KR20230085607A - 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 박과작물 황화바이러스 검출용 조성물, 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박과작물 병해를 일으키는 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellows virus) 및 박과퇴록황화바이러스(cucurbit chlorotic yellows virus)를 동시 검출할 수 있는 프라이머 세트, 및 이를 이용한 검출용 조성물, 키트 및 방법에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트는 감염이 의심되는 박과작물 또는 매개충을 대상으로 박과작물의 잎 황화증상을 일으키는 2종의 황화바이러스를 특이적으로 동시에 검출함으로써 바이러스에 감염된 박과작물을 선별하여 효율적으로 건전묘를 유통 및 공급할 수 있으며, 건전묘 재배를 통해 박과작물의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 박과작물 병해를 일으키는 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellows virus) 및 박과퇴록황화바이러스(cucurbit chlorotic yellows virus)를 동시 검출할 수 있는 프라이머 세트, 및 이를 이용한 검출용 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.
식물병은 영양 공급 부족 또는 불균형이나 세균, 바이러스 등의 감염에 의해 발생하며, 작물의 수량 및 품질을 급격히 감소시키므로 생산량 저하 등 경제적으로 큰 손실을 가져온다. 특히 감염에 의한 식물병은 조기 발견이 어려우며, 토양, 공기, 빗물 등에 의해 주변 식물에까지 그 영향을 미치기 때문에 감염 여부를 조기 진단하고 방제하는 기술에 대해 많은 연구가 필요하다.
한편, 국내에서는 주요 경제작물 중 하나로 오이, 참외, 멜론, 수박 등의 박과작물이 재배 및 유통된다. 박과작물의 주요 바이러스 병으로는 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), WMV2(watermelon mosaic virus2), ZYMV(zucchini yellow mosaic virus) 등이 있는데, 이들에 대해서는 감염 진단을 위한 검출 기술이 개발된 바 있다. 하지만 이러한 바이러스 외에도, 최근에 박과작물에서 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellows virus), 박과퇴록황화바이러스(cucurbit chlorotic yellows virus) 등의 감염이 보고되고 있어, 박과작물의 바이러스 감염을 검출하는 기술에 대하여 여전히 많은 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 박과작물에 감염 피해를 일으키는 2종의 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 박과작물 바이러스 동시 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 박과작물 바이러스 동시 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 조성물 또는 키트를 이용한 박과작물 바이러스 동시 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "박과작물 황화바이러스"는 오이, 참외, 멜론, 수박 등의 박과작물 잎에 황화증상을 일으키는 식물 바이러스를 의미하며, 이러한 바이러스는 매개충에 의해 전염되어 박과작물의의 생육 및 생산성 저하를 유발한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화(hybridization)되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 프라이머는 적절한 완충액(buffer) 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (예컨대, DNA 중합효소) 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머 세트(primer set)의 경우, 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성되며, 양 프라이머의 5' 말단은 각 DNA 가닥의 3' 말단에 결합하여 DNA를 합성한다.
본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트는 박과작물 황화바이러스의 검출 효율을 높이기 위해 당업계에 공지된 방법을 통해 제한 없이 변형될 수 있으며, 필요에 따라 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 외피단백질(coat protein) 영역을 인식하는 박과진딧물매개황화바이러스 검출용인 것으로, 정방향 프라이머인 서열번호 1의 염기서열과 역방향 프라이머인 서열번호 2의 염기서열로 구성되어 감염 의심 박과작물 또는 진딧물로부터 특이적으로 박과진딧물매개황화바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase) 영역을 인식하는 박과퇴록황화바이러스 검출용인 것으로, 정방향 프라이머인 서열번호 4의 염기서열과 역방향 프라이머인 서열번호 5의 염기서열로 구성되어 감염 의심 박과작물 또는 담배가루이로부터 특이적으로 박과퇴록황화바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 실시간 RT-PCR 또는 이중 실시간 RT-PCR에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "PCR(polymerase chain reaction)"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 일반적으로는 고온에서 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥으로 분리하는 변성 단계 (denaturation); 변성 단계보다 낮은 온도에서 단일 가닥의 DNA와 이에 상보적인 서열을 가지는 프라이머를 결합하여 DNA-프라이머 결합체를 형성하는 결합 단계 (annealing); 중합효소에 의한 상보성 DNA를 합성하는 연장 단계 (extension)를 반복적으로 수행하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭시킨다.
