩增反应体系。其中，扩增引物的外引物F3和B3各0.2μM，扩增引物的内引物FIP和BIP各1.6μM，扩增引物的环引物：0.8μM，dATP、 dTTP、dCTP和dGTP各1.4mM，(NH4)2SO4：8mM，Betaine：0.6M，Tris-HCl： 20mM，KCl：10mM，MgSO4：8mM，TritonX-100：0.05％，Bst DNA聚合酶： 8U，逆转录酶：10U，钙黄绿素染料:1μL，核酸模板5ul。对于检测甲型流感病毒的扩增反应体系，加入的核酸模板为甲型流感病毒的假病毒低浓度标准稀释液；对于检测乙型流感病毒的扩增反应体系，加入的核酸模板为乙型流感病毒的假病毒低浓度标准稀释液；对于检测呼吸道合胞病毒的扩增反应体系，加入的核酸模板为呼吸道合胞病毒A型和B型的假病毒低浓度标准稀释液。
LAMP扩增反应程序为62℃反应30min。
反应结果的判读，反应结束后，直接用肉眼观察扩增反应液颜色，如果形成强烈的绿色肉眼可见变色反应则表示样本检验结果为阳性，如果未发生扩增的管为深橙色则表示该样本为阴性。例如，如图1所示，WTC为阴性对照为 RNase-Free ddH2O扩增的结果，两个PC为甲型流感病毒阳性样本扩增结果。
扩增结果参见下表5所示。
表5扩增结果
由表5可知，甲型流感病毒(FluA)扩增效果最佳的引物是第2组引物，乙型流感病毒(FluB)扩增效果最佳是第1组引物，呼吸道合胞病毒A型(HRSVA) 扩增效果最佳的是第2组引物，呼吸道合胞病毒B型(HRSVB)扩增效果最佳的是第3组引物。此外，本实施例针对呼吸道合胞病毒的两种分型(A型和B 型)分别设计引物，且能够在同一体系中同时检测这两种分型的呼吸道合胞病毒，相比通用型引物，本实施例针对呼吸道合胞病毒A型和B型分别设计的特异性扩增引物，呼吸道合胞病毒的常见两种分型A型和B型均能够检出且检测灵敏度和特异性均较好。
实施例2：检测试剂盒
检测试剂盒包括甲型流感病毒检测体系、乙型流感病毒检测体系及呼吸道合胞病毒检测体系。
甲型流感病毒检测体系包括实施例1筛选的针对甲型流感病毒的第2组引物，具体为：
F3：RTYCCRTCAGGCCCCCTC，SEQ ID NO.1；
B3：TYGGRTCYCCATTCCCATT，SEQ ID NO.2；
FIP：CCATGAGAGCCTCRAGATCTGYAAAGCCGAGATCGCRCAG，SEQ ID NO.3；
BIP：RGGRTTTGTDTTCACGCTCACCGGACAAAWCGTCTACGCTG， SEQ ID NO.4；
LF：TGYATTCTTYCCSGCAAARACA，SEQ ID NO.5；
LB：GCCCAGTGAGCGAGGACTG，SEQ ID NO.6。
乙型流感病毒检测体系包括实施例1筛选的针对乙型流感病毒的第1组引物，具体为：
F3：CAAGGCAAAAGATAAAGGAGG，SEQ ID NO.7；
B3：YGCAACAAGTTTAGCAACAA，SEQ ID NO.8；
FIP： CTCTCARGGACAATACATTACGCATTAAACACTCAGAAAGAAGGGAA， SEQ ID NO.9；
BIP：GGAACATTCCTCAAACACCCCAGCCTTCCACTCTGGTCAT，SEQ ID NO.10；
LF：ATCCCTTTTTATTGTCAAACGG，SEQ ID NO.11；
LB：GGATACAAGTCCTTATCAACTCTGC，SEQ ID NO.12。
呼吸道合胞病毒检测体系包括实施例1筛选的针对呼吸道合胞病毒A型的第2组引物及针对呼吸道合胞病毒B型的第3组引物，呼吸道合胞病毒A型的引物具体为：
F3：GACTTCAAAAACAGATGTAAGC，SEQ ID NO.13；
B3：GACTTTTGCCTTCTTGCTTA，SEQ ID NO.14；
FIP：GATGCTGTACATTTGGTTTTGCCCTCCGTTATCACATCTCTAGG，SEQ ID NO.15；
BIP：AATCGTGGGATCATAAAGACATTCTTTACCTACAGACACAGTATCC，SEQ ID NO.16；
LF：ATAGCATGACACAATGGCT，SEQ ID NO.17；
LB：CTAACGGGTGTGATTATGTATC，SEQ ID NO.18。
呼吸道合胞病毒B型的引物具体为：
F3：GCTAATGGAGTAGATATAACAACA，SEQ ID NO.19；
B3：AGGGCAGCTATACACAGTA，SEQ ID NO.20；
FIP： TGACTTGTATTTCTGATGTCAAGCTTATCGTCAAGATATAAATGGAAAGG， SEQ IDNO.21；
BIP：AATGCTAAAAGAGATGGGAGAAGTGTTATCATCCCACAGTCTGG， SEQ ID NO.22；
LB：GCTCCAGAATATAGGCATGA，SEQ ID NO.23。
上述引物组合物中，外引物F3和B3各0.2μM，扩增引物的内引物FIP 和BIP各1.6μM，扩增引物的环引物：0.8μM。甲型流感病毒检测体系、乙型流感病毒检测体系及呼吸道合胞病毒检测体系还分别包括dATP、dTTP、dCTP 和dGTP各1.4mM，(NH4)2SO4：8mM，Betaine：0.6M，Tris-HCl：20mM，KCl： 10mM，MgSO4：8mM，TritonX-100：0.5％，Bst DNA聚合酶：8U，逆转录酶： 10U，钙黄绿素染料:1μL。
该试剂盒的检测步骤具体如下：
(1)样本洗脱：取样本(如咽拭子或口腔拭子样本)转移到含有样本裂解液的离心管中，震荡混匀，待检；
(2)在测试管中加入步骤(1)中的上清液，在核酸检测仪中62℃条件下反应30分钟，测试管中放有上述的甲型流感病毒检测体系、乙型流感病毒检测体系或呼吸道合胞病毒检测体系；
(3)结果判读，肉眼观察反应液颜色，如果形成强烈的绿色肉眼可见变色反应则表示样本检验结果为阳性，如果未发生扩增的管为深橙色则表示该样本为阴性。
试剂盒的可行性
1.最低检测限(LOD)实验
甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒A型和B型的最低检测用合成的假病毒来验证，假病毒由上海卡敏生物科技有限公司合成，甲流和乙流假病毒的原始浓度为109Copies/mL，呼吸道合胞病毒A型和B型假病毒的原始浓度为1011Copies/mL，采用实施例2的试剂盒进行LAMP反应扩增。如图2 所示，甲流的核酸最低检测限为104Copies/mL；如图3所示，乙流的核酸最低检测限103Copies/mL；如图4所示，呼吸道合胞病毒A型的核酸最低检测限 5*103Copies/mL；如图5所示，吸道合胞病毒B型的核酸最低检测限 104Copies/mL。其中，NTC和WTC分别表示阴性对照。
2.特异性实验
特异性实验病原体样本提取：麻疹病毒、鼻病毒、呼吸道肠道病毒、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体的咽拭子或口腔拭子用索莱宝生物科技有限公司RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。
样本检测：采用实施例2进行检测，甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒A型和B型作为阳性对照。
结果分析：麻疹病毒、鼻病毒、呼吸道肠道病毒、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体核酸都分别用甲型流感病毒检测体系、乙型流感病毒检测体系和呼吸道合胞病毒A型和B型检测体系检测，检测结果参见表6。其中，麻疹病毒、鼻病毒、呼吸道肠道病毒、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体核酸均未检出，表明其具有高特异性。
表6特异性实验结果
“+”代表检出阳性，“-”代表检出阴性。
如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。
单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏汇先医药技术有限公司
<120> LAMP检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合、方法
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<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccatgagagc ctcragatct gyaaagccga gatcgcrcag 40
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agggtttgtg ttcacgctca ccggacaaac cgtctacgct g 41
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctgcaaaaa catcctcaag tct 23
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgcccagtg agcgaggac 19
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggacatgaac aacaaagatg c 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggcaacaagt ttagcaacaa 20
<210> 32
