CN114934127A - 用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒 - Google Patents

用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，所述试剂盒包括针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50‑70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分。试剂盒分别有内源性内参和外源性内参作为质控，避免检测的假阴性。通过不同待测病原体的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测病原体的多重检测，提高检测准确率，节省时间和成本以及样本量。

Description

用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒。
背景技术
传统实时荧光PCR技术通过在PCR反应体系中加入不同的荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高特异性、有效解决PCR污染问题、快速等优点，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于受目前市场上荧光PCR仪通道的限制，单管最多只能检测4-5个靶标，不能满足临床上某一症候群相关的多种病原体或基因同时筛查的需求。
目前临床上常见的病原微生物感染症状有呼吸道感染，血流感染，泌尿生殖道感染、等，而引起这些症状的病原微生物较为复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，需要同时进行多重病原微生物进行检测，给疾病诊断和治疗造成极大的困难。若感染所致疾病得不到快速诊断，则只能经由临床医生的经验和现有知识给予治疗，而这些治疗方法常伴随着广谱抗生素的滥用，引起多重耐药菌的出现和医院获得性感染的发生。多种病原体同时检测的策略，以及病原体的快速、准确鉴定在疾病管理中至关重要。
传统的培养法是目前诊断的金标准，但该方法检测速度慢，操作繁琐，无法定量检测，且假阴性率高。对于血流感染发展至脓毒性休克的患者，若缺乏及时的治疗其生存时间以小时为单位急剧下降。因此，我们迫切需要一种快速准确鉴定病原体的方法。近年来，随着分子检测手段的发展，用于快速诊断BSI病原菌的方法层出不穷，这些分子诊断技术被用于补充培养的不足，可分为基于阳性血培养样本病原菌检测和全血中直接检测病原菌的检测方法。前者包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析、荧光原位杂交技术、多重PCR技术、DNA微阵列技术等；后者包括实时定量PCR、二代测序技术、数字PCR技术等。二代测序技术可快速对样本中全部DNA或RNA进行测序，能一次性对多个靶基因进行检测，具有敏感性及特异性高、所需样本量小等优势。但存在检测费用高、周期相对长、不能检测耐药基因、需要专业团队等，尤其是检测报告时间常需要 2～3d，但其对临床少见菌的鉴定和新菌种的发现方面更具优势。
鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的多重检测技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50-70℃，所述探针的Tm值范围为 60～80℃，实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个 RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述下游引物及探针分别与各自待测病原体特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RAN碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
c.核酸聚合酶和dNTP，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测病原体生成带荧光标记的PCR产物。
在一种实施方式中，所述试剂盒是单管检测热带念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌的试剂盒，它们的引物和探针如下：
Figure RE-GDA0003752173010000021
Figure RE-GDA0003752173010000031
在一种实施方式中，热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、和/或肺炎克雷伯菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM，优选地，热带念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，光滑念珠菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/ 或，阴沟肠杆菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，白色念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，粘质沙雷菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，奇异变形杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为 0.05mM；和/或，粪肠球菌引物的终浓度为0.1mM和探针终浓度为0.05mM时；和/或，肺炎克雷伯菌引物(KPN-R1)的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.05mM时。
在一种实施方式中，所述试剂盒是单管检测的试剂盒，其检测的是鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和无乳链球菌，它们的引物和探针如下：
Figure RE-GDA0003752173010000032
Figure RE-GDA0003752173010000041
在一种实施方式中，鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和/或无乳链球菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM。
在一种实施方式中，鲍曼不动杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，大肠埃希菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，表皮葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，屎肠引物的终浓度为0.1mM 和探针的终浓度为0.1mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，铜绿假单胞菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，克柔念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，产酸克雷伯菌引物的终浓度为0.2mM和探针终浓度为0.1mM；和/或，肺炎链球菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，近平滑念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，无乳链球菌引物的终浓度为0.2mM和探的终浓度为0.2mM。
