KR101484292B1 - 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머는 상기 바이러스에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하기 때문에, 극소량의 바이러스 또는 바이러스 핵산이 존재하여도 이를 조기에 정확한 감도로 진단할 수 있다. 본 발명은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 진단하는 방법을 제공하며, 본 발명의 진단 방법을 이용할 경우 항혈청을 이용한 기존의 진단 방법보다 1,000 배 이상 검출감도가 높아 수입 식물체의 검역 등에 매우 유용하게 이용할 수 있다.

Description

복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도{Diagnostic Primer Set or Peach rosette mosaic virus and Their Use}

본 발명은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온 진단방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.

현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. PRMV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.

PRMV는 우리나라의 검역대상 병원체로서 수입되는 여러 가지 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 PRMV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 PRMV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1,000배 정도 높은 PCR 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 되므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. PCR 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 PCR 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물체 시료로부터 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 정확하게 진단할 수 있는 검출방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 복숭아 좌엽 모자이크바이러스에 특이적으로 결합 가능한 뉴클레오타이드 서열을 발굴하였고, 이를 이용할 경우 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 높은 감도로 진단할 수 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명자들은 식물체 시료로부터 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 정확하게 진단할 수 있는 검출방법을 개발하고자 노력한 결과, 상기 복숭아 좌엽 모자이크바이러스에 특이적으로 결합 가능한 뉴클레오타이드 서열을 발굴하였고, 이를 이용할 경우 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 높은 감도로 진단할 수 있다는 것을 규명하였다.

본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단에 최적화된 프라이머로서 이를 이용하면 다양한 식물체로부터 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트에서 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트에서 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 진단하는 방법을 제공한다:

(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 분석하는 단계.

본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다;

단계 (a): 시료(sample)로부터 DNA의 준비

본 발명의 방법에 따르면, 우선 복숭아 좌엽 모자이크바이러스의 RNA를 포함하는 시료 또는 상기 바이러스에 감염되었는지 여부를 판단하고자 하는 시료를 준비한다. 본 발명의 시료는 예를 들어, 식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 추출물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 검출방법을 이용하면 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 검출할 수 있다.

본 발명의 시료로부터 RNA를 준비하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 시료로부터 복숭아 좌엽 모자이크바이러스의 RNA를 수득한 후, RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성하여 DNA를 준비한다. 본 발명을 위해 시료 0.1 g을 멸균된 막자사발에 담아 액체질소를 첨가하여 파쇄하였고, 키트를 사용하여 감염시료의 잎에서 총 RNA의 추출하였으며, 최종적으로 핵산을 포함하지 않는 물 20 μl에 녹인 후 RT-PCR과 PCR의 주형으로 사용하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 RT-PCR은 (i) 42℃에서 60분간 역전사 과정, (ii) 95℃에서 10분간 변성(denaturation) 과정, (ⅲ) 95℃에서 45초, (ⅳ) 55℃에서 60초 및 (ⅴ) 72℃에서 60초 과정을 35회 반복한 후, 마지막으로 (ⅵ) 72℃에서 5분간 반응시키는 과정을 포함한다. 역전사의 상세한 기작은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등,

Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985))에서 찾을 수 있다. 후속의 반응의 상세한 내용은 상술한 공지의 종래 프라이머-관련 핵산 증폭의 것과 유사하다.

단계 (b): 중합효소 연쇄반응(PCR)액의 수행

이어서, 상기 DNA 및 유전자 증폭반응을 위한 프라이머를 포함하는 중합효소 연쇄반응액을 제조한다. 본 명세서에서, 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 상기한 DNA 및 프라이머 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 중합효소 연쇄반응액을 이용하여 원하는 DNA 서열에 대한 증폭반응을 수행한다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법 등에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 검출방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 유전자의 존재를 조사한다.