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggacaataca ttacgcatat cccttgataa aggaggaagt aaacactca 49
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggaacattcc tcaaacaccc cagccttcca ctctggtcat 40
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcaaacggaa cttcccttct ttc 23
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggatacaagt ccttatcaac tctgc 25
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgagagtgtt rgtaaaygga a 21
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttgagacgct cgaagagt 18
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggtcatatgc attcaatcta tgcagcattc ctcaaacacc cca 43
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tggaaggctt gttgctaaac ttgarttgag gatccgatgg 40
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agttgataag gacttgtatc c 21
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gttgccactg atgatcttac agt 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
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<400> 42
gatcttacag tggaggatga 20
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<212> DNA
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<400> 43
aaagttcttc cgtgacca 18
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgctcgaatt ggctttgaat gtcccatcgg atcctcaact ca 42
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctgaaactgc ggtgggagtc gtctccctct tctggtgat 39
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cttcattgag acgctcgaag ag 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caatttggtc aagagcaccg 20
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gattgaatgc atatgaccag a 21
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtgctcttga ccaaattgg 19
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ccatcttctt catcctccac tgtagtggaa ggcttgttgc ta 42
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ctcaactcac tcttcgagcg tataagactc ccaccgcag 39
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agatcatcag tggcaacaag tt 22
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctcaatgaag gacattcaaa gcca 24
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcaaaaccaa atgtacagca t 21
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
attgacttga gatattgatg ca 22
<210> 56
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtatccaccc ccttatttga tacataaaat cgtgggatca taaagac 47
<210> 57
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ataagcaaga aggcaaaagt ctcttcatca gaggggaaca cta 43
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcacacccgt tagagaat 18
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
atgtaaaagg tgaacccata a 21
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcatcaatat ctcaagtcaa tga 23
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ataccactca gttgatcctt 20
<210> 62
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tggtggattt accagcattt acattatcag agtctagcat ttatccg 47
<210> 63
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ttgttagcat taattgcagt tggaccttaa tgtgactggt gtgc 44
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gcttctatac tgcaaggcca ga 22
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
caatgaacag tttaacatta ccaag 25
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gatacataat cacacccgtt ag 22
<210> 67
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gctgcttaca tctgtttttg aagtctgagg taaatctctg caaca 45
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tatcacatct ctaggagcca ttgtgtgtct ttatgatccc acgatt 46
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gcttctatac tgcaaggcca ga 22
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
catgctatgg caaaaccaaa tgtac 25
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tgaggtaaat ctctgcaaca t 21
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
acagtatcca ccccctta 18
<210> 73
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cggagctgct tacatctgtt tttacatatt caaccccaaa tatgattg 48
<210> 74
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ccattgtgtc atgctatggc aacacccgtt agagaatgtc tt 42
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ccaaatgtac agcatcaa 18
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tggaaaggaa atgaaattcg a 21