在一种实施方式中，所述dNTP浓度设为0.2mM。
在一种实施方式中，所述聚合酶浓度为1.0U。
在一种实施方式中，提供一种检测多个血流感染病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述的试剂盒第一管试剂和权利要求4所述的试剂盒第二管试剂，在所述第一管试剂中设置有内源性内参质控，在所述第二管试剂中设置有外源性内参质控。
在一种实施方式中，所述内源性内参和外源性内参的探针引物如下：
Figure RE-GDA0003752173010000051
本发明针对每个待测靶标核酸序列设计特异性探针和下游引物，探针含有至少1个 RNA碱基，通过控制探针和下游引物之间的序列长度实现对每个待测靶标核酸序列的Tm值控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值在荧光PCR仪上能够区分。在所述RNA碱基5’端左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA 碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值，控制RNA碱基5’端左侧序列的Tm值和探针的Tm值在一定的范围内，提高RNA酶切后的序列的扩增效率和检测敏感性；直接对特异性产物进行熔解曲线分析，降低扩增体系中的序列的数量同时通过设置反应程序中的不同的退火温度和延伸温度(延伸温度高于退火温度)，降低序列二聚体的形成和扩增；具有优异的特异性。本发明的主要优点如下：
1).利用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，控制RNA碱基5’端左侧序列的Tm值在50-70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，只需针对待测序列设计探针和下游引物，即可完成检测和扩增，降低扩增体系中的序列的数量，降低不同序列间多聚体形成，具有高的灵敏度和特异性。
2).在现有的荧光定量PCR扩增中，退火温度和延伸温度通常是同一个温度，而在本发明中通过设置反应程序中的不同的退火温度和延伸温度(延伸温度高于退火温度)，降低序列二聚体的形成和扩增，提高特异性。
3).利于RNaseH酶切获得带荧光标记的引物，扩增形成带荧光基团的产物，直接对特异性产物进行熔解曲线分析，具有优异的特异性；
4).利用荧光定量PCR仪的不同个通道和不同产物的Tm差异二维参数，实现多靶标核酸的多重检测，提高检测准确率，节省时间和成本以及样本量。
5).整个过程闭管操作，避免扩增污染。
在本发明的二管检测试剂中各选定一个内参质控，分别为内源性内参质控和外源性内参质控，内源性内参可以质控采样是否成功，而外源性内参可以质控扩增是否成功。
在本发明中，通过试剂盒的反应体系中引物、探针浓度进行验证，确定每一个靶标的最佳引物探针浓度。通过试剂盒的反应体系中的dNTP、Taq聚合酶的浓度进行验证，确定最佳的dNTP浓度和Taq聚合酶浓度。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括热启动的DNA聚合酶、UDG酶、耐热核糖核酸酶RNaseH。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为构建的待扩增靶标基因的重组质粒片段，阴性对照品为无RNase和DNase水。
本发明提供试剂盒，检测灵敏度高、特异性好，其检测准确度达到了已上市同种产品的质量水平，能够满足临床试验需要。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1本发明中的试剂盒检测试剂1检测浓度为100CFU/mL各靶标菌株的结果图，依次为HEX通道的CTR(A1表示)、CG(A2表示)、CA(A3表示)、ENC(A4表示)； ROX通道的ENF(B1表示)；CY5通道的SA(C1表示)、SMS(C2表示)；FAM通道的PM(D1表示)、KPN(D2表示)的产物熔解曲线图；
图2本发明中的试剂盒检测试剂2检测浓度为100CFU/mL各靶标菌株的结果图，依次为HEX通道的GBS(A1表示)、ABA(A2表示)、STAE(A3表示)；ROX通道的CPA(B1表示)、EFS(B2表示)、PA(B3表示)；CY5通道的CTR(C1表示)、 KLO(C2表示)；FAM通道的SP(D1表示)、ECO(D2表示)的产物熔解曲线图；
图3本发明中的试剂盒检测缓症链球菌、化脓链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、滕黄微球菌、马红球菌、格氏李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、干燥奈瑟氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、葡萄牙念珠菌、嗜肺军团菌(来源于34种细菌和真菌感染多重核酸检测试剂国家参考品)的产物熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，实施例仅是范例，不能对本发明造成限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。实施例中所有的试剂为市售试剂。反应buffer、检测酶液购于专业原料公司；所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
实施一十九种血流感染病原体核酸的多重检测的引物探针的确定
1.引物探针序列筛选
1.1.引物探针序列本发明对铜绿假单胞菌(PA)、鲍曼不动杆菌(ABA)、肺炎克雷伯菌(KPN)、大肠埃希菌 (ECO)、金黄色葡萄球菌(SA)、阴沟肠杆菌(ENC)、表皮葡萄球菌(STAE)、热带念珠菌(CTR)、克柔念珠菌(CKR)、白色念珠菌(CA)、产酸克雷伯菌(KLO)、粘质沙雷菌(SMS)、奇异变形杆菌(PM)、肺炎链球菌(SP)、粪肠球菌(ENF)、屎肠球菌(EFS)、近平滑念珠菌(CPA)、光滑念珠菌(CG)和无乳链球菌(GBS)等病原体基因序列进行分析，在引物探针设计基本原则的基础上利用设计软件进行设计，针对每个病原体靶标进行了引物与探针组合的筛选，每个病原体靶标被筛选的引物探针组合如表1所示。
表1.19种血流感染病原体靶标被筛选的引物探针
Figure RE-GDA0003752173010000071
Figure RE-GDA0003752173010000081
Figure RE-GDA0003752173010000091
Figure RE-GDA0003752173010000101
Figure RE-GDA0003752173010000111
1.2.使用模板:19种血流感染病原体各靶标、人源内参及外源性内参的低浓度标准质粒稀释液(1copies/μL与10copies/μL两个浓度)
1.3.试剂盒组分浓度
各组分浓度为：RNaseH为20mU，dNTP为0.2mM，MgSO4为3mM，引物浓度为0.1mM～0.3mM，探针浓度为0.05mM～0.2mM，DNA聚合酶为1.0U。