본 발명에서 사용된 "실시간 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)"은 식물 재료 또는 시료에서 추출한 RNA를 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 합성한 후 기존 중합효소연쇄반응을 통해 실시간으로 표적 핵산 또는 서열의 증폭 여부를 확인하면서 증폭된 양의 측정을 동시에 하는 방법을 의미한다.
여기서 이중(duplex)이란, 2종의 프라이머 세트를 사용하여 1회의 PCR 수행을 통해 2개의 유전산물 발현을 동시에 확인하는 것으로, 대량 시료를 신속하고 간편하게 처리할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트는 감염 의심 박과작물 또는 매개충으로부터 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스를 동시에 검출할 수 있어, 신속하고 정확하게 박과작물 황화바이러스의 감염 여부를 판별하는데 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로는, 상기 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 조성물은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.
상기 프라이머 세트는 전술한 바와 설명이 동일하므로, 중복 기재를 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 박과작물 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
상기 시약은 당업계에 공지된 통상적인 PCR용 시약을 포함할 수 있으며, 일례로 뉴클레오시드 트리포스페이트, (디옥시)리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 뉴클레오시드 트리포스페이트는 퓨린(purine)계 또는 피리미딘(pyrimidine)계 뉴클리오시드가 리보스(ribose) 또는 디옥시리보스(deoxyribose)에 결합하여 세 개의 인산기와 결합된 분자를 의미하며, (디옥시)아데노신 트리포스페이트((deoxy)adenosine triphosphate, ATP 또는 dATP), (디옥시)구아노신 트리포스페이트((deoxy)guanosine triphosphate, GTP 또는 dGTP), (디옥시)사이티딘 트리포스페이트((deoxy)cytidine triphosphate, CTP 또는 dCTP) 및 (디옥시)티아미딘 트리포스페이트((deoxy)thymidine triphosphate, TTP 또는 dTTP)를 포함한다.
상기 반응 완충액은 Taq 중합효소 완충액, PCR 완충액 등일 수 있으며, 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분들의 안정성, 활성 및/또는 지속성(longevity)을 변화시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. 이러한 반응 완충액은 효율적인 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가물질들을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 형광염료 또는 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "형광염료(dye)"는 DNA 이중 가닥에 끼어들어가 형광을 발하는 물질을 의미하는데, PCR 증폭 과정 중에 생성되는 이중 가닥의 DNA에 결합하기 때문에 증폭된 DNA의 양에 비례하여 발광하므로 정량화할 수 있다. 상기 형광염료로는 주로 사이버 그린(SYBR green)을 사용한다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링 될 수 있다. 상기 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 서열에 완전하게 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 5'말단과 3'말단에 각각 형광단(fluorophore)과 소광물질(quencher)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 형광단은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3), Cy5(Cyanine-5) 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 소광물질은 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black) 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 3 및 6의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브는 5'말단과 3'말단에 각각 FAM 및 SFCQ1를 포함하며, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의한 증폭 산물에 결합하게 된다.
상기 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브는 5'말단과 3'말단에 각각 SFC-V 및 SFCQ1를 포함하며, 상기 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의한 증폭 산물에 결합하게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 실시간 RT-PCR용 또는 이중 실시간 RT-PCR용 조성물인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 조성물을 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 박과작물 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
상기 시약은 전술한 바와 설명이 동일하므로, 중복 기재를 피하기 위해 생략한다.
