用于测序测定的通用对照
技术领域
本发明涉及用于测序测定的通用对照,其可以分别用作阳性和阴性对照以及提取对照。本发明申请描述了相应的质粒、试剂盒、它们的用途以及使用本发明对照检测特定核酸的方法。
背景技术
核酸测序的使用已成为现代医学的多种诊断领域中的必需工具。该领域的实例为肿瘤学,其中使用核酸测序以鉴定(例如)致癌突变是否存在于基因中或者引起和/或指明癌症的移位是否存在于基因组中。此外,使用核酸测序来检测病原微生物(如,例如,细菌或病毒)是否存在于来自人患者的临床样品,如(例如)组织样品或血液样品中。在后一种方法中,检测不存在于人受试者中,而仅存在于微生物中的核酸序列。
通常,在实际测序步骤之前是扩增反应,以扩增待测序的核酸。这种扩增反应通常通过PCR反应进行;因此,在PCR反应中使用杂交至待扩增序列的上游和下游的序列的特异性引物(即引物与待扩增序列侧接)。
由于过去几十年的进步,诊断方法过程中的很多步骤已自动化。这种步骤的实例为从临床样品提取核酸。因此,现在有可能提供几乎如从患者采集状态的临床样品并尤其以充分自动化的方式实施提取步骤。
考虑到上述情况,典型的诊断测定可以涉及回答特定病原体是否存在于来自人受试者的临床样品(例如,来源于呼吸道的样品)中的问题。针对该目标,从人受试者采集临床样品(如,例如,痰液),其中该步骤是在尽可能无菌的条件下进行的。然后,将样品转移到反应小瓶中,其通常是多个小瓶系统的一部分,如,例如,36个小瓶的样品环。当然,还可以平行分析来自其它患者的其它临床样品。然后,将来自这些样品的核酸尤其以自动化方式提取。在下一个自动化步骤中,在小瓶中进行PCR反应,其中使用了特异性引物,导致靶标序列的扩增,所述靶标序列仅存在于病原体中并且特征在于待检测的特定病原体。在下一步中,然后对扩增的核酸测序以鉴定靶标序列。
所述测定可以导致鉴定靶标序列,这将表明临床样品中存在病原体,或者未检测到靶标序列,这将表明临床样品中不存在病原体。
然而,在如上所述的测定中不能排除不正确地进行了所述测定的某些步骤。
不正确地进行的测定的典型实例是由于未正确进行提取步骤而未检测到靶标序列。因此,病原体可能的确存在于样品中,尽管结果为阴性(“假阴性”结果)。为了排除不正确的提取步骤,通常进行提取对照;提取对照通常对应于具有不同于待检测序列的序列的核酸。通常,在开始自动提取步骤之前将该核酸添加(“加标”)到样品中(通常,通过在提取期间将该核酸加入到所使用的裂解缓冲液中)。由于该核酸的序列不同于待检测序列,因此在扩增反应期间使用第二对引物以扩增提取对照序列。测定完成后,提取对照序列的存在表明提取步骤确实正确进行。
因此,提取对照需要另外一对引物,从而具有与用于靶标扩增的引物交叉反应的风险并且提高了成本。
还需确保扩增靶标序列的PCR反应在所应用的条件下进行。针对该目标,应用阳性对照;所述阳性对照通常由确切具有待扩增病毒序列的质粒组成,其包括侧接该序列的区域,所述区域与用于样品扩增反应的引物杂交的序列相同。如果使用用于样品的试剂和条件可以在该阳性对照中检测到序列,则扩增反应确实正确工作。然而,为了确保具有阳性对照或病原体的所有样品无污染,则需要进行阴性对照。
阴性对照反应通常在单独的小瓶中进行,其中仅向该特定小瓶中加入缓冲液而不是样品。阴性对照中靶标序列的存在表明样品被污染。
因此,需要进行需要材料和空间的额外对照反应来作为阴性对照。
综上所述,目前在检测测定中使用的对照需要额外的空间和材料并且提高了交叉反应的可能性。因此,需要改善诊断测序测定中使用的实验对照。
发明的目标和内容
因此,本发明提供了检测样品中包含靶标序列的核酸的存在的新方法、质粒、所述质粒的用途和用于样品中包含靶标序列的核酸的检测的试剂盒。
在第一个方面,本发明涉及检测样品中包含靶标序列(T)的核酸的存在的体外方法,其中所述方法包括以下步骤:
a)提供可能包含含有T的核酸的样品,其中T侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列;
b)将所述样品转移到小瓶V1;
c)提供包含对照序列1(S1)的质粒,其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中T和S1不相同;
d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2;
e)提供包含对照序列2(S2)的质粒,其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中T、S1和S2不相同;
f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶;
g)提取所述小瓶中的核酸;
h)使用引物FOR和REV在所述小瓶中进行PCR反应;
i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序;
其中如果小瓶V2中测序结果是S1和S2的存在并且如果小瓶V1中测序结果是T和S2的存在,则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述含有T的核酸的存在。