본 발명에서 중합효소 연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(extension) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 “사이클”은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 중합효소 연쇄 반응은 (i) 95℃에서 10분간 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 95℃에서 45초, (ⅲ) 55℃에서 60초 및 (ⅳ) 72℃에서 60초 과정을 35회 반복한 후, 마지막으로 (ⅴ) 72℃에서 5분간 반응시키는 과정을 포함한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오타이드 또는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 실시된다.

단계 (c): 중합효소 연쇄반응 결과물의 분석

본 발명의 검출방법은 단계 (b)를 마친 다음, 중합효소 연쇄반응의 결과물을 분석하는 단계를 수행한다. 이 분석과정에서 중합효소 연쇄반응에 의해 원하는 크기의 DNA가 증폭된 것으로 분석되면, 시료에 복숭아 좌엽 모자이크바이러스가 있는 것으로 판정한다. 중합효소 연쇄반응의 결과물의 분석은 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 유전자의 존재를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 시료(samples)에서 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 유전자가 증폭된 경우에는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스에 감염된 것으로 진단된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법이 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 실시되는 경우, 상기 중합효소 연쇄반응 결과물을 주형으로 하여 서열목록 제2서열 및 서열목록 제5서열의 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 세트를 이용해 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 상기 중합효소 연쇄반응을 검정할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법이 서열목록 제1서열 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 세트로 이용한 중합효소 연쇄반응으로 실시되는 경우, 상기 중합효소 연쇄반응 결과물을 주형으로 하여 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 세트를 이용해 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 상기 중합효소 연쇄반응을 검정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트에서 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트는 검정용 프라이머 세트로 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제5서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 검정용 프라이머 세트는 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제5서열의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트에서 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트는 검정용 프라이머 세트로 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 검정용 프라이머 세트는 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 진단 시 양성대조구로서 서열목록 제19서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 및 양성대조구의 오염으로 인해 발생할 수 있는 거짓양성에 대비하기 위해 일부 뉴클레오타이드 서열을 변형시킨 돌연변이-양성대조구로서 서열목록 제20서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트를 제공한다.

(b) 본 발명의 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머는 상기 바이러스에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하기 때문에, 극소량의 바이러스 또는 바이러스 핵산이 존재하여도 이를 조기에 정확한 감도로 진단할 수 있다.

(c) 본 발명은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 진단하는 방법을 제공하며, 본 발명의 진단 방법을 이용할 경우 항혈청을 이용한 기존의 진단 방법보다 1,000 배 이상 검출감도가 높아 수입 식물체의 검역 등에 매우 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 복숭아 좌엽 모자이크바이러스(Peach rosette mosaic virus, PRMV) 감염 증상을 나타낸 사진이다.
도 2는 PRMV 진단을 위해 설계한 프라이머 지도이다.
도 3은 PCR을 이용한 PRMV 진단용 프라이머 1차 선발 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 PCR을 이용한 PRMV 진단용 프라이머 2차 선발 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 PCR을 이용한 PRMV 진단용 프라이머 3차 선발 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 PCR을 이용한 PRMV 진단용 프라이머 4차 선발 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 선발된 조합들의 엔드-포인트 PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 선발된 프라이머 세트의 PCR 결과와 네스티드 PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 PRMV 진단용 프라이머 세트 1(N10/C80, 679 bp)의 염기서열이다. [ ], 프라이머 결합 부위.
도 10은 PRMV 진단용 프라이머 세트 2(N10/C70, 967 bp)의 염기서열이다. [ ], 프라이머 결합 부위.
도 11은 PRMV 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조구의 산물과 최종 선발된 프라이머 세트의 PCR 결과이다.
도 12는 PRMV 양성대조구(N10/C50, 2,016 bp)의 염기서열이다. [ ], 프라이머 결합 부위.
도 13은 PRMV 돌연변이-양성대조구(N10/C70, 973 bp)의 염기서열이다. [ ], 프라이머 결합 부위; < >, 네스티드 프라이머 결합 부위; { }, 염기서열 삽입.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: PRMV 진단용 프라이머의 설계 및 조합