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ctgctgtaag acctgatct 19
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acttctccca tctcttttag catttagctt gacatcagaa atacaagt 48
<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ccagaatata ggcatgattc tccagtcctg ctgctaattt ggtta 45
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
atgataatac tgtgtatagc tgccc 25
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tgacatcaga aatacaagtc aa 22
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ctgctgtaag acctgatct 19
<210> 83
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
agccacttct cccatctctt ttattgagat agaatctaga aagtcc 46
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ccagaatata ggcatgattc tccagtcctg ctgctaattt ggtta 45
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
atgataatac tgtgtatagc tgccc 25
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tgacatcaga aatacaagtc aa 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tcctaattac tgctgtaaga cc 22
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
tgcctatatt ctggagccac tttctagaaa gtcctacaaa aaaatgc 47
<210> 89
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tgattctcca gactgtggga ttgatctatc tcctgctgct a 41
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
ctgtgtatag ctgcccttg 19
Claims (10)
1.一种LAMP检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于：包括用于检测甲型流感病毒的第一检测体系、用于检测乙型流感病毒的第二检测体系及用于检测呼吸道合胞病毒的第三检测体系；所述第一检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第二检测体系包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第三检测体系包括用于检测呼吸道合胞病毒A型的引物组及用于检测呼吸道合胞病毒B型的引物组；用于检测呼吸道合胞病毒A型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；用于检测呼吸道合胞病毒B型的引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.23所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物LB。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，各外引物F3和B3的浓度分别为0.1～0.4μM，各内引物FIP和BIP的浓度分别为1～2μM，各环引物的浓度分别为0.1～1μM。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一检测体系、所述第二检测体系及所述第三检测体系还分别包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、甜菜碱、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、TritonX-100、Bst DNA聚合酶及核酸染料。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度分别为1.0～2.0mM，(NH4)2SO4的浓度为6～10mM，甜菜碱的浓度为0.5～1.2M，Tris-HCl的浓度为9.0～40mM，KCl的浓度为10～20mM，MgSO4的浓度为1～10mM，TritonX-100的浓度为0.05％～1.0％，Bst DNA聚合酶的浓度为8～20U。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为钙黄绿素。
6.根据权利要求1至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，LAMP扩增反应程序为55～65℃下反应18～42min。
7.一种LAMP检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的引物组合物，其特征在于：包括用于检测甲型流感病毒的第一引物组、用于检测乙型流感病毒的第二引物组、用于检测呼吸道合胞病毒A型的第三引物组及用于检测呼吸道合胞病毒B型的第四引物组；所述第一引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第二引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第三引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物对LF和LB；所述第四引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～SEQID NO.23所示的外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、及环引物LB。
8.根据权利要求7所述的引物组合物，其特征在于，各外引物F3和B3的浓度分别为0.1～0.4μM，各内引物FIP和BIP的浓度分别为1～2μM，所述第一引物组及所述第二引物组的各环引物的浓度分别为0.1～1μM。
9.一种非诊断治疗目的的甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的检测方法，其特征在于，包括使用如权利要求1至6任一项所述的试剂盒或如权利要求7或8所述的引物组合物进行LAMP扩增反应。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的程序为55～65℃下反应18～42min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111317870.8A CN116103437A (zh) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | Lamp检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合、方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116103437A true CN116103437A (zh) | 2023-05-12 |
Family
ID=86265980
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116676429A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-01 | 广东省林业科学研究院 | 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的lamp引物组及方法 |
-
2021
- 2021-11-09 CN CN202111317870.8A patent/CN116103437A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116676429A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-01 | 广东省林业科学研究院 | 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的lamp引物组及方法 |
| CN116676429B (zh) * | 2023-07-27 | 2023-11-14 | 广东省林业科学研究院 | 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒b型的lamp引物组及其应用 |
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