需要理解上述测序结果以排他的方式表示,即,未鉴定到其它序列;因此,以上段落还可以如下拟定:其中如果小瓶V2中测序结果仅两个序列,即S1和S2的存在,并且如果小瓶V1中的测序结果仅两个序列,即T和S2的存在,则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述包含T的核酸的存在。如果在核酸中检测到了几个靶标序列,则小瓶V1中的测序结果是这些几个靶标序列和S2的存在。
在优选的实施方式中,所述样品为临床样品,其中所述临床样品优选地来自人受试者。优选地,所述临床样品是组织样品或体液样品。所述样品可以(例如)是从呼吸道、胃肠道或移植后的移植物获得的组织样品。此外,所述样品可以具体地为体液样品,其选自血液、血浆、血清、淋巴液和唾液。
在另一个优选的实施方式中,所述包含T的核酸是来自微生物的核酸。优选地,所述微生物选自细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒。在特别优选的实施方式中,所述微生物为细菌,其选自A群链球菌,包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)的结核分枝杆菌复合群成员,肠沙门氏菌种(Salmonella enterica spp.),艰难梭菌(Clostridiumdifficile),万古霉素耐受性肠球菌(Vancomycin-resistant enterococcus)和二甲氧苯青霉素耐受性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。在另一个特别优选的实施方式中,所述微生物是病毒,其选自腺病毒、禽流感A(H7N9)病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、诺瓦克病毒、BK病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV),具体地,HIV-1、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒和基孔肯亚病毒。在最优选的实施方式中,所述微生物是选自HIV(具体地,HIV-1)、HBV和HCV的病毒。
在特定物种内,可以选择和检测微生物不同的基因型,如(例如)诺瓦克病毒的GI和Gil基因型;HIV的亚型A至K;HBV的基因型A至H和HCV的基因型1至4。
在特别优选的实施方式中,所述包含靶标序列(T)的核酸是双链DNA。
在特别优选的实施方式中,本发明所述的方法因此可以用于检测样品中微生物的存在,具体地,如上所述的微生物。
在另一个优选的实施方式中,所述包含T的核酸是致癌基因,优选地人致癌基因。优选地,所述人致癌基因选自主要BCR-ABL、次要BCR-ABL、BCR-AML1ETO、PML-RARA、BRAFV600突变体、KRAS突变体和NRAS突变体。
在特别优选的实施方式中,本发明所述的方法因此可以用于检测样品中致癌基因的存在,具体地,如上所述的致癌基因。
在另一个优选的实施方式中,S1和S2与T没有同源性并且选择它们从而使用用于T扩增的试剂和条件扩增它们(这适用于(例如)S1和S2的含量)。S1和S2可以(例如)来源于植物基因组,具体地,烟草花叶病毒(TMV)。然而,S1和S2还可以是非天然存在的人工序列。
特别优选地,T、S1和S2的长度小于或等于约2000个碱基。特别优选地,长度小于或等于约1000个碱基,优选地,约600个碱基或约400个碱基。
在另一个实施方式中,与第一方面有关,步骤c)和e)的所述质粒是原核或真核质粒。特别优选地,使用原核质粒,具体地,常用的大肠杆菌(E.coli)质粒。
在另一个优选的实施方式中,通过将所述质粒加入到裂解缓冲液中(核酸提取期间,在所有小瓶中使用所述裂解缓冲液),然后加入包含所述质粒的所述裂解缓冲液用于浸出步骤来将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶中。
在另一个优选的实施方式中,步骤h)中进行的所述PCR-反应是RT-PCR-反应。当然,如果包含靶标序列(T)的核酸是单链或双链RNA,则这是特别适用的。
在另一个优选的实施方式中,以任选地全自动化方式进行所述提取步骤g),步骤h)的所述PCR反应和步骤i)的所述测序。特别优选地,使用以下装置:对于步骤g),SentosaSX101装置(Vela Diagnostics)或者epMotion系统(Eppendorf)、步骤h)中Rotor-Gene Q(Qiagen)和步骤i)中Ion Torrent半导体测序装置(life technologies)。
在另一个优选的实施方式中,通过单分子实时测序、离子半导体测序、焦磷酸测序、合成测序、连接测序和链终止测序进行步骤i)的所述测序。特别优选离子半导体测序。
在本发明第一方面的另一个优选的实施方式中,在至少两个样品中平行检测包含靶标序列(T)的核酸的存在。因此,本发明还涉及检测至少两个样品SAl和SA2中包含靶标序列(T)的核酸的存在的体外方法,其中所述方法包括以下步骤:
a)提供可能包含含有T的核酸的样品SAl和SA2,其中T侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列。
b)将SAl转移到小瓶V1,将SA2转移到小瓶V3;
