JP2017510247A - シークエンシングアッセイに対するユニバーサルコントロール - Google Patents
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Abstract
Description
a)Tの両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b)前記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c)対照配列1(S1)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d)前記工程c)のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e)対照配列2(S2)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f)前記工程e)のプラスミドを前記バイアルに移す工程と、
g)前記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h)プライマーFOR及びプライマーREVを使用して前記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i)前記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在を生じる場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在を生じる場合、バイアルV1におけるTの存在が前記サンプルにおけるTを含む前記核酸の存在を示す、方法に関する。
a)Tの両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルSA1及びサンプルSA2を準備する工程と、
b)SA1をバイアルV1に移し、SA2をバイアルV3に移す工程と、
c)対照配列1(S1)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d)上記工程c)のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e)対照配列2(S2)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f)上記工程e)のプラスミドを上記バイアルに移す工程と、
g)上記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h)上記プライマーFOR及びプライマーREVを使用して上記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i)上記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2のシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在をもたらす場合、かつバイアルV1及びバイアルV3におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在をもたらす場合、バイアルV1及びバイアルV3におけるTの存在がサンプルSA1及びサンプルSA2中のTを含む上記核酸の存在を示す、方法にも関する。
a)T1の両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列があり、T2の両側にフォワードプライマー(FOR1)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV1)にハイブリダイズする配列があり、T1とT2とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、T1及びT2を含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b)上記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c)対照配列1(S1)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、対照配列3(S3)の両側にFOR1にハイブリダイズする配列及びREV1にハイブリダイズする配列があり、T1とT2とS1とS3とが同一ではない、S1及びS3を含むプラスミドを準備する工程と、
d)上記工程c)のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e)対照配列2(S2)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f)上記工程e)のプラスミドを上記バイアルに移す工程と、
g)上記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h)上記プライマーFOR、REV、FOR1及びREV1を使用して上記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i)上記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1、S2及びS3の存在をもたらす場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT1、T2及びS2の存在をもたらす場合、バイアルV1におけるT1及びT2の存在が上記サンプル中のT1及びT2を含む上記核酸の存在を示す、方法にも関する。
Sの両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列があり、
FOR及びREVにハイブリダイズする前記配列が、FORにハイブリダイズする前記配列、その後に続く標的配列(T)、その後に続くREVにハイブリダイズする前記配列を含む核酸に由来する配列であり、SとTとが同一ではない、プラスミドに関する。
(a)FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
(b)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1(S1)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
(c)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2(S2)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とS2とが同一ではない、キットに関する。
(a)FOR及びREVがT1に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
(b)FOR1及びREV1がT2に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR1及びプライマーREV1と、
(c)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1(S1)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列、及びFOR1にハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列3(S3)、その後に続くREV1にハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
(d)FORハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2(S2)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、T1とT2とS1とS2とS3とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、キットに関する。
(a)FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
(b)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1(S1)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とが同一ではない、キットも開示する。