1.4.反应程序：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，58℃退火，72℃延伸，同时延伸时收集荧光，重复45个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.04℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
1.5.筛选结果：如下表2所示，21个靶标均筛到了灵敏度最佳的引物探针以及在反应液组合中最适合的Tm值为：反应液1中的热带念珠菌的CTR-P1/CTR-R1、光滑念珠菌的CG-P2/CG-R2、阴沟肠杆菌的ENC-P1/ENC-R1、内参(ROX)的IC6-P2/IC6-R2、白色念珠菌的CA-P3/CA-R3、金黄色葡萄球菌的SA-P1/SA-R1、粘质沙雷菌的SMS- P2/SMS-R2、奇异变形杆菌的PM-P3/PM-R3、粪肠球菌的ENF-P2/ENF-R2、肺炎克雷伯菌的KPN-P1/KPN-R1；反应液2中的ABA-P1/ABA-R1、大肠埃希菌中的ECO- P2/ECO-R2、外源内参的WNC-P1/WNC-R1、表皮葡萄球菌的STAE-P3/STAE-R3、屎肠球菌的EFS-P1/EFS-R1、铜绿假单胞菌的PA-P2/PA-R2、克柔念珠菌的CKR-P3/CKR- R3、产酸克雷伯菌的KLO-P1/KLO-R1、肺炎链球菌的SP-P2/SP-R2、近平滑念珠菌的 CPA-P2/CPA-R2、无乳链球菌的GBS-P2/GBS-R2，各靶标的最佳引物探针单重的灵敏度可扩增至1copies/μL。
表2.筛选21种血流感染病原体引物探针单重验证结果
Figure RE-GDA0003752173010000121
Figure RE-GDA0003752173010000131
2.多重反应液中靶标组合的确定
熔解曲线实验并不是简单地将多对特异性引物探针混合成一个反应体系。熔解曲线实验中要求各个靶标各自的引物探针不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，以此，来保证在多重检测中的特异性；所以进行多重实验时，多个靶标所使用引物探针浓度也需要进行优化调整才能达到较高的扩增灵敏度。
2.1多重反应液组分浓度如下：
各组分浓度为：RNaseH为20mU，dNTP为0.2mM，MgSO4为3mM，引物浓度为 0.1mM～0.3mM，探针浓度为0.05mM～0.2mM，DNA聚合酶为1.0U。
2.1.1引物探针浓度的筛选
2.1.1.1反应液1引物探针浓度的筛选：
当引物浓度为0.1mM～0.3mM，探针浓度为0.05mM～0.2mM时，检各靶标的10Copies/μL的质粒进行比较：结果见表3
表3反应液1各靶标探针引物浓度筛选
Figure RE-GDA0003752173010000141
Figure RE-GDA0003752173010000151
结果表明，当热带念珠菌引物(CTR-R1)的终浓度为0.1mM和探针(CTR-P1)的终浓度为0.05mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在 0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当光滑念珠菌引物(CG-R2)的终浓度为0.1mM和探针(CG-P2)的终浓度为0.05mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当阴沟肠杆菌引物(ENC-R1)的终浓度为0.2mM和探针(ENC-P1)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当白色念珠菌引物(CA-R3)的终浓度为0.1mM和探针(CA-P3)的终浓度为0.05mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当金黄色葡萄球菌引物(SA-R1)的终浓度为0.2mM和探针(SA-P1)的终浓度为0.2mM 时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当粘质沙雷菌引物(SMS-R2)的终浓度为0.2mM和探针(SMS-P2)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当人基因组保守基因引物(IC6-R2)的终浓度为0.2mM和探针(IC6-P2)的终浓度为0.2mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当奇异变形杆菌引物(PM-R3)的终浓度为0.1mM和探针(PM-P3)的终浓度为0.05mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当粪肠球菌引物(ENF-R2)的终浓度为0.1mM和探针(ENF-P2)的终浓度为0.05mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当肺炎克雷伯菌引物(KPN-R1)的终浓度为0.1mM和探针(KPN-P1)的终浓度为0.05mM 时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
2.1.1.2反应液2引物探针浓度的筛选，见表4
表4反应液2各靶标探针引物浓度筛选
Figure RE-GDA0003752173010000161
Figure RE-GDA0003752173010000171
结果表明：当鲍曼不动杆菌引物(ABA-R1)的终浓度为0.1mM和探针(ABA-P1)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在 0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当大肠埃希菌引物(ECO-R2)的终浓度为0.1mM和探针(ECO-P2)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当外源性内参引物(WNC-R1)的终浓度为0.2mM和探针(WNC-P1)的终浓度为0.2mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当表皮葡萄球菌引物(STAE-R3)的终浓度为0.2mM和探针(STAE-P3)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当屎肠引物(EFS-R1)的终浓度为0.1mM和探针(EFS-P1)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当铜绿假单胞菌引物(PA-R2)的终浓度为0.1mM和探针(PA-P2)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当克柔念珠菌引物(CKR-R3)的终浓度为0.1mM和探针(CKR-P3)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当产酸克雷伯菌引物(KLO-R1)的终浓度为0.2mM和探针(KLO-P1)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当肺炎链球菌引物(SP-R2)的终浓度为0.1mM和探针(SP-P2)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当近平滑念珠菌引物(CPA-R2)的终浓度为0.1mM和探针(CPA-P2)的终浓度为0.1mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