복숭아 좌엽 모자이크바이러스(Peach rossette mosaic virus, PRMV)는 분류학적으로 바이러스 Group IV 양성 가닥 ssRNA 바이러스로 Secoviridae과 Nepovirus속으로 분류된다. PRMV는 식물병원성 바이러스로 감염된 작물에서는 전체적으로 마름병, 노쇠 및 로제팅(rosetting) 증상이 나타난다. 감염된 과실과 꼬투리에서는 기형과 변색이 일어나며, 잎과 줄기에서는 기형과 비정상적인 성장이 일어난다. 이러한 증상으로 인해 복숭아 수확량이 60% 이상 감소한 사례가 있으며, 민감한 포도 품종에도 쉽게 감염된다.

PRMV는 토양으로 전염되는 바이러스로 이 바이러스에 감염된 식물이 자랐던 토양에 건강한 복숭아 또는 포도를 키우면 이 또한 PRMV에 감염된다. PRMV는 대부분 감염된 작물에 인접해 있는 덩굴로 천천히 퍼지는 특징이 있다. 또한 복숭아 농가나 포도밭에서 경작을 할 때, 민감한 품종은 선충을 벡터로 감염되기도 한다. PRMV의 주요 기주로는 복사나무, 자두나무, 미국종 포도 및 유럽종 포도가 있으며, 블루베리, 포도 및 민들레도 감염될 수 있다.

PRMV는 지름 28 nm로 정방형이다. 핵산은 T, M 및 B의 3개의 각진 모양을 하고 있으며, 이 중 T는 외피단백질을 코딩하고, 나머지 M과 B는 핵단백질 유전자이다. 본 발명에서는 PRMV의 RNA1 다단백질 유전자 부분을 사용하여 진단용 프라이머를 설계하였다.

PRMV의 진단용 프라이머 설계를 위하여 미국 국립생물정보센터로부터 PRMV와 분류학적으로 유사한 세코비리데(Secoviridae) 4종의 염기서열을 다운로드 하였다 (표 1).

종 특이적 염기서열 탐색을 위해 사용한 바이러스의 정보

바이러스 명	약어	GeneBank accession No. (길이, bp)
Peach rosette mosaic virus	PRMV	AF016626(7,977)
Arabis mosaic virus	ArMV	AY303786(7,334)
Raspberry ringspot virus	RpRSV	AY303787(7,935)
Tomato black ring virus	TBRV	AY157993(7,358)
Tobacco ringspot virus	TRSV	U50869(7,514)

다운로드한 5종의 염기서열은 'fasta' 포맷으로 정렬한 뒤, 서열 정렬 프로그램인 DNAMAN 패키지를 사용하여 다중 정렬하였다. 그 후 PRMV의 종 특이적인 서열을 탐색하였고, 약 8 Kb 중 ‘3,165­7,847’ 부분을 대상으로 진단용 프라이머를 설계하였다(도 2).

설계한 프라이머는 정방향 9가지와 역방향 8가지, 이렇게 총 17가지로(표 2), 이를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 21가지 조합을 선발하였고, 각각의 RT-PCR 산물의 예상 크기는(길이, bp)는 표 3과 같다.

