KR20230089246A - 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 복숭아 줄기 병해 검출 키트 및 방법 - Google Patents
복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 복숭아 줄기 병해 검출 키트 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 복숭아 줄기 병해를 일으키는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)을 동시 검출할 수 있는 프라이머 세트, 및 이를 이용한 검출 키트 및 방법에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트는 감염이 의심되는 복숭아나무 또는 토양을 대상으로 복숭아 줄기 병해를 주로 일으키는 3종의 곰팡이성 병원균을 특이적으로 동시에 검출함으로써 병원균에 감염된 복숭아 또는 복숭아나무를 선별하여 효율적으로 건전묘를 유통 및 공급할 수 있으며, 건전묘 재배를 통해 복숭아의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 복숭아 줄기 병해를 일으키는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)을 동시 검출할 수 있는 프라이머 세트, 및 이를 이용한 검출 키트 및 방법에 관한 것이다.
복숭아는 국내 주요 여름과일로 재배 및 유통되는데, 품질 좋은 복숭아를 수확하기 위해서는 병원체 감염이나 양분 또는 수분 부족, 냉해 등의 피해로부터 복숭아나무를 보호하고 관리해야 한다.
복숭아나무에서 주로 발생하는 병해에는 줄기썩음병, 줄기마름병, 잿빛무늬병, 가지마름병, 탄저병 등이 있으며, 최근 기후변화로 인해 강수량이 급격하게 증가하고 고온 다습한 조건이 지속되면서 줄기썩음병, 줄기마름병, 잿빛무늬병 등 곰팡이성 병원균의 감염 피해가 날로 증가하고 있다. 이러한 병원균은 비가 올 때 토양이나 감염된 줄기에서 포자가 누출되어 빗물이 튀는 과정에서 주변 작물에 감염을 일으키며, 종자 전염이 가능하고 주로 생육후기에 증상이 발현되기 때문에 복숭아 수확에 큰 피해를 끼친다. 따라서 복숭아의 생산성 증가 및 품질 관리를 위해서는 감염토양, 감염종자 또는 감염묘를 확인하고 건전묘를 생산 및 보급하는 것이 중요하다.
그러나 현재까지 개발된 복숭아 병해를 진단 또는 검출하는 방법으로는 황반 클로스테로바이러스, 좌엽 모자이크바이러스 등 바이러스 감염에 대한 검출 기술이 개발되었을 뿐, 곰팡이성 병원균에 대한 검출 기술이 개발되지 않아 많은 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 복숭아 줄기 병해의 병원균 3종을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 키트를 이용한 복숭아 줄기 병해 동시 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "복숭아 줄기 병해"는 복숭아나무의 줄기에 병이 발생한 식물병을 의미한다. 본 발명에서는 복숭아나무 줄기의 곰팡이 감염으로 인한 줄기썩음병, 줄기마름병, 잿빛무늬병 등일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화(hybridization)되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 프라이머는 적절한 완충액(buffer) 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (예컨대, DNA 중합효소) 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머 세트(primer set)의 경우, 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성되며, 양 프라이머의 5' 말단은 각 DNA 가닥의 3' 말단에 결합하여 DNA를 합성한다.
본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트는 복숭아 줄기 병해의 병원균 검출 효율을 높이기 위해 당업계에 공지된 방법을 통해 제한 없이 변형될 수 있으며, 필요에 따라 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea) 검출용인 것으로, 정방향 프라이머인 서열번호 1의 염기서열과 역방향 프라이머인 서열번호 2의 염기서열로 구성되어 감염 의심 복숭아, 복숭아나무 또는 토양으로부터 특이적으로 Botryosphaeria dothidea의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 검출용인 것으로, 정방향 프라이머인 서열번호 3의 염기서열과 역방향 프라이머인 서열번호 4의 염기서열로 구성되어 감염 의심 복숭아, 복숭아나무 또는 토양으로부터 특이적으로 Cytospora leucostoma의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola) 검출용인 것으로, 정방향 프라이머인 서열번호 5의 염기서열과 역방향 프라이머인 서열번호 6의 염기서열로 구성되어 감염 의심 복숭아, 복숭아나무 또는 토양으로부터 특이적으로 Monilinia fructicola의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR 또는 다중 PCR에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "PCR(polymerase chain reaction)"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 일반적으로는 고온에서 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥으로 분리하는 변성 단계 (denaturation); 변성 단계보다 낮은 온도에서 단일 가닥의 DNA와 이에 상보적인 서열을 가지는 프라이머를 결합하여 DNA-프라이머 결합체를 형성하는 결합 단계 (annealing); 중합효소에 의한 상보성 DNA를 합성하는 연장 단계 (extension)를 반복적으로 수행하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭시킨다.