当无乳链球菌引物(GBS-R2)的终浓度为0.2mM和探针(GBS-P2)的终浓度为0.2mM时，与其他浓度相比，检测的Ct值最小，表明检测效率最高；引物浓度在0.1～0.3mM、探针浓度0.05～0.2mM，均可以达到检测灵敏度要求。
2.1.2dNTP浓度的筛选将dNTP浓度设为0.1mM、0.2mM、0.3mM，分别在两个反应液里检10copies/μL的各靶标质粒，结果见表5-6
表5反应液1的dNTP浓度的筛选
Figure RE-GDA0003752173010000181
Figure RE-GDA0003752173010000191
表6反应液2的dNTP浓度的筛选
Figure RE-GDA0003752173010000192
结果表明，当dNTP终浓度为0.3mM时，Ct值比dNTP终浓度为0.2mM靠后1-2 个；当dNTP终浓度为0.1mM时，Ct值较其他两个浓度，都靠前，但空白会出现非特异，反应液1空白的非特异Ct值为40，Tm值为77；反应液2空白的非特异Ct值为39，Tm 值为85。通过比较，当dNTP浓度为0.2mM，检测的Ct值最小，表明检测效率最高。 2.1.2DNA聚合酶浓度的筛选将DNA聚合酶浓度设为0.5U、1.0U、2.0U，分别在两个反应液里检10copies/μL的各靶标质粒，结果见表7-8
表7反应液1的DNA聚合酶浓度的筛选
Figure RE-GDA0003752173010000193
Figure RE-GDA0003752173010000201
表8反应液2的DNA聚合酶浓度的筛选
Figure RE-GDA0003752173010000202
结果表明，当DNA聚合酶终浓度为0.5U时，各靶标的Ct值比0.5U靠后1-2个；当DNA聚合酶终浓度为2.0U时，Ct值较其他两个浓度，都靠前，但空白会出现非特异，反应液1空白的非特异Ct值为41，Tm值为77.51；反应液2空白的非特异Ct值为39.12， Tm值为85.14。通过比较，当DNA聚合酶终浓度为1.0U时，检测的Ct值最小，表明检测效率最高。
实施例二血流感染试剂盒的制备
1.试剂盒组分
1.1.所述试剂盒包括反应液buffer1、反应液buffer2、引物探针Mix1、引物探针Mix2、检测酶液、阳性对照品、阴性对照品。
反应液buffer1包含扩增反应的Tris-HCl缓冲液、氯化钾、硫酸镁、脱氧核糖核苷酸 (5种，dCTP、dGTP、dATP、dTTP、dUTP)、无RNase和DNase水。
反应液buffer2包含扩增反应的Tris-HCl缓冲液、氯化钾、硫酸镁、脱氧核糖核苷酸 (5种，dCTP、dGTP、dATP、dTTP、dUTP)、无RNase和DNase水。
引物探针Mix1包括热带念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌及人源性内参靶标的引物和探针。
引物探针Mix2包括鲍曼不动杆菌、近平滑念珠菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、无乳链球菌及外源性内参靶标的引物和探针。
检测酶液包括热启动的DNA聚合酶、RNaseH2、UDG酶。
阳性对照品为构建的待扩增靶标基因的假病毒，阴性对照品为无RNase和DNase水。
2.本发明的试剂盒检测过程
2.1样本DNA提取
2.1.1在1.5ml无核酸酶离心管中加入3.5μL蛋白酶K、0.5mL裂解液、20μL磁珠(使用前颠倒混匀，使磁珠充分混匀)，取200μL样本，加入配制好的裂解溶液中。充分震荡混匀，室温条件下裂解5min，期间不断颠倒混匀。
2.1.2短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
2.1.3取下离心管，加入500μL洗涤液I，颠倒混匀1min。
2.1.4短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
2.1.5取下离心管，加入500μL洗涤液II，颠倒混匀1min。
2.1.6短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。保持离心管在磁力架上开盖静置3～5min，吸去管底液体。
2.1.7取下离心管，加入60μL洗脱液，震荡混匀，55℃水浴5min，期间轻轻晃动2次。短暂离心收集管内液体，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器将管内液体转移到新的无核酸酶离心管中，所得到的的液体即为待检测样品的DNA。
2.2将反应液buffer1或2、引物探针Mix1或2、检测酶液、DNA模板进行混合
Figure RE-GDA0003752173010000211
Figure RE-GDA0003752173010000221
2.3在荧光PCR仪中按照程序进行扩增:95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，58℃退火，72℃延伸，同时延伸时收集荧光，重复45个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔 0.04℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
2.4扩增结束后，根据荧光曲线进行血流感染病原体的结果判定
2.4.1血流感染病原体检测无明显扩增曲线或检测Ct值＞40，且内参通道检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定血流感染病原体核酸检测阴性；
2.4.2FAM、CY5、ROX、VIC通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40和根据出现溶解曲线的Tm进行结果判定，判定相对应通道Tm值靶标检测阳性。
2.5.本发明的试剂盒对16例临床样本的验证
表9 16例临床样本检测结果统计表(“-”表示检测结果阴性)
Figure RE-GDA0003752173010000222
Figure RE-GDA0003752173010000231
检测2例肺炎链球菌、6例大肠埃希菌、2例肺炎克雷伯菌和6例热带念珠菌均检测为对应的阳性，结果准确。
实施例三本发明试剂盒的灵敏度试验
1.参考品的制备
1.1.各靶标病原体检测限样品的制备
选择各靶标病原菌的菌株，根据浓度进行梯度稀释至100CFU/mL浓度作为检测限样品。
2.试验方案
使用本发明试剂盒按照实施例2所述方法进行检测。
3.检测结果
各靶标病原菌最低检测限为100CFU/mL，结果见图1-2本试剂盒可以检测到100CFU/mL浓度。
实施例四本发明试剂盒的特异性试验
使用本发明试剂盒按照实施例2所述方法检测缓症链球菌、化脓链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、滕黄微球菌、马红球菌、格氏李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、干燥奈瑟氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、葡萄牙念珠菌、嗜肺军团菌(来源于34种细菌和真菌感染多重核酸检测试剂国家参考品)。