PRMV 종 공통염기서열로부터 설계한 진단용 프라이머 정보

프라이머 이름		서열	길이(bp)	위치*
정방향	PRMV­N10	CCAAACAACTTCACAGGG	18	3,165­3,183
	PRMV­N20	TCTGTGGGATTTGGGAGT	18	3,425­3,443
	PRMV­N30	ACGCCTGATGAACGATTA	18	3,980­3,998
	PRMV­N40	TTCCGATGTTCATTCTCAG	19	4,273­4,292
	PRMV­N50	AGCCAATGAAACTTGACAC	19	4,758­4,777
	PRMV­N60	GCAACCATCAACCGTGTT	18	5,239­5,257
	PRMV­N70	AATGGGCTTGTTGTTGCC	18	5,684­5,702
	PRMV­N80	ACTTTATTGTGGCGTGCG	18	6,101­6,119
	PRMV­N90	TGCTCTTGTGTGATGAGTG	19	6,751­6,770
역방향	PRMV­C10	AACTAACCAGATGACCATAGGT	22	7,826­7,847
	PRMV­C20	CCAGCGTTGTCTCATTACTTA	21	7,119­7,139
	PRMV­C30	CTCTTCCATTCACATCTTCAAC	22	6,610­6,631
	PRMV­C40	TGTCAGTGCCATCCGTAA	18	5,592­5,609
	PRMV­C50	TCAAGCCAGTATCGGAAT	18	5,163­5,180
	PRMV­C60	GGATAACCCTCAGAAGTGTCA	21	4,771­4,791
	PRMV­C70	TACGAGGATGTCAGGTAGCG	20	4,112­4,131
	PRMV­C80	TAAACGCACACCTCCGTAT	19	3,825­3,843

^*GenBank accession number AF016626을 기준으로 작성

PRMV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 산물의 예상 크기

조합	상류(정방향)	하류(역방향)	PCT 산물 사이즈(bp)
1	PRMV­N10	PRMV­C80	679
2	PRMV­N10	PRMV­C70	967
3	PRMV­N20	PRMV­C80	419
4	PRMV­N20	PRMV­C70	707
5	PRMV­N20	PRMV­C60	1,367
6	PRMV­N30	PRMV­C70	152
7	PRMV­N30	PRMV­C60	812
8	PRMV­N30	PRMV­C50	1,201
9	PRMV­N40	PRMV­C60	519
10	PRMV­N40	PRMV­C50	908
11	PRMV­N40	PRMV­C40	1,37
12	PRMV­N50	PRMV­C50	423
13	PRMV­N50	PRMV­C40	852
14	PRMV­N60	PRMV­C40	371
15	PRMV­N60	PRMV­C30	1,393
16	PRMV­N70	PRMV­C30	948
17	PRMV­N70	PRMV­C20	1,456
18	PRMV­N80	PRMV­C30	531
19	PRMV­N80	PRMV­C20	1,039
20	PRMV­N90	PRMV­C20	389
21	PRMV­N90	PRMV­C10	1,097

실시예 2: PRMV의 최적 프라이머 세트 선발과 진단용 프라이머 은행 구축

PRMV의 최적 진단용 프라이머 세트 선발을 위해 설계한 프라이머 조합 21가지로 1­4차까지의 선발 과정을 진행하였다.

우선 1차 선발에서 21가지 조합 중 6가지 조합을 선발하였다(도 3). 2차 선발 대상인 유연관계 바이러스, 3차 선발 대상인 기주관련 바이러스의 목록 및 기주의 목록은 표 4에 정리하였다. 2차 선발에서 6가지 조합 중 5가지의 조합을 선발하였으며 (도 4), 3차 선발에서 5가지 조합 중 4가지 조합을 선발하였다(도 5). 마지막 4차 선발에서 4가지 조합 중 1개의 조합에서 기주의 유전체 DNA에 대한 비특이적인 반응이 나타나 선발대상에서 제외하였다(도 6).

1­4차 선발 결과, 밴드의 끌림이 없으며 가장 깔끔한 결과를 보인 2가지 조합 (조합 1과 2)을 선발하였다. 선발된 조합들로 엔드-포인트 PCR (희석한계 실험)을 실시한 결과, 각각 10^­3과 10^­6의 민감도를 보였다(도 7).