본 발명에서 사용된 "다중 PCR(multiplex PCR)"은 2종 이상의 프라이머 세트 사용하여 1회의 PCR 수행을 통해 2개 이상의 유전산물 발현을 동시에 확인하는 방법으로, 대량 시료를 신속하고 간편하게 처리할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트는 감염 의심 복숭아, 복숭아나무 또는 토양으로부터 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)을 동시에 검출할 수 있어, 신속하고 정확하게 복숭아 줄기 병해의 감염 여부를 판별하는데 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 복숭아 줄기 병해는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 시약은 당업계에 공지된 통상적인 PCR용 시약을 포함할 수 있으며, 일례로 뉴클레오시드 트리포스페이트, (디옥시)리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 뉴클레오시드 트리포스페이트는 퓨린(purine)계 또는 피리미딘(pyrimidine)계 뉴클리오시드가 리보스(ribose) 또는 디옥시리보스(deoxyribose)에 결합하여 세 개의 인산기와 결합된 분자를 의미하며, (디옥시)아데노신 트리포스페이트((deoxy)adenosine triphosphate, ATP 또는 dATP), (디옥시)구아노신 트리포스페이트((deoxy)guanosine triphosphate, GTP 또는 dGTP), (디옥시)사이티딘 트리포스페이트((deoxy)cytidine triphosphate, CTP 또는 dCTP) 및 (디옥시)티아미딘 트리포스페이트((deoxy)thymidine triphosphate, TTP 또는 dTTP)를 포함한다.
상기 반응 완충액은 Taq 중합효소 완충액, PCR 완충액 등일 수 있으며, 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분들의 안정성, 활성 및/또는 지속성(longevity)을 변화시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. 이러한 반응 완충액은 효율적인 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가물질들을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR 또는 다중 PCR용 키트인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키지(package) 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산을 주형으로 하여 상기 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트 또는 키트를 사용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 시료는 병원균 감염이 의심되는 복숭아, 복숭아나무 및 토양으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 핵산은 복숭아 줄기 병해를 유발하는 병원균의 유전물질인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 시료는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및/또는 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)의 감염이 의심되는 복숭아나무로부터 채취된 줄기, 가지, 잎, 과실, 종자 등의 부위이거나, 또는 토양인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 표적 서열을 증폭하는 단계는 PCR 또는 다중 PCR에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭 단계는 시료로부터 추출된 핵산과 프라이머 세트를 모두 변성 및 활성화하기 위해 98℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 결합과 연장을 35회 반복 수행하고, 72℃에서 5분간 연장하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 감염이 의심되는 복숭아, 복숭아나무 또는 토양을 대상으로 복숭아 줄기 병해를 주로 일으키는 3종의 곰팡이성 병원균을 특이적으로 동시에 검출함으로써 병원균에 감염된 복숭아 또는 복숭아나무를 선별하여 효율적으로 건전묘를 유통 및 공급할 수 있으며, 건전묘 재배를 통해 복숭아의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 특이성 검정 결과를 나타낸 것이다. Lane M: DNA ladder, BD: Botryosphaeria dothidea, CL: Cytospora leucostoma, MF: Monilinia fructicola, Pho: Phomopsis sp., Phy: Phytophthora cactorum.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검출한계 검정 결과를 나타낸 것이다. Lane 1: DNA ladder, 2: 1 ng/μl, 3: 0.1 ng/μl, 4: 0.01 ng/μl, 5: 0.001 ng/μl, 6: 0.0001 ng/μl.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검정 결과를 나타낸 것이다. Land M: DNA ladder, B: Botryosphaeria dothidea, C: Cytospora leucostoma, Mo: Monilinia fructicola, B+C+Mo: Botryosphaeria dothidea, Cytospora leucostoma 및 Monilinia fructicola 혼합.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검출한계 검정 결과를 나타낸 것이다. Lane 1: DNA ladder, 2: 1 ng/μl, 3: 0.1 ng/μl, 4: 0.01 ng/μl, 5: 0.001 ng/μl, 6: 0.0001 ng/μl.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검정 결과를 나타낸 것이다. Land M: DNA ladder, B: Botryosphaeria dothidea, C: Cytospora leucostoma, Mo: Monilinia fructicola, B+C+Mo: Botryosphaeria dothidea, Cytospora leucostoma 및 Monilinia fructicola 혼합.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 세트의 제작
복숭아 줄기 병해를 유발하는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)을 검출하기 위하여 미국 NCBI의 데이터베이스에서 blast N 정보를 이용하여 각 병원균별 특이적인 유전자의 염기서열을 확보한 후 동시 진단을 위해 증폭산물의 크기가 서로 다르도록 프라이머 세트를 제작하였다.