c)提供包含对照序列1(S1)的质粒,其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中T和S1不相同;
d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2;
e)提供包含对照序列2(S2)的质粒,其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中T、S1和S2不相同;
f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶;
g)提取所述小瓶中的核酸;
h)使用引物FOR和REV在所述小瓶中进行PCR反应;
i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序;
其中如果小瓶V2中测序结果是S1和S2的存在并且如果小瓶V1和V3中测序结果是T和S2的存在,则小瓶V1和V3中T的存在表明样品SAl和SA2中所述包含T的核酸的存在。
因此,上述装置可以用于平行分析样品,优选至多达15个样品(其中平行分析7或15个样品是特别优选的);这还可以称为多路方法。如果包含T的核酸是致癌基因,则可以优选地平行进行7个样品的分析(加上一个额外的对照样品8);如果包含T的核酸是来自微生物的核酸,则可以特别优选地平行进行15个样品的分析(加上一个额外的对照样品16)。一般地,如果小瓶V2中的测序结果是S1和S2的存在,并且如果相应样品小瓶中的测序结果T和S2的存在,则包含T的核酸存在于样品中。
需要理解在本发明的一些实施方式中分析了包含在核酸中的至少两个靶标序列。因此,本发明还涉及检测样品中包含至少两个靶标序列(T1和T2)的核酸的存在的体外方法,其中所述方法包括以下步骤:
a)提供可能包含含有T1和T2的核酸的样品,其中T1侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列并且T2侧接杂交至正向引物(FOR1)的序列和杂交至反向引物(REV1)的序列;其中T1和T2不相同,其中FOR和FOR1不相同,并且其中REV和REV1不相同。
b)将所述样品转移到小瓶V1;
c)提供包含对照序列1(S1)和对照序列3(S3)的质粒,其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中S3侧接杂交至FOR1的序列和杂交至REV1的序列,并且其中T1、T2、S1和S3不相同;d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2;
e)提供包含对照序列2(S2)的质粒,其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列,其中T、S1和S2不相同;
f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶;
g)提取所述小瓶中的核酸;
h)使用引物FOR、REV、FOR1和REV1在所述小瓶中进行PCR反应;
i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序;
其中如果小瓶V2中测序结果是S1、S2和S3的存在并且如果小瓶V1中测序结果是T1、T2和S2的存在,则小瓶V1中T1和T2的存在表明上述样品中所述包含T1和T2的核酸的存在。
上述装置因此可以用于通过检测所述核酸中至少两个靶标序列的存在来表征特定核酸。该装置可以具体地用于提高所述方法的特异性。
在第二个方面,本发明涉及包含对照序列(S)的质粒,其中S侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列,其中所述杂交至FOR和REV的序列是来源于核酸的序列,所述核酸包含所述杂交至FOR的序列、然后是靶标序列(T),然后是所述杂交至REV的序列,并且其中S和T不相同。
在优选的实施方式中,扩增反应期间,FOR和REV与所述质粒的杂交导致S的扩增。
在优选的实施方式中,包含所述杂交至FOR的序列,然后是T,然后是所述杂交至REV的序列的所述核酸是来自微生物的核酸。
优选地,所述微生物选自细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒。在特别优选的实施方式中,所述微生物为细菌,其选自A群链球菌,包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)的结核分枝杆菌复合群成员,肠沙门氏菌种(Salmonellaenterica spp.),艰难梭菌(Clostridium difficile),万古霉素耐受性肠球菌(Vancomycin-resistant enterococcus)和二甲氧苯青霉素耐受性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。在另一个特别优选的实施方式中,所述微生物是病毒,其选自腺病毒、禽流感A(H7N9)病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、诺瓦克病毒、BK病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV),具体地,HIV-1、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒和基孔肯亚病毒。在最优选的实施方式中,所述微生物是选自HIV(具体地,HIV-1)、HBV和HCV的病毒。