2차와 3차 대상바이러스 및 4차 기주 목록

구분	학명	약어
2차 선발대상 (8종)	Arabis mosaic virus	ArMV
	Cherry leaf roll virus	CLRV
	Cacao necrosis virus	CNV
	Grapevine fanleaf virus	GFLV
	Raspberry ringspot virus	RpRSV
	Tomato black ring virus	TBRV
	Tomato ringspot virus	ToRSV
	Tobacco ringspot virus	TRSV
3차 선발대상 (9종)	Alfalfa mosaic virus	AMV
	Arracacha virus B	AVB
	Broad bean wilt virus 2	BBWV2
	Cucumber green mottle mosaic virus	CGMMV
	Prune dwarf virus	PDV
	Prunus necrotic ringspot virus	PNRSV
	Strawberry latent ringspot virus	SLRSV
	Tobacco mosaic virus	TMV
	Tobacco necrosis virus	TNV
4차 선발대상 (5종)	명아주	­
	복숭아	­
	천일홍	­
	자두	­
	포도	­

선발된 조합들에 대하여 검정 시스템인 네스티드 프라이머 조합을 설계하였으며(표 5), 이 때 주형으로 사용되는 RT-PCR의 산물은 각각 1/100 희석하여 사용하였다.

네스티드 PCR 결과, 모든 조합에서 밴드가 나타났다(도 8). 네스티드 PCR 프라이머는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, 크기(length) 및 선발된 조합과 산물의 크기가 어느 정도의 차이가 나는 것을 고려하여 최종 선발하였다.

선발된 조합들에 대한 검증용 네스티드 PCR 프라이머 조합의 설계

프라이머 세트 No.	상류(정방향)	하류(역방향)	길이(bp)
조합1	PRMV­N20	PRMV­C85	285
조합2	PRMV­N20	PRMV­C80	419

실험 결과, 조합 1과 2를 PRMV 최종 진단용 프라이머 세트로 선발하였고, 검정 시스템인 네스티드 프라이머 역시 각각 한 세트씩 선발하였다. PRMV를 검사하기 위한 최종 진단용 프라이머 세트, 네스티드 프라이머 및 양성대조구의 크기를 표 6에 정리하였으며, 프라이머 정보를 표 7에 기재하였다.

최종 선발된 프라이머 세트

세트	최종 선발 프라이머 조합			네스티드 프라이머 조합			양성대조구(bp)
	상류	하류	길이(bp)	상류	하류	길이(bp)
1	PRMV­N10	PRMV­C80	679	PRMV­N20	PRMV­C85	285	2,016
2	PRMV­N10	PRMV­C70	967	PRMV­N20	PRMV­C80	419

최종 선발된 프라이머의 염기서열

프라이머		서열	염기수	길이(bp)
세트 1(조합 1)	PRMV­N10	CCAAACAACTTCACAGGG	18	679
	PRMV­C80	TAAACGCACACCTCCGTAT	19
세트 2(조합 12)	PRMV­N10	CCAAACAACTTCACAGGG	18	967
	PRMV­C70	TACGAGGATGTCAGGTAGCG	20
세트 1 네스티드	PRMV­N20	TCTGTGGGATTTGGGAGT	18	285
	PRMV­C85	ATGGGCACACAGAGCAAT	18
세트 2 네스티드	PRMV­N20	TCTGTGGGATTTGGGAGT	18	419
	PRMV­C80	TAAACGCACACCTCCGTAT	19

실시예 3: PRMV의 진단, 검사 및 양성대조구의 예

바이러스 검사현장에서 식물체로부터 PRMV를 진단할 경우, 위의 결과들을 바탕으로 PRMV 최종 진단용 프라이머 조합인 세트 1과 세트 2를 사용하여 원-스텝 또는 투-스텝 RT-PCR로 검사를 수행하면, 프라이머들이 각각의 위치에 결합하여(도 9와 10) 밴드를 형성할 것이다. 이 때, 양성대조구(positive control)로 사용할 수 있도록 진단용 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 플라스미드를 제조하여 제공하였다(도 11 및 12).