(a)FOR及びREVがT1に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
(b)FOR1及びREV1がT2に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR1及びプライマーREV1と、
(c)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1(S1)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列、及びFOR1にハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2(S2)、その後に続くREV1にハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、T1とT2とS1とS2とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、キットに関する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形(the singular forms of "a" and "an")は文脈により特に明確に指定のない限り、対応する複数形も包含する。
−プロテイナーゼKを一般的に使用される溶解バッファーに添加し、後の工程が(RT-PCRにより)逆転写を行う工程を含む場合、キャリアRNAを溶解バッファーに添加してもよく、さらに、上に概説されるように、抽出対照プラスミドを該溶解バッファーに添加してもよい(「溶解バッファーにスパイクする」)、
−上に記載される溶解バッファーをサンプルに添加し、好ましくはサンプルを混合しながら、サンプルを60℃で10分間インキュベートする、
−(標準的なプロトコルに従って)サンプルから核酸を単離するため、核酸を捕捉するために一般的に使用される磁性ビーズを使用することが好ましく、したがって、次の工程は以下を含んでもよい:
○細胞の溶解後に結合バッファーをサンプルに添加する、
○核酸を捕捉するため磁性ビーズを添加する、
○磁性ビーズを磁石によって収集し、(好ましくは短いインキュベーションの後)上清を除去する、
○任意に幾つかの異なる(好ましくは2つの)洗浄バッファーをビーズに添加し、幾つかの(好ましくは2つの)洗浄工程を、ビーズを洗浄することによって順次行う(混合し、磁石によってビーズを収集し、上清を除去し、次の洗浄バッファーを添加する)、
○その後、通例ビーズを乾燥する、
○ビーズに溶離バッファーを添加し、好ましくは短いインキュベーションの後に、通例サンプルを混合する、
○磁性ビーズを磁石により収集し、溶離された核酸を含む上清を収集する、
−溶離された核酸(「抽出された核酸」に対応する)を含む上清を後の工程で使用する。
本アッセイ(実施例3により詳細に記載される)の目標は、臨床サンプル中のC型肝炎ウイルス(HCV)の核酸の有無の検出である。HCV核酸には検出される2つの標的配列があり、これらの配列はHCVの遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bに含まれる。
−NS3 HCV遺伝子に由来するプライマー領域(薄い灰色で強調される)であって、NS3フォワードプライマーにハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする);配列番号1
−HCV NS3遺伝子に相同性を示さない、タバコモザイクウイルス(TMV)に由来する配列(以下S1と呼ぶ);配列番号2
−NS3 HCV遺伝子に由来するプライマー領域(薄い灰色で強調される)であって、NS3リバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする);配列番号3
−NS5B HCV遺伝子に由来するプライマー領域(濃い灰色で強調される)であって、NS5Bフォワードプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする);配列番号4
−HCVのNS5B遺伝子に対して相同性を示さず、S1と異なる、TMVに由来する第2の配列(S2);配列番号5
−NS5B HCV遺伝子に由来するプライマー領域(濃い灰色で強調される)であって、NS5Bリバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする);配列番号6。
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
ggaagcaagccgcggaaatgatcagaagacgtgcgaattcctcagggattattgtggcca
cgaaggataacgttaaaaccgttgattctttcatgatgaattttgggaaaagcacacgct
gtcagttcaagaggttattcattgatgaagggttgatgttgcatactggttgtgttaatt
ttcttgtggcgatgtcattgtgcgaaattgcatatgtttacggagacacacagcagattc
catacatcaatagagtttcaggattcccgtaccccgcccattttgccaaattggaggttg
acgaggtggagacacgcagaactactctccgttgtecagccgatgtcacacattatctga
acaggagatatgagggctttgtcatgagcacttcttcggttaaaaagtctgtttcgcagg
agatggtcggcggagccgccgtgatcaatccgatctcaaaacccttgcatggcaagatcc
tgacttttacccaatcggataaagaagctctgctttcaagagggtattcagatgttcaca
ctgtgcatgaagtgcaaggcgagacatactctgatgtttcactagttaggttaaccccta
CAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCAGGAGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT
TGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGTGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCCCCGGGGACCCCCCACAACC
gcatattggatatgtctaagtctgttgctgcgcctaaggatcaaatcaaaccactaatac
ctatggtacgaacggcggcagaaatgccaegecagactggactattggaaaatttagtgg
cgatgattaaaaggaactttaacgcacccgagttgtctggcatcattgatattgaaaata
ctgcatctttggttgtagataagttttttgatagttatttgcttaaagaaaaaagaaaac
caaataaaaatgtttctttgttcagtagagagtctctcaatagatggttagaaaagcagg
aacaggtaacaattggccagctcgcagattttgattttgtggatttgccagcagttgatc
agtacagacacatgattaaagcacaacccaagcaaaagttggacacttcaatccaaacgg
agtacccggctttgcagacgattgtgtaccattcaaaaaagatcaatgcaatattcggcc
cgttgtttagcgagcttactaggcaattactggacagtgttgattcgagcagatttttgt
ttttcacaagaaagacaccagcgcagattgaggatttcttcggagatctcgacagtcatg
GGCTGGACTTGTCCGGTTGGTTCACGGCTGGCTACAGCGGGGGAGACATTTATCACAGCGTGTCTCATGCCCGGCCCCGCTGGTTCTGGTTTTGCCTACTCCTGCTCGCTGCAGGGGTAGGCATCTACCTCCTCCCCAACCGATGA