在另一个优选的实施方式中,所述包含T的核酸是致癌基因,优选地人致癌基因。优选地,所述人致癌基因选自主要BCR-ABL、次要BCR-ABL、BCR-AML1ETO、PML-RARA、BRAFV600突变体、KRAS突变体和NRAS突变体。
在另一个优选的实施方式中,S与T没有同源性,并且选择S从而使用用于T扩增的试剂和条件扩增所述序列(这适用于(例如)S的含量)。S可以(例如)来源于植物病毒基因组,具体地,烟草花叶病毒(TMV)。然而,S还可以是非天然存在的人工序列。
特别优选地,T和S的长度小于或等于约2000个碱基。特别优选地,长度小于或等于约1000个碱基,优选地,约600个碱基或约400个碱基。
在另一个实施方式中,所述质粒是原核或真核质粒。特别优选地,使用原核质粒,具体地,常用的大肠杆菌(E.coli)质粒。
在另一个实施方式中,在根据本发明第一方面所述的方法的步骤c)中使用所述质粒并且将其用作阳性和阴性对照。
在另一个实施方式中,在根据本发明第一方面所述的方法的步骤e)中使用所述质粒并且将其用作提取对照。
本发明还涉及根据本发明第二方面所述的质粒在设计用于在样品反应(SR)中检测样品中T的存在的测序测定中的用途,其中所述质粒在对照反应(CR)中使用并且其中CR和SR是单独的反应。
此外,本发明涉及根据本发明第二方面所述的质粒在设计用于在样品反应(SR)中检测样品中T的存在的测序测定中的用途,其中在从中提取核酸前,将所述质粒加入到所述SR中。
在第二方面,本发明还涉及质粒,其包含对照序列1(S1),其中S1侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列,和对照序列2(S2),其中S2侧接杂交至正向引物(FOR1)的序列和杂交至反向引物(REVl)的序列,其中所述杂交至FOR、FOR1、REV和REVl的序列是来源于这样的核酸的序列,所述核酸包含所述杂交至FOR的序列、然后是靶标序列1(T1),然后是所述杂交至REV的序列,和所述杂交至FOR1的序列、然后是靶标序列2(T2),然后是所述杂交至REV1的序列,并且其中S1、S2、T1和T2不相同。所述质粒优选地用作阳性和阴性对照两者。
在第三方面,本发明涉及用于样品中包含靶标序列(T)的核酸的检测的试剂盒,其中所述试剂盒包含
(a)引物FOR和REV,其中FOR和REV杂交至侧接T的序列;
(b)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列1(S1),然后是杂交至REV的序列;
(c)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列2(S2),然后是杂交至REV的序列;
其中T、S1和S2不相同。
在其实施方式中,本发明涉及用于样品中包含靶标序列1和2(T1和T2)的核酸的检测的试剂盒,其中所述试剂盒包含
(a)引物FOR和REV,其中FOR和REV杂交至侧接T1的序列;
(b)引物FOR1和REV1,其中FOR1和REVl杂交至侧接T2的序列;
(c)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列1(S1),然后是杂交至REV的序列,和杂交至FOR1的序列,然后是对照序列3(S3),然后是杂交至REV1的序列;
(d)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列2(S2),然后是杂交至REV的序列;
其中T1、T2、S1、S2和S3不相同,其中FOR和FOR1不相同并且其中REV和REVl不相同。
本发明还公开了以下试剂盒:用于样品中包含靶标序列(T)的核酸的检测的试剂盒,其中所述试剂盒包含
(a)引物FOR和REV,其中FOR和REV杂交至侧接T的序列;
(b)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列1(S1),然后是杂交至REV的序列;其中T和S1不相同。
在其实施方式中,本发明涉及用于样品中包含靶标序列1和2(T1和T2)的核酸的检测的试剂盒,其中所述试剂盒包含
(a)引物FOR和REV,其中FOR和REV杂交至侧接T1的序列;
(b)引物FOR1和REV1,其中FOR1和REV1杂交至侧接T2的序列;
(c)质粒,其包含杂交至FOR的序列,然后是对照序列1(S1),然后是杂交至REV的序列,和杂交至FOR1的序列,然后是对照序列2(S2),然后是杂交至REV1的序列;
其中T1、T2、S1和S2不相同,其中FOR和FOR1不相同并且其中REV和REVl不相同。
在优选的实施方式中,如上所述的试剂盒包括使用说明书。
最后,在第四方面,本发明涉及根据本发明第三方面的试剂盒分别在用于样品中包含靶标序列(T)的核酸或包含靶标序列1和2(T1和T2)的核酸的检测的方法中的用途。
附图说明