본 발명에 따른 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키지(package) 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산을 주형으로 하여 상기 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트, 조성물 또는 키트로 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 시료는 황화바이러스 감염이 의심되는 박과작물 또는 매개충인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 핵산은 박과작물의 잎 황화증상을 유발하는 바이러스의 유전물질인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 시료는 박과진딧물매개황화바이러스 및/또는 박과퇴록황화바이러스의 감염이 의심되는 박과작물로부터 채취된 줄기, 가지, 잎, 과실, 종자 등의 부위이거나, 또는 매개충인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 표적 서열을 증폭하는 단계는 실시간 RT-PCR 또는 이중 실시간 RT-PCR에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭 단계는 시료로부터 추출된 RNA를 cDNA로 합성한 후 DNA 및 프라이머 세트를 모두 변성 및 활성화하기 위해 45℃에서 15분간 초기 변성한 후 95℃에서 2분간 역전사하고, 95℃에서 15초 및 58℃에서 60초를 40회 반복 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 감염이 의심되는 박과작물 또는 매개충을 대상으로 박과작물의 잎 황화증상을 일으키는 2종의 황화바이러스를 특이적으로 동시에 검출함으로써 바이러스에 감염된 박과작물을 선별하여 효율적으로 건전묘를 유통 및 공급할 수 있으며, 건전묘 재배를 통해 박과작물의 생산성 및 품질을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR을 수행하여 멜론 잎으로부터 박과진딧물매개황화바이러스(CABYV) 및 박과퇴록황화바이러스(CCYV)의 검출 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR에 대한 검출 한계를 검정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR과 비교하기 위한 종래 RT-PCR을 수행하여 황화바이러스 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR을 이용한 박과작물 중 멜론, 오이 및 참외 시료를 검정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR에 대한 검출 한계를 검정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR과 비교하기 위한 종래 RT-PCR을 수행하여 황화바이러스 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박과작물의 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR을 이용한 박과작물 중 멜론, 오이 및 참외 시료를 검정한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 세트의 제작
박과작물에 감염된 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellows virus, CABYV) 및 박과퇴록황화바이러스(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)를 검출하기 위하여, 미국 NCBI 데이터베이스에 보고된 각 바이러스의 유전자 서열을 이용하여 CABYV 외피단백질 (MG257900, MG257902 및 MG257903) 영역 및 CCYV RNA 의존성 RNA 중합효소 (LC592226, LC592895 및 MW033300) 영역의 보존된 서열을 기반으로 이중(duplex) 실시간 RT-PCR용 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였다.
각 프라이머 세트 및 프로브에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머/프로브 명칭 | 서열 (5'-3') | 증폭 산물 크기 (bp) | |
| CABYV | CABYV-F (서열번호 1) |
TAATCGAGGAGGCAGAGCTAGAG | 70 |
| CABYV-R (서열번호 2) |
CGTGAGATTGTCCTTTGAAAATACG | ||
| CABYV-probe (서열번호 3) |
FAM-CCAGGCGAAACAT-MGB/SFCQ1 | ||
| CCYV | CCYV-F (서열번호 4) |
ACGGTGGGAGAGTTAGAGTGACA | 71 |
| CCYV-R (서열번호 5) |
TCGTCTGATTGGTGTGGATAACTT | ||
| CCYV-probe (서열번호 6) |
SFC-V-CGCAGAGGATGTTCGA-MGB/SFCQ1 |
실험예 1. 황화바이러스 동시 검출을 위한 실시간 RT-PCR 수행
CABYV 및 CCYV가 모두 감염된 것으로 확인된 멜론 감염주의 잎을 시료로 사용하여 황화바이러스 감염 여부를 확인하였다. 대조군으로는 바이러스에 감염되지 않은 멜론 건전주의 잎을 사용하였다.
각 멜론 잎 시료 0.1 g을 액체 질소로 동결한 후 마쇄하였다. RNA 추출 키트 (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 마쇄한 시료로부터 총 RNA를 추출하였다.