한편, 진단 시 양성대조구의 오염으로 인한 거짓양성이 나타날 경우를 대비하여 플라스미드 서열의 일부를 변형한 돌연변이­양성대조구(mutation positive control)를 제작하여 제공하였다(도 13). 돌연변이­양성대조구를 사용할 때에는 PRMV 최종 진단용 프라이머 세트 2를 사용하여야 하며, 네스티드 검정 역시 세트 2의 네스티드 프라이머를 사용해야 한다. 제작한 돌연변이­양성대조구를 양성대조구로 사용한다면, 검사 후에 양성반응이 나타난 시료의 염기서열 분석 할 때, 그것이 진짜 바이러스에 감염되어 있는 시료인지 우리의 양성대조구로부터 오염이 된 것인지를 판단 할 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> Diagnostic primer set or Peach rosette mosaic virus and their use <130> PN130403 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N10 <400> 1 ccaaacaact tcacaggg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N20 <400> 2 tctgtgggat ttgggagt 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C80 <400> 3 taaacgcaca cctccgtat 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C70 <400> 4 tacgaggatg tcaggtagcg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C85 <400> 5 atgggcacac agagcaat 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N30 <400> 6 acgcctgatg aacgatta 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N40 <400> 7 ttccgatgtt cattctcag 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N50 <400> 8 agccaatgaa acttgacac 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N60 <400> 9 gcaaccatca accgtgtt 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N70 <400> 10 aatgggcttg ttgttgcc 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N80 <400> 11 actttattgt ggcgtgcg 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PRMV-N90 <400> 12 tgctcttgtg tgatgagtg 19 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C10 <400> 13 aactaaccag atgaccatag gt 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C20 <400> 14 ccagcgttgt ctcattactt a 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C30 <400> 15 ctcttccatt cacatcttca ac 22 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C40 <400> 16 tgtcagtgcc atccgtaa 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C50 <400> 17 tcaagccagt atcggaat 18 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PRMV-C60 <400> 18 ggataaccct cagaagtgtc a 21 <210> 19 <211> 2016 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive Control <400> 19 ccaaacaact tcacagggac ttgtggagtg agttaaagct tgcgaacgat ttttttccgc 60 gtttctcaaa agctcttaac caactgcgcg accaaccaca ttttaaggtt gatgtgcagt 120 cagtttcctt cagcatatgg ctgattttag agatgccatt gttgataata ggcaaaaatt 180 cttctttttt tcagagctat cttttggtgg gggcttgcat catggagttt tttgtccttg 240 ataaaacctt ccttagtgga tctgtgggat ttgggagtgc tttggctctc aaaaaccaat 300 tggatgtaca tagctctgtt gcttcttctg ggtctattgc aactcagtca tatgcacgga 360 gcataccaat tgtatgggca aaagtagctc gctatgccaa tgtccattca caggttgagg 420 agtcgagtca tttcaatttt tttgaagatg gcctggcgca ccttttagtt agattggtgg 480 gtactagtgg tctttgtgag actgctattt tgtttggttc cagagctatt gctctgtgtg 540 cccatcagat acgcatgttc ccagatcacg accgggttac tgtgcattat ttggacaaag 600 cccggattgc aaagtgcttt cctatgacat ggcattgggt aaatgctatt gaggaaaaag 660 atacggaggt gtgcgtttat agggacgacc aattaacgcc tctccctgtc tatccagatt 720 ccatttatct taagggtgag acacaattac cgtctgcagt taatataaat cgagtttcca 780 taaagaagcg aagatattat gaggacgctt ctttgacgcc tgatgaacga ttactggatg 840 gtgaaagtcc aattatacgt tcgtggagta acgtcgctgc cttgagtact agtgtgcaaa 900 caatttcaaa ccctgcacct ggtattgcat acaagcgtga tttaaatcgc tacctgacat 960 cctcgtatgc tgcgggggtg catgattgtg gtggtttaat