检测结果表明，本发明试剂盒检测缓症链球菌、化脓链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、滕黄微球菌、马红球菌、格氏李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、干燥奈瑟氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、葡萄牙念珠菌、嗜肺军团菌(来源于34种细菌和真菌感染多重核酸检测试剂国家参考品)结果均为阴性，熔解曲线结果见图3。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒
<130> PF2256
<160> 126
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgttgttga aagttttgac tattgtaa 28
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggcggga gcaatcctac cg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaattcata tgacgtatcg ca 22
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttattacaat agtcaccgct tgcaacaacg ga 32
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgacgttc agcgggtagt 20
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accacgatgt atctcataac tgtgacctcg aat 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaggcagg agaaatagca 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggggaggacc agtgtagaca ctcagg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctctgctg tgaatgctat ttctcctgcc 30
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accgtggccg tggca 15
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcatgtccgc actgtcatgg tcgtgg 26
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agttgatcgg gacttcacag taga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttcaggttc aggtgaaaca gcacgctatc 30
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaagttgat cgggacttca cagtaga 27
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcgtgaagg caacaacctc tactgtgaag tc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcgtattgct caacaccaaa ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctgtttgag cgtcgtttct ccctcaaac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcttaagttc agcgggtagt cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgccgcaagc aatgtttttg gtta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caatgtgcgt tcaaagattc gatg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taaggcggga tcgctttgac aatgg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttcgtaaat gcacttgctt cagg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taaatatacg ctaagccacg tcca 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacatgcac cgacaggtga agtcgagt 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcaattttct ttgcattttc tacca 25
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<212> DNA
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ccagggcgtg gagattatcg acatctcc 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatctcccc aatgggctgc cg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaggctgtg ttgagcccgc tt 22
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagatagcaa ttggtctctt tcaatcattg cttcg 35
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcgttcattc tgattctctc cttta 25
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tatggataac gtggtgcaac ttgccgac 28
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cacttccgga tagccctcca g 21
<210> 56
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggcggcgca cctcttatcc ac 22
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<211> 23
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tggctcataa gacgtgcttg tag 23
<210> 58
<211> 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 25
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ccttcgattt ctgctttagg ggta 24