全体的なセットアップは、上に概説されるセットアップと同一である。したがって、該アッセイの目標は、臨床サンプルにおけるC型肝炎ウイルス(HCV)に由来する核酸の有無の検出であり、ここでHCVの遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bに含まれるHCV配列が検出される。
−NS5B HCV遺伝子に由来するプライマー領域(薄い灰色で強調される)であって、NS5Bフォワードプライマーにハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする);配列番号1
−HCV NS5B遺伝子に相同性を示さず、S1及びS2と異なる、TMVに由来する第2の配列(S3);配列番号8
−NS5B HCV遺伝子に由来するプライマー領域(薄い灰色で強調される)であって、NS5Bリバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる(注:リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする);配列番号3。
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
gcatctggtatcaaagaaagagcggggacgtcacgacgttcattggaaacactgtgatca
ttgctgcatgtttggcctcgatgcttccgatggagaaaataatcaaaggagccttttgtg
gtgacgatagtctgctgtactttccaaagggttgtgagtttccggatgtgcaacactccg
cgaatcttatgtggaattttgaagcaaaactgtttaaaaaacagtatggatacttttgcg
gaagatatgtaatacatcacgacagaggatgcattgtgtattacgatcccctaaagttga
tctcgaaacttggtgctaaacacatcaaggattgggaacacttggaggagttcagaaggt
ctctttgtgatgttgctgtttcgttgaacaattgtgcgtattacacacagttggacgacg
ctgtatgggaggttcataaaaccgcccctccaggttcgtttgtttataaaagtctggtga
agtatttgtctgataaagtt
CAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCAGGAGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT
ヒト対象に由来する血液等の臨床サンプル中にC型肝炎ウイルス(HCV)の核酸の有無を特定するため、以下に記載されるアッセイを行う。
NS3_fw: TGGGGGGCAGATACCGC(配列番号10)
NS3_rev: AGGAACTTGCCGTAGGTGGAGTA(配列番号11)
NS5B_fw: CCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTA(配列番号12)
NS5B_rev: TGAGACACGCTGTGATAAATGTC(配列番号13)
を含む。
Claims (15)
- サンプル中に標的配列(T)を含む核酸の存在を検出するin vitro方法であって、該方法が、
a)Tの両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b)前記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c)対照配列1(S1)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d)前記工程c)のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e)対照配列2(S2)の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f)前記工程e)のプラスミドを前記バイアルに移す工程と、
g)前記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h)プライマーFOR及びプライマーREVを使用して前記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i)前記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在を生じる場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在を生じる場合、バイアルV1におけるTの存在が前記サンプルにおけるTを含む前記核酸の存在を示す、方法。 - 前記サンプルが臨床サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記臨床サンプルが、ヒト対象に由来する組織サンプル又は体液サンプルである、請求項2に記載の方法。
- Tを含む前記核酸が微生物に由来する核酸である、請求項1に記載の方法。
- 微生物が、細菌、古細菌、原生生物、真菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- Tを含む前記核酸が癌遺伝子若しくはヒト癌遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 対照配列(S)を含むプラスミドであって、
Sの両側にフォワードプライマー(FOR)にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー(REV)にハイブリダイズする配列があり、
FOR及びREVにハイブリダイズする前記配列が、FORにハイブリダイズする前記配列、その後に続く標的配列(T)、その後に続くREVにハイブリダイズする前記配列を含む核酸に由来する配列であり、SとTとが同一ではない、プラスミド。 - FORにハイブリダイズする前記配列、その後に続くT、その後に続くREVにハイブリダイズする前記配列を含む前記核酸が、微生物由来の核酸である、請求項7に記載のプラスミド。
- 前記微生物が、細菌、古細菌、原生生物、真菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項8に記載のプラスミド。
- FORにハイブリダイズする前記配列、その後に続くT、その後に続くREVにハイブリダイズする前記配列を含む前記核酸が癌遺伝子若しくはヒト癌遺伝子である、請求項7に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドが請求項1に記載の方法の工程c)で使用され、陽性及び陰性の対照としての役割を果たす、請求項7に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドが請求項1に記載の方法の工程e)で使用され、抽出対照としての役割を果たす、請求項7に記載のプラスミド。
- サンプル反応(SR)においてサンプル中のTの存在を検出するように設計されたシークエンシングアッセイにおける請求項7に記載のプラスミドの使用であって、前記プラスミドを対照反応(CR)において使用し、CR及びSRが別々の反応である、請求項7に記載のプラスミドの使用。
- サンプル反応(SR)においてサンプル中のTの存在を検出するように設計されたシークエンシングアッセイにおける請求項7に記載のプラスミドの使用であって、前記プラスミドを、それに由来する核酸の抽出の前に前記SRに添加する、請求項7に記載のプラスミドの使用。
- サンプル中の標的配列(T)を含む核酸の検出に対するキットであって、前記キットが、
(a)FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
(b)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1(S1)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
(c)FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2(S2)、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とS2とが同一ではない、キット。
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