图1A以5'至3'的方向显示了包含在根据本发明的质粒中的序列的示意图:杂交至正向引物的序列、然后是对照序列、然后是杂交至反向引物的区域。
图1B仍以5'至3'的方向显示了用作根据本发明的阳性和阴性对照的包含在质粒中的两个对照序列的示意图。具体实例涉及包含在HCV核酸中的两个基因,即NS3和NS5B区:杂交至NS3-正向引物(用于样品中NS3的扩增)的序列、对照序列S1、然后是杂交至NS3-反向引物(用于样品中NS3的扩增)的序列;然后是杂交至NS5B-正向引物(用于样品中NS5B的扩增)的序列、对照序列S2、然后是杂交至NS5B-反向引物(用于样品中NS5B的扩增)的序列。
图1C仍以5'至3'的方向显示了用作根据本发明的提取对照的包含在质粒中的序列的示意图。具体实例涉及包含在HCV核酸中的基因,即NS5B区:杂交至NS5B-正向引物(用于样品中NS5B的扩增)的序列、对照序列S3、然后是杂交至NS5B-反向引物(用于样品中NS5B的扩增)的序列。
具体实施方式
本发明的发明人尤其在提供通用测序对照中获得了成功,所述通用测序对照可以在测序测定中用作阳性和阴性以及提取对照。
在更详细地描述本发明的一些实施方式之前,引入以下定义。
定义
除非上下文中明确规定,否则如本说明书和权利要求中所使用的,单数形式的“一个”也包括相应的复数形式。
在本发明的上下文中,术语“约”表示本领域技术人员将理解的、仍然确保相关特征的技术效果的准确度间隔。该术语通常表示与指定数值±10%,并且优选地±5%的偏差。
需要理解术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的,术语“由…组成”应认为是术语“包括”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少某些实施方式,则这还意味着涵盖了优选地仅由这些实施方式组成的组。
如本文所使用的术语“检测存在”应理解为“检测存在或不存在”。如在本发明申请所主张的方法中提及的,待分析的样品可能包含含有靶标序列的核酸。因此,可能存在(例如)患者感染丙型肝炎病毒的指示,并且通过根据本发明的方法分析了可能包含HCV核酸的相应血液样品。假定所有对照表示测定已正确进行,结果为靶标序列(并因此病毒)存在或不存在——相应地,检测了所述样品中靶标序列的存在或不存在。
在本发明的上下文中,术语“核酸”是指处于单链或双链形式的天然存在的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物。所述核酸可以具体地为双链DNA和单链RNA。
如本文所使用的术语“序列”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中碱基的顺序出现,其中脱氧核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、T、G和C,并且核糖核苷酸聚合物中存在的碱基选自A、U、G和C。因此,脱氧核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAGCAAGCCT(SEQ ID No:14),而核糖核苷酸聚合物中碱基序列可以是(例如)GGAAUCGAUAU(SEQ ID No:15)。
如本文所提及的“靶标序列”是核酸中的序列,在根据本发明所述的方法中检测其存在;“靶标序列”特征在于检测其存在的特定核酸。如果(例如)检测HCV核酸,则靶标序列可以(例如)包括HCV的NS3和/或NS5A和/或NS5B基因(参见实施例1和2)。
如本文所使用的,术语“样品”是指来自任何人或兽医受试者的可以测试包含靶标序列的核酸的存在性的任何生物样品。所述样品可以包括得自任何器官的组织,如(例如)肺组织;和得自任何器官的液体,如(例如)血液、血浆、血清、淋巴液、关节液、脑脊髓液、羊膜水、羊膜脐血、泪、唾液和鼻咽清洗液。如上所列,样品还可以来源于身体的特定区域,例如,呼吸道;来自呼吸道的样品包括喉拭子、喉清洗液、鼻拭子和来自下呼吸道的样品。
具体地,样品可以来源于人或兽医受试者。因此,“患者”可以是人或兽医受试者。如果提及“临床样品”,则这表示该样品来自于怀疑带有包含靶标序列的核酸的患者。
如本文所使用的与序列有关的术语“侧接”是指描述为侧接特定序列(例如,杂交至正向引物的序列和杂交至反向引物的序列)的两条序列由所述特定序列的上游和下游构成。如果在该背景中提及杂交至正向引物的序列,则该区域存在于上游,即所述序列的5'端。在靶标序列之后,然后是杂交至反向引物的序列,即所述序列的下游或3'端。这种结构也可以来源于图1A。
术语“引物”是指能够起与核酸链互补的引物延伸产物的5'至3'合成的起始点的作用的寡核苷酸。在存在适当的核苷酸和用于聚合反应的试剂(如DNA聚合酶)的情况下,在适当的缓冲液中并且在适合的温度下合成引物延伸产物。可以使用(例如)计算机程序,如OLIGO(Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,Colorado)设计引物。当设计引物时,重要的特征包括适当大小的扩增产物(优选地,在以上所列区域中)以有利于检测,对于引物对成员来说类似的解链温度和每个引物的长度(即引物需要足够长从而以序列特异性退火并起始合成,但是不能过长从而在寡核苷酸合成期间使保真度降低)。通常,引物长度为15至30个核苷酸。