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gcacgcccta gaccctcaat atgcacg 27
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<212> DNA
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tgaaacaagt aggttatcaa tatctacacc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgccctaga ccctcaatat gcacgc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccaagttt gcgtgcatat tga 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtacatgt gccttcattg atgctgagca 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgctacaac gacacctggt 20
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<212> DNA
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<211> 31
<212> DNA
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<211> 17
<212> DNA
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cctgtccagc gtgtccg 17
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<212> DNA
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gcggcgcgta gctctcgacc 20
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cttggtggtt actcttgaac tctcagtc 28
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<211> 34
<212> DNA
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<211> 20
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gggtcaggtc ctattgcaat tacttgaaat gcg 33
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caccaaacac cagactgtag agaaga 26
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cgattctgtt tgcacattgc aggtgcttaa t 31
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catgtcctgt aagttgcgga atc 23
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gtttgggcat gcagctccaa gcg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
cggtgtccaa gtcccttgga acagg 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gtgacggtac agctatcaat ggc 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
atctccggac agcgcggtgg ttaaag 26
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tagcctttat caagcggata ctgg 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
ctggcgcgtt gttcctgcac agc 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
atgtgctggc ttcgatgacg 20
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ccaggaatct ccggacagcg cg 22
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ccacgagtag gagtgatgaa gtaga 25
<210> 110
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tgctgtagtg tccaccctct gcttccac 28
<210> 111
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gctttgataa aaggagtcaa ggtagc 26
<210> 112
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ccgccttcac ttctgtattg tccaaaatct gcttc 35
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ttggtctata tgtcgagtgt tgctta 26
<210> 114
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tttccaactt gagagagact tggcggc 27
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
tactccgcct gtctttcaag c 21
<210> 116
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
agcgtcattt ctccctcaaa ccctcgg 27
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ggtttgaggg agaaatgacg ct 22
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat atga 34
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ttcatattac gtatcgcatt tcgct 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat 30
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ggttggcacg caatgaagtc t 21