atccattttg caccaaggac 1020 gacgcaaggt tgtggggttg cacgtagcag gaactagagt tggacatctt ttttcgtcca 1080 ctattagttt cttgccacac ggcaattttt ccgatgttca ttctcaggga gattttttta 1140 tacctgaggt aggtgatcga gaggctggtt atgagaaaat aggatttatt gataattcag 1200 ccaaagccca catactagta ccactaccca attgggcagg gtacctacta attttgaaac 1260 cccttcaact tttgatgagg aggaggaaag aaaatttcgt cgatgctggt gaaacatttg 1320 aaataaaaga gccagcaatt ctttcaaaaa aagatcctcg tcttgaggat cctgattctt 1380 ttgacccatt gcggactggg atgagcaaat ttgcaaatcc tatgtctgta cttgatgaag 1440 ctttgttgga agcagtttgt gaggacattt ttaccacttg gtatgatgcc ctcccagctg 1500 ttactgacaa ccaggggaat gtttctcgta ttttattaga gaaaacttct ttagatatag 1560 cattgaatgg agttccagga gatgcttatc ttgagccaat gaaacttgac acttctgagg 1620 gttatcccca ttgtgtcagg cgaggtcctg gtgagagtgg aaagcgtcga tttgttgaga 1680 tcgatgatga tttccatttt tctttgaagc ctgataccga tgtttttaaa aactatcagg 1740 cgctttctgg gactatttct caacaagtcc cagtcctcaa ttgcgtagag tgcttgaaag 1800 atgaatgtct caagaaaagg aaagtggcta ccccacgcct ttttgatgtg atgccttttg 1860 agcacaatat tctcttgcgg gaatattttt tgaatttttc cgcttttatt caggctaacc 1920 ggatttatct ttccgcttgt gttggaacca atccttattc tcgagagtgg actacactct 1980 atgatagatt agcagagtat tccgatactg gcttga 2016 <210> 20 <211> 973 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutation Positive Control <400> 20 ccaaacaact tcacagggac ttgtggagtg agttaaagct tgcgaacgat ttttttccgc 60 gtttctcaaa agctcttaac caactgcgcg accaaccaca ttttaaggtt gatgtgcagt 120 cagtttcctt cagcatatgg ctgattttag agatgccatt gttgataata ggcaaaaatt 180 cttctttttt tcagagctat cttttggtgg gggcttgcat catggagttt tttgtccttg 240 ataaaacctt ccttagtgga tctgtgggat ttgggagtgc tttggctctc aaaaaccaat 300 tggatgtaca tagctctgtt gcttcttctg ggtctattgc aactcagtca tatgcacgga 360 gcataccaat tgtatgggca aaagtagctc ggtcgaccta tgccaatgtc cattcacagg 420 ttgaggagtc gagtcatttc aatttttttg aagatggcct ggcgcacctt ttagttagat 480 tggtgggtac tagtggtctt tgtgagactg ctattttgtt tggttccaga gctattgctc 540 tgtgtgccca tcagatacgc atgttcccag atcacgaccg ggttactgtg cattatttgg 600 acaaagcccg gattgcaaag tgctttccta tgacatggca ttgggtaaat gctattgagg 660 aaaaagatac ggaggtgtgc gtttataggg acgaccaatt aacgcctctc cctgtctatc 720 cagattccat ttatcttaag ggtgagacac aattaccgtc tgcagttaat ataaatcgag 780 tttccataaa gaagcgaaga tattatgagg acgcttcttt gacgcctgat gaacgattac 840 tggatggtga aagtccaatt atacgttcgt ggagtaacgt cgctgccttg agtactagtg 900 tgcaaacaat ttcaaaccct gcacctggta ttgcatacaa gcgtgattta aatcgctacc 960 tgacatcctc gta 973

Claims (12)

1. 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
   
3. 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 프라이머 세트.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
   
5. 다음의 단계를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스를 진단하는 방법:
   (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
   (b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 분석하는 단계.
   
6. 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제5서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   
9. 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 복숭아 좌엽 모자이크바이러스 진단용 키트.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 키트는 양성대조군으로서 서열목록 제19서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 및 돌연변이-양성대조군으로서 서열목록 제20서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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