감염주 및 건전주 시료의 총 RNA는 원액 또는 DEPC수로 희석된 희석액 (10 ~ 100 ng/μl)으로, 증폭을 위해 PCR을 수행하였다. PCR은 cDNA 합성과 PCR 증폭이 one-step으로 진행될 수 있는 GoTaq Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega)을 사용하여 하기 표 2와 같은 PCR 조성으로 45℃에서 15분간 초기 변성한 후 95℃에서 2분간 역전사하고, 95℃에서 15초 및 58℃에서 60초를 40회 반복 수행하고, CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하였다.
| 반응 조성물 | 부피 |
| 주형(Template) RNA | 1 μl (10 pg ~ 1 μg) |
| 정방향 프라이머 (F) | 1 μl (10 pmol) |
| 역방향 프라이머 (R) | 1 μl (10 pmol) |
| 프로브 | 1 μl (10 pmol) |
| 1XGoTaq Probe qPCR master mix | 10 μl |
| 1XGoScript RT Mix | 0.4 μl |
| DEPC water | 전체 부피를 20 μl에 맞춤 |
그 결과, 도 1 및 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 프로브에서 방출하는 형광을 감지하여 바이러스 감염 유무를 판단하는데, 양성 결과는 각 프로브 유래의 형광 곡선 Cq(Ct, threshold cycles) 값을 35 이내로 설정하였다. CABYV 및 CCYV에 모두 감염된 시료 (양성 멜론 1 및 2)에서는 CABYV의 Cq값이 16.92 및 17.80이고, CCYV의 Cq값이 27.75 및 28.45로 양성 반응을 나타냈고, CABYV 및 CCYV에 모두 감염되지 않은 시료 (음성 멜론 및 DEPC수)에서는 CABYV 및 CCYV 모두 Cq값이 N/A(Not Applicable, 해당사항 없음)로 증폭 곡선이 나타나지 않았다.
따라서 실시예 1의 프라이머 세트 및 프로브는 CABYV 및 CCYV에 대해 동시 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
| 시료 | Cq | ||
| FAM | SFC-V | ||
| 1 | CABYV, CCYV 양성 멜론 1 | 16.92 | 27.75 |
| 2 | CABYV, CCYV 양성 멜론 2 | 17.80 | 28.45 |
| 3 | CABYV, CCYV 음성 멜론 | N/A | N/A |
| 4 | DEPC수 | N/A | N/A |
실험예 2. 황화바이러스 동시 검출을 위한 실시간 RT-PCR 검출 한계
CABYV 및 CCYV 모두 감염된 멜론 감염주를 이용하여 실시간 RT-PCR의 프라이머 및 프로브의 검출 한계를 조사하였다.
주형으로는 감염주의 잎에서 추출된 총 RNA (100 ng/μl)를 DEPC수로 10배씩 희석하여 사용한 것으로 제외하고는, 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 2 및 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, Cq 35를 기준으로 CABYV 및 CCYV 모두 10-5 (1pg)까지 검출되었다.
| 시료 (RNA 희석배수) |
Cq | |
| FAM | SFC-V | |
| 1 | 17.11 | 21.08 |
| 10-1 | 20.19 | 24.19 |
| 10-2 | 23.50 | 27.57 |
| 10-3 | 27.94 | 31.31 |
| 10-4 | 30.97 | 34.15 |
| 10-5 | 34.30 | 34.86 |
| 10-6 | 36.57 | 37.26 |
| 10-7 | 36.42 | 36.43 |
| 10-8 | 36.87 | 37.10 |
| 10-9 | 36.27 | 36.87 |
| 10-10 | 36.72 | 36.32 |
| 10-11 | 37.48 | 35.91 |
한편, 실시간 RT-PCR을 종래 황화바이러스 검출을 위한 일반 RT-PCR과 비교하기 위하여, 실시예 1의 프라이머를 사용하여 일반 RT-PCR을 수행하였다.
일반 RT-PCR은 cDNA 합성과 PCR 증폭이 one-step으로 진행될 수 있는 Suprime script RT-PCR Premix (GeNet Bio, Korea)을 사용하여 하기 표 5와 같은 PCR 조성으로 50℃에서 30분 후 95℃에서 5분 동안 역전사, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 35회 PCR 사이클을 반복 수행하고, C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)을 사용하였다.