각 프라이머 세트에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 명칭 (서열번호) |
프라이머 서열 (5'-3') | PCR 산물 크기 (bp) |
|
| 줄기썩음병균 | Botry-2F (서열번호 1) |
GGATGACTCAGATTCAGATT | 300 |
| Botry-2R (서열번호 2) |
CTACGAGTTATCTTGGACTG | ||
| 줄기마름병균 | Cyto-7F (서열번호 3) |
AATATCTTCAAGAGTGGTCC | 150 |
| Cyto-7R (서열번호 4) |
TTCTAGTATATCGACCTGGA | ||
| 잿빛무늬병균 | Mon-12F (서열번호 5) |
CACCTTACACATGCAGAT | 100 |
| Mon-12R (서열번호 6) |
ATACCTACCGTGCCATATA |
실험예 1. 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 특이성 검정
복숭아 줄기 병해 3종에 대한 동시 검출용 PCR법 특이성을 검정하기 위하여 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola) 외에 곰팡이성 병원균 Phomopsis sp. 및 Phytophthora cactorum의 DNA를 추출한 후 각 균에 대해 실시예 1의 프라이머 세트를 사용하여 하기 표 2의 PCR 반응물 조성으로 PCR을 실시하였다.
| 내용물 | 용량 (㎕) |
| 10X reaction buffer buffer | 2.5 |
| 10mM dNTP mixture | 0.5 |
| Botry-2F (10 pmole) | 1.0 |
| Botry-2R (10 pmole) | 1.0 |
| Cyto-7F (10 pmole) | 1.0 |
| Cyto-7R (10 pmole) | 1.0 |
| Mon-12F (10 pmole) | 1.0 |
| Mon-12R (10 pmole) | 1.0 |
| Taq polymerase (1 unit/㎕) | 0.5 |
| template DNA | 1 |
| 멸균증류수 | 14.5 |
| 최종 용량 | 25 ㎕ |
사용된 병원균들은 병든 복숭아나무에서 분리 배양하여 광학현미경을 이용한 검경 및 유전자 염기서열 분석을 통해 종(species)을 동정하였다. 수집 균주로 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma), 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola), Phomopsis sp. 및 Phytophthora cactorum를 이용하였으며, DNA 추출 키트 (DNA extraction kit, BIOFACT)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 총 DNA를 추출하였다.
PCR 수행 조건은 95℃에서 5분간 초기 변성한 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30분씩 35회 반복하고, 72℃에서 5분간 연장하여 반응시켜 수행하였다.
증폭 산물은 0.5 X TBE 완충액 50 ml 및 아가로스 0.75 g이 첨가된 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동을 하여 밴드 형성 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1을 참고하면, 실시예 1의 프라이머 세트는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)에서만 특이적으로 DNA 단편을 증폭하는 것으로 나타났다.
실험예 2. 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검출한계 검정
복숭아 줄기 병해 3종에 대한 동시 검출용 PCR법 검출한계를 검정하기 위하여 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)의 다양한 농도의 DNA (0.0001 ~ 1 ng/μl)를 이용하여 실험예 1과 동일한 조건으로 PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 복숭아 줄기 병해 3종은 0.01 ng/μl까지 동시 검출이 가능한 것으로 나타났다.
실험예 3. 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법 검정
복숭아 줄기 병해 3종을 개별적으로, 또는 이들을 모두 포함한 상태에서 복숭아 줄기 병해 3종에 대한 동시 검출용 PCR법을 검정하였다. 검정 방법은 실험예 1과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 프라이머 세트를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 PCR법은 복숭아 줄기 병해의 주요 병원균인 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)이 모두 포함된 상태에서도 각 병원균에 특이적으로 반응하여 검출 가능한 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Botry-2F
<400> 1
ggatgactca gattcagatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Botry-2R
<400> 2
ctacgagtta tcttggactg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyto-7F
<400> 3
aatatcttca agagtggtcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyto-7R
<400> 4
ttctagtata tcgacctgga 20
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<220>
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<400> 5
caccttacac atgcagat 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mon-12R
<400> 6
atacctaccg tgccatata 19
Claims (9)
- 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 프라이머 세트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea) 검출용인 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 검출용인 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola) 검출용인 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 프라이머 세트는 PCR 또는 다중 PCR(multiplex PCR)에 사용하기 위한 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 프라이머 세트; 및
증폭 반응을 수행하기 위한 시약
을 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출용 키트. - 청구항 6에 있어서,
상기 복숭아 줄기 병해는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트. - a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 핵산을 주형으로 하여 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 프라이머 세트 또는 청구항 6 또는 7의 키트를 사용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계
를 포함하는 복숭아 줄기 병해 동시 검출 방법. - 청구항 8에 있어서,
상기 복숭아 줄기 병해는 줄기썩음병균(Botryosphaeria dothidea), 줄기마름병균(Cytospora leucostoma) 및 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
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