杂交至特定序列上游区域的“正向引物”和杂交至特定序列下游区域的“反向引物”将杂交,从而所述特定序列将在PCR扩增反应期间扩增。如果样品中存在双链DNA或cDNA,则正向引物将杂交至上游区域从而其3'端指向要扩增的序列;反向引物的3'端也指向要扩增的序列。如在每个PCR装置中,引物因此将杂交至不同的链;正向引物杂交至非编码链,而反向引物杂交至编码链。
如本文所使用的,术语“扩增”是指酶介导的程序,其能够产生数十亿的核酸靶标的拷贝。本领域中已知的酶介导的靶标扩增程序的实例包括PCR。
如本文所使用的术语“杂交”是指在本发明中,在单链核酸的两条或更多条互补链之间建立非共价、序列特异性相互作用,从而成为复合物,优选地双螺旋的方法。
术语“小瓶”是指诊断测定中常用的反应小瓶。所述小瓶可以包括在多孔板(multiplate)中,例如,96孔板,并因此还可以被称为是“孔”,或者它可以包含在样品环上,例如,36个小瓶的样品环。如果将对象“转移”到小瓶中,则在该步骤中优选地使用尽可能的无菌条件;在一些装置中,转移步骤可以通过将对象吸取到小瓶中来进行;这可以通过自动化方式进行。在本发明的背景中,典型的“对象”是临床样品、包含在缓冲液中的质粒或包含质粒的细胞。如果将包含质粒的细胞转移到小瓶中,则这还可以通过将所述细胞添加到提取过程中使用的特定缓冲液中来完成,例如,裂解缓冲液。
在本文中根据分子生物学中的标准含义使用术语“质粒”。任何类型的原核或真核载体可以用于本发明的目的,即用于作为阳性和阴性对照以及提取对照使用的质粒。这些质粒的实例为TMV质粒。
如本文结合“非同一序列”所使用的术语“同一的”是指序列彼此在至少一个碱基中是不同的。如上所述,然而,优选地,序列完全未显示出同源性,至少在靶标序列和对照序列方面未显示出。不同的对照序列可以显示出一定程度的同源性,但是彼此必须明显地是可区分的。实现这一点在于其中对照序列彼此也具有至少一个碱基的差异。在优选的实施方式中,T因此未显示出与S1和S2的同源性,其中S1和S2可能具有一定同源性,但是彼此具有至少一个碱基的差异,优选地,大于1个碱基的差异。
“提取核酸”是指存在于小瓶中的任何核酸从任何细胞背景中基本上分离,具体地,从完整细胞分离。优选地,在所述方法过程中还清洗核酸并任选地浓缩。提取后,小瓶中存在的基本上所有完整细胞都已裂解,并且基本上所有与核酸无关的细胞碎片都已去除。典型的提取方法可以包括低渗裂解缓冲液、热和/或去污剂的使用,并且所述提取方法是技术人员已知的。根据本发明的特别优选的提取方法包括以下步骤:
—将蛋白酶K加入至常用裂解缓冲液;如果后续步骤包括进行反转录(通过RT-PCR)的步骤,则还可以将载体RNA加入至裂解缓冲液;此外,如上所述,还可以将提取对照质粒加入至裂解缓冲液(“加标到裂解缓冲液”)。
—将如上所述的裂解缓冲液加入至样品中,并将样品在60℃孵育10分钟,优选地同时混合样品;
—优选地使用常用于捕获核酸的磁珠,以从样品分离核酸(根据标准规程);因此,下一步可以包括:
○在细胞裂解后,将结合缓冲液加入至样品;
○加入用于捕获核酸的磁珠;
○通过磁铁收集磁珠,并除去上清液(优选地,在短暂孵育后)。
○任选地,将几个不同的(优选地,两个)清洗缓冲液添加至珠,并通过清洗所述珠顺序进行几个(优选地,两个)清洗步骤(混合、通过磁铁收集珠并除去上清液;加入下一种清洗缓冲液);
○然后,将珠典型地干燥;
○将洗脱缓冲液添加至珠,并通常将样品混合,优选地,在短暂孵育后;
○通过磁铁收集磁珠,并收集包含洗脱的核酸的上清液;
—在后续步骤中使用包含洗脱的核酸的上清液(对应于“提取的核酸”)。
Mullis等人在美国专利No.4,683,195中以及Mullis在美国专利No.4,683,202中首先描述了“PCR反应”用于DNA的扩增,并且“PCR反应”对本领域那些技术人员是熟知的。在PCR技术中,将DNA样品在溶液中与下列物质混合:摩尔过量的、制备为与DNA双螺旋的每条链的3'端互补的至少两种寡核苷酸引物(参见上文,正向和反向引物);摩尔过量的核苷酸碱基(即,dNTP);和热稳定性DNA聚合酶(优选地Taq聚合酶),其催化从寡核苷酸引物和dNTP形成DNA;在引物中,至少一个是正向引物,其将以5'至3'方向与变性DNA分析物的一条链(在上述定义中,非有义链)的3'端结合,并且另一个为反向引物,其将以3'至5'方向与变性DNA分析物的另一条链(在上述定义中,有义链)的5'端结合。将溶液加热至约94-96℃以使双链DNA变性为单链DNA。当溶液冷却并达到所谓的退火温度时,引物结合至分开的链,并且DNA聚合酶通过将dNTP加入到引物中来催化分析物的新链。当重复该过程并且将从引物合成的延伸产物与它们的互补物分离时,每个延伸产物用作从另一个引物合成的互补延伸产物的模板。由于每次循环后扩增序列加倍,因此在将该过程重复几小时后可以达到巨大的理论扩增拷贝数;因此,可以在相对短的时间段内使用PCR扩增极少量的DNA。
当PCR反应的起始材料为RNA时,通过反转录从RNA合成了互补DNA(“cDNA”)。然后,使用如上所述的PCR方案扩增所得的cDNA。作为反转录病毒中存在的酶,反转录酶是本领域那些技术人员已知的,其可以从作为模板的mRNA序列合成DNA的互补单链。用于扩增RNA产物的PCR被称为反转录酶PCR或者“RT-PCR”。