증폭 산물은 0.5 X TAE 완충액 50 ml, 아가로스 LE 0.75 g이 첨가된 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동을 하여 밴드 형성 여부를 확인하였다.
| 반응 조성물 | 부피 |
| 주형(Template) RNA | 1 μl (10 pg ~ 1 μg) |
| 정방향 프라이머 (F) | 1 μl (10 pmol) |
| 역방향 프라이머 (R) | 1 μl (10 pmol) |
| 2X reaction buffer | 10 μl |
| DEPC water | 전체 부피를 20 μl에 맞춤 |
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 일반 RT-PCR에서는 CABYV가 10-3 (100 pg)까지, CCYV가 10-4 (10 pg)까지 검출되었다. 따라서 본 발명에 따른 황화바이러스 동시 검출을 위한 이중 실시간 RT-PCT은 일반 RT-PCR에 비해 검출 한계가 CABYV는 100배, CCYV는 10배 더 높은 것으로 확인되었다.
실험예 3. 황화바이러스 동시 검출을 위한 실시간 RT-PCR을 이용한 박과작물 시료 검정
CABYV 및/또는 CCYV가 감염된 것으로 의심되는 멜론, 오이 및 참외를 대상으로 실험예 1과 동일한 방법으로 황화바이러스 감염 여부를 확인하였다.
여기서 사용된 시료로는 멜론, 오이 및 참외의 잎을 사용하였다.
그 결과, 도 4 및 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, CABYV는 멜론과 오이에서, CCYV는 멜론, 오이 및 참외에서 검출된 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 황화바이러스 동시 검출용 실시간 RT-PCR은 CABYV 및 CCYV에 특이적으로 반응하여 검출 가능한 것을 확인하였다.
| 시료 | 바이러스 검정 | Cq | |||
| CABYV | CCYV | FAM | SFC-V | ||
| 1 | 멜론 | 양성(+) | 양성(+) | 22.85 | 24.50 |
| 2 | 멜론 | 음성(-) | 양성(+) | N/A | 25.88 |
| 3 | 멜론 | 양성(+) | 음성(-) | 18.61 | N/A |
| 4 | 오이 | 양성(+) | 양성(+) | 18.58 | 22.18 |
| 5 | 오이 | 양성(+) | 음성(-) | 23.49 | N/A |
| 6 | 참외 | 음성(-) | 양성(+) | N/A | 21.45 |
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Republic of Korea(Management: Rural Development Administration)
<120> Primer set for simultaneously detection of cucurbit yellows
viruses, and composition, kit and method for detection of
cucurbit yellows viruses using the same
<130> RDABPN210046
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CABYV-F
<400> 1
taatcgagga ggcagagcta gag 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CABYV-R
<400> 2
cgtgagattg tcctttgaaa atacg 25
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CABYV-probe
<400> 3
ccaggcgaaa cat 13
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCYV-F
<400> 4
acggtgggag agttagagtg aca 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCYV-R
<400> 5
tcgtctgatt ggtgtggata actt 24
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCYV-probe
<400> 6
cgcagaggat gttcga 16
Claims (11)
- 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellows virus) 검출용인 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 박과퇴록황화바이러스(cucurbit chlorotic yellows virus) 검출용인 것인, 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서,
상기 프라이머 세트는 실시간 RT-PCR 또는 이중 실시간 RT-PCR에 사용하기 위한 것인, 프라이머 세트. - 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트
를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 조성물. - 청구항 5에 있어서,
상기 박과작물 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스에서 선택되는 것인, 조성물. - 청구항 5에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 3 및 6의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하는 것인, 조성물. - 청구항 5 내지 7중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 키트.
- 청구항 8에 있어서,
상기 박과작물 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스에서 선택되는 것인, 키트. - a) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 핵산을 주형으로 하여 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 프라이머 세트, 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항의 조성물, 또는 청구항 8 또는 9의 키트로 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계
를 포함하는 박과작물 황화바이러스 동시 검출 방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 박과작물 황화바이러스는 박과진딧물매개황화바이러스 및 박과퇴록황화바이러스에서 선택되는 것인, 방법.
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-
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