<210> 122
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ccggttaatg aggctattac tagtgttgac ccatt 35
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ttgaatcaac tgaagcaaat ggatct 26
<210> 124
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
ggttagtcaa gcaaatattg atatgggatt tggga 35
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
caatcacctc tgttgaggct tcta 24
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tcattgcgtg ccaaccctga gaca 24

Claims (10)

1.用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
a.针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50-70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述下游引物及探针分别与各自待测病原体特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RAN碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
c.核酸聚合酶和dNTP，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测病原体生成带荧光标记的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒是单管检测热带念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌的试剂盒，它们的引物和探针如下：
Figure FDA0003655464360000011
Figure FDA0003655464360000021
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，热带念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、和/或肺炎克雷伯菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM，优选地，热带念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，光滑念珠菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，阴沟肠杆菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，白色念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，粘质沙雷菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，奇异变形杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM；和/或，粪肠球菌引物的终浓度为0.1mM和探针终浓度为0.05mM时；和/或，肺炎克雷伯菌引物(KPN-R1)的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.05mM时。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒是单管检测的试剂盒，其检测的是鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和无乳链球菌，它们的引物和探针如下：
Figure FDA0003655464360000022
Figure FDA0003655464360000031
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、克柔念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎链球菌、近平滑念珠菌和/或无乳链球菌引物的终浓度为0.1～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，鲍曼不动杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，大肠埃希菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，表皮葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，屎肠引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.2mM；和/或，铜绿假单胞菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，克柔念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.1mM；和/或，产酸克雷伯菌引物的终浓度为0.2mM和探针终浓度为0.1mM；和/或，肺炎链球菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，近平滑念珠菌引物的终浓度为0.1mM和探的终浓度为0.1mM，和/或，无乳链球菌引物的终浓度为0.2mM和探的终浓度为0.2mM。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其中所述dNTP浓度设为0.2mM。
8.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其中所述聚合酶浓度为1.0U。
9.一种检测多个血流感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的试剂盒第一管试剂和权利要求4所述的试剂盒第二管试剂，在所述第一管试剂中设置有内源性内参质控，在所述第二管试剂中设置有外源性内参质控。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述内源性内参和外源性内参的探针引物如下：
Figure FDA0003655464360000041
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117925874A (zh) * 2024-03-21 2024-04-26 北京起源聚禾生物科技有限公司 检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合及试剂盒
CN117925874B (zh) * 2024-03-21 2024-06-18 北京起源聚禾生物科技有限公司 检测尿路感染病原微生物、耐药基因的引物探针组合及试剂盒

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