如以上定义中所使用的,术语“互补”和“基本互补”是指核苷酸或核酸之间的碱基配对,如(例如)双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间的碱基配对。互补核苷酸通常为A和T(或A和U)以及G和C。
在本文中以分子生物学中的常规含义使用术语“测序”。因此,确定了核酸序列中准确的碱基顺序出现。
如本文所使用的术语“微生物”以其最广泛的含义使用。因此,微生物可以是任何类型的细菌、古菌、原生动物(protozoum)、真菌和病毒。明确提及病毒在如本文所使用的“微生物”的定义内。
在本文中分别以分子生物学和肿瘤学中的常规含义使用术语“致癌基因”。因此,存在(例如)在基因中已知的突变,其使得“正常或野生型”基因具有致癌性,即引起癌症的;这方面的实例是使激酶具有组成型活性从而持续发出特定信号(例如,诱导生长信号)并起始相应过程的突变。如本文所使用的“致癌基因”还可以涉及也会导致引起癌症情况的染色体内或染色体间易位。
术语“多路”是指在几个样品中检测特定核酸的存在,其中同时进行相应测定,即通常平行进行本发明方法的步骤。
应理解尽管已结合本文所述的实施方式描述了本发明,但是上述描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。本发明的范围内的其它方面、优势和改变对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。
本文提及的所有专利和专利公开以其全部内容作为参考并入。
提供以下实施例,从而为本领域的技术人员提供如何制备和使用本发明的组合物的完整公开和描述。所述实施例旨在作为本发明的非限制性实施例。尽管已尽力确保变量,如量、温度等的准确度,但是应考虑实验误差和偏差。除非另外说明,否则份数是重量份数,温度是摄氏度,并且压力为或接近大气压。除非另外说明,否则所有组分是可商业获得的。
实施例
实施例1:用作阳性和阴性对照的质粒
本测定的目标(如实施例3中更详细地描述的)是临床样品中丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的存在与否的检测。在HCV核酸中,有两条靶标序列要检测;这些序列包含在HCV的基因NS3和NS5B中。
用作阳性和阴性对照的质粒包含以下序列(5'至3'方向,参见图1B):
—来源于NS3HCV基因的引物区(用浅灰色突出),其中用下划线表示与NS3-正向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,正向引物杂交至如下所示的链的互补链):SEQ ID NO:1
—来源于烟草花叶病毒(TMV)的序列,其显示与HCV NS3基因(以下称为S1)无同源性;SEQ ID NO:2
—来源于NS3HCV基因的引物区(用浅灰色突出),其中用下划线表示与NS3-反向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,反向引物杂交至如下所示的链);SEQ ID No:3
—来源于NS5B HCV基因的引物区(用深灰色突出),其中用下划线表示与NS5B-正向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,正向引物杂交至如下所示的链的互补链):SEQ IDNo:4
—来源于TMV的第二序列(S2),其显示与HCVNS5B基因无同源性并且其不同于S1;SEQ ID No:5
—来源于NS5B HCV基因的引物区(用深灰色突出),其中用下划线表示与NS5B-反向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,反向引物杂交至如下所示的链);SEQ ID No:6
包含以上元件的示例性序列如下所示(SEQ ID No:7):
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
ggaagcaagccgcggaaatgatcagaagacgtgcgaattcctcagggattattgtggcca
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如实施例3所述进行所述测定。对照小瓶中序列S1和S2的成功检测(包含含有如上所示的序列的质粒)将表明分别使用引物对NS3-for和NS3-rev以及NS5B-for和NS5B-rev的PCR反应正常工作(阳性对照)。如果检测到了S1和S2,则可以排除样品被污染(例如,被包含病毒或病毒本身的样品污染),这是因为HCV基因NS3和NS5B的序列也将在该对照(阴性对照)中检测。不需要其它阴性对照。如实施例2中所讨论的,通常也将提取对照质粒加入小瓶。
实施例2:用作提取对照的质粒
基本装置与以上所列的装置相同。因此,该测定的目标是检测临床样品中来自丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的存在与否,其中检测了包含在HCV的基因NS3和NS5B中的HCV-序列。
用作提取对照的质粒包括以下序列(5'至3'方向,参见图1C):
—来源于NS5B HCV基因的引物区(用浅灰色突出),其中用下划线表示与NS5B-正向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,正向引物杂交至如下所示的链的互补链):SEQ IDNo:1
—来源于TMV(S3)的第二序列,其显示与HCV NS5B基因无同源性并且不同于S1和S2;SEQ ID NO:8
—来源于NS5B HCV基因的引物区(用深灰色突出),其中用下划线表示与NS5B-反向引物杂交的序列(注:扩增反应期间,反向引物杂交至如下所示的链);SEQ ID No:3。
以下显示了示例性序列(SEQ ID NO:9):
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
gcatctggtatcaaagaaagagcggggacgtcacgacgttcattggaaacactgtgatca
ttgctgcatgtttggcctcgatgcttccgatggagaaaataatcaaaggagccttttgtg
gtgacgatagtctgctgtactttccaaagggttgtgagtttccggatgtgcaacactccg
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CAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCAGGAGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT
如实施例3所述进行测定,其中将标准化的量的提取对照质粒加标到所有样品提取步骤中使用的裂解缓冲液中,包括实施例2的对照。
包含样品(和以上质粒)的小瓶中HCV靶标序列和序列S3的成功检测将至少表明提取步骤正确工作(提取对照)。如果仅检测到HCV靶标序列,则提取步骤未正确进行——相反,该结果指示了病毒DNA对样品的污染。对于包含在提取对照细胞中的序列的扩增反应,无需其它引物对。
实施例3:使用实施例1和2的质粒的测定
实施以下所述的测定以确定临床样品(如来自人受试者的血液)中丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的存在与否。
使用Vela Diagnostics的Sentosa SX101装置、Qiagen的Rotor-Gene Q装置和life technologies的Ion Torrent半导体测序装置进行测定。
在适合的小瓶或孔中提供待分析的临床样品;还可以提供其它样品(当然,在不同的小瓶中),其中可以平行分析所有样品。将实施例1的质粒以适当的浓度和体积置于另一个小瓶中。所有小瓶/孔(包括包含实施例1的质粒的小瓶)中的样品在第一步进行SentosaSX101装置的自动提取方法。该方法使用在裂解缓冲液中的实施例2的质粒;因此,然后提取了所有小瓶中的核酸。
在下一步中,将样品自动转移到样品环中。该样品环可以包括至多达72个小瓶,其中阳性对照(即实施例1的质粒)可以转移到小瓶1中,样品可以转移到小瓶2至72中。
Sentosa SX101装置也能够自动加载具有在下一步中使用的成分的样品——在本实施例中,下一步是RT-PCR,这是因为HCV是RNA病毒。因此,需要在要检测的NS3和NS5B-基因的区域中进行初始RT-PCR。将相应成分加入至所有小瓶(即小瓶1至72)中提取的核酸中。所述成分包括酶:反转录酶和Taq聚合酶以及以下引物:
NS3_fw: TGGGGGGCAGATACCGC(SEQ ID No.:10)
NS3_rev: AGGAACTTGCCGTAGGTGGAGTA(SEQ ID No.:11)
NS5B_fw: CCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTA(SEQ ID No.:12)
NS5B_rev: TGAGACACGCTGTGATAAATGTC(SEQ ID No.:13)
然后,将包含提取的核酸以及RT-PCR所需的所有组分的样品环转移到Rotor-GeneQ装置,其中根据标准方案进行RT-PCR反应。
然后,将样品从各个小瓶转移到Ion Torrent半导体测序装置中使用的微孔中。根据标准方案进行测序(包括将扩增的核酸片段化的任选的必需步骤)。
根据实施例1的质粒包含在小瓶1中;如上所述,还对该小瓶进行提取步骤——因此,将包含实施例2的质粒的裂解缓冲液加入至该小瓶。序列S1和S2的成功检测表明正确进行了PCR反应。因此,根据实施例1的质粒用作PCR-反应的阳性对照。由于还加入了实施例2的质粒,还应检测序列S2——如果除S1、S2和S3外,在小瓶1中未检测到其它序列,则可以排除样品污染。因此,该反应也用作阴性对照。如上所述,在所有样品中,将根据实施例2的质粒加入至用于核酸提取的裂解缓冲液中。在所有小瓶中,通过序列S3的存在表明了核酸的成功提取。
如果在HCV中待检测的序列,即基因NS3和NS5B中的区域也(除序列S3之外)存在于小瓶2中(并且,如果适用,存在于所有其它样品小瓶中),则确实存在来源于HCV的核酸。这表明临床样品中HCV的存在。
如果在小瓶2中仅检测到序列S3,则在样品中不存在来自HCV的核酸;因此,可以排